抑郁合并失眠對(duì)大鼠HPA軸及下丘腦中氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

李春艷，王宇紅,王 華， 趙洪慶，李姿蓉，楊 蕙，黃會(huì)珍

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.科技創(chuàng)新中心，2.第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神疾病，慢性應(yīng)激可能是其病因，研究表明大部分抑郁癥患者伴有睡眠障礙[1]。睡眠障礙在慢性應(yīng)激下導(dǎo)致失眠，同時(shí)，應(yīng)激狀態(tài)下的機(jī)體免疫功能下降，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷。因此，失眠又是抑郁癥的危險(xiǎn)因素。此外，應(yīng)激激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)，HPA軸亢進(jìn)導(dǎo)致谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid，GABA)比例失調(diào)。HPA軸同時(shí)受多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)，包括5-羥色胺(hydroxytryptamine,5-HT)能、去甲腎上腺素(Noradrenaline,NE)能和多巴胺(dopamine,DA)能等，HPA軸失調(diào)被認(rèn)為與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另一方面，失眠與HPA軸的功能障礙密切相關(guān)，HPA軸的激活使促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)和皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)的濃度增加，產(chǎn)生覺(jué)醒效應(yīng)。下丘腦同時(shí)作為HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)的首要環(huán)節(jié)及內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)免疫系統(tǒng)的中心，當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致HPA軸亢進(jìn)，啟動(dòng)激素級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起系列分子的變化及腦部損傷，可能是抑郁失眠的發(fā)病機(jī)制。綜上，本實(shí)驗(yàn)采用慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)聯(lián)合睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)建立大鼠抑郁癥失眠模型，探索大鼠抑郁失眠的發(fā)病機(jī)制，為抑郁癥失眠的機(jī)理闡明提供更多的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠84只，體質(zhì)量(180-200) g(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，質(zhì)量合格證號(hào)：1107271911001684，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。實(shí)驗(yàn)單位為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，設(shè)施使用許可證編號(hào)：SYXK(湘)2015-0003。

1.2 試劑CORT,ACTH,CRH酶聯(lián)免疫試劑盒(均為20191205，JINGTIAN)；去甲腎上腺素，多巴胺鹽酸鹽，5-羥色胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品(B24713，B25300，B21833，上海源葉生物科技有限公司)；TRIzol(152105，美國(guó)ambion公司)；cDNA Synthesis Kit(00760266，Thermo Scientific)；SYBR qPCR SuperMix Plus(0516511，Novoprotein)；GABAAR，GABABR，GAD67，GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體，羊抗兔二抗(bs-4112R，bs-1293R，bs-1302R，bs-2188R，bs-0295G，北京bioss公司)；兔抗CREB多克隆抗體(ab32515，英國(guó)Abcam公司)；兔抗CaMKⅡ多克隆抗體(3362S，cell signaling technology)；ECL試劑盒(Multi Sciences)。

1.3 主要儀器MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心自制睡眠剝奪臺(tái)，超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(英國(guó)Bio Drop公司)，ECO型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)illumina公司)，1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Aglient公司)，ECD電化學(xué)檢測(cè)器(荷蘭Antec公司)，Chemi Doc XRS+Imager型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.4 分組和造模分組,分為7組：慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激組(CUMS)、72 h睡眠剝奪組(72 h SD)、慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激+72 h睡眠剝奪組(CUMS+72 h SD)、21 d睡眠剝奪組(21 d SD)、慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激+21 d睡眠剝奪組(CUMS+21 d SD)、空白對(duì)照組和環(huán)境對(duì)照組。

造模,適應(yīng)性5 d后，d 6開(kāi)始為造模d 1，造模前14 dCUMS、CUMS+72 h SD、CUMS+21 d SD 3組均進(jìn)行CUMS造模。造模d 15-35開(kāi)始SD造模，其中21 d SD組每天15:00至隔天9:00進(jìn)行18 h SD[2]，連續(xù)21 d；72 h SD組于造模最后3 d進(jìn)行連續(xù)72 h SD[3]；兩個(gè)復(fù)合模型組在進(jìn)行失眠造模期間均不間斷抑郁造模。分別于抑郁造模14 d后和復(fù)合造模結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。CUMS具體方法為：每只大鼠孤籠飼養(yǎng)和應(yīng)激造模，包括禁食、4 ℃冰水環(huán)境、傾籠、噪音、潮濕墊料、晝夜顛倒、足底電擊、禁水、夾尾。每天一種刺激，每種刺激3 d內(nèi)不重復(fù)。

1.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)開(kāi)野實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于敞箱中,適應(yīng)30 s后記錄大鼠在4 min內(nèi)的活動(dòng)情況。每當(dāng)其爬行過(guò)1格或上肢攀附在箱壁上1次,則加1分,最后以總分進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入水缸中適應(yīng)30 s后測(cè)試4 min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間。四肢均保持不動(dòng)或稍微運(yùn)動(dòng)，即記為游泳不動(dòng)時(shí)間，以此來(lái)評(píng)價(jià)每組大鼠的絕望狀態(tài)。

糖水偏好實(shí)驗(yàn)：禁食禁水24 h后進(jìn)行，計(jì)算1 h內(nèi)大鼠蔗糖水消耗量，根據(jù)每組大鼠的糖水平均消耗率來(lái)判斷其快感缺失程度。

1.6 酶聯(lián)免疫分析測(cè)定血清和下丘腦中HPA軸指標(biāo)和氨基酸類神經(jīng)遞含量使用大鼠CRH、ACTH、CORT、Glu和GABA的ELISA試劑盒(均為20191205，JINGTIAN)，分別測(cè)定血清中CRH、ACTH、CORT和下丘腦中Glu、GABA的含量。

1.7 HPLC-ECD法測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT含量對(duì)冷凍保存的下丘腦用0.01 mol·L-1HClO4溶液進(jìn)行前處理，勻漿后取上清備用。色譜條件：Quattro 4 C18色譜柱規(guī)格：柱長(zhǎng)150 mm，直徑為2.1 mm，填充顆粒為3 μm；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；樣量：20 μL；流動(dòng)相：?jiǎn)嗡姿岫溻c90 mmol·L-1、單水檸檬酸50 mmol·L-1、辛烷磺酸鈉1.7 mmol·L-1、EDTA50 μmol·L-1，4種物質(zhì)混合液 ∶甲醇=90 ∶10。將NE、DA、5-HT對(duì)照品配置成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 HE染色觀察下丘腦組織病理狀態(tài)將下丘腦組織進(jìn)行石蠟包埋，制成石蠟切片，然后脫蠟和水化。蘇木精染色,自來(lái)水清洗,置于鹽酸乙醇分化,并用純水沖洗。乙醇伊紅染色,純水沖洗。之后脫水,再分別放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明。將切片取出,在組織上滴加中性樹(shù)脂，蓋上蓋玻片，拍照。

1.9 Western blot檢測(cè)下丘腦中GABA相關(guān)蛋白表達(dá)提取下丘腦總蛋白，然后進(jìn)行電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1.5-2.0 h，常規(guī)清洗，分別加入1 ∶800稀釋的GABAAR、GABABR、GAD67抗體和1 ∶1 000稀釋的CaMKⅡ、CREB、GAPDH抗體4 ℃過(guò)夜；加入1 ∶2 000稀釋的二抗在室溫下孵育1 h，洗滌，滴加ECL發(fā)光液成像。

1.10 RT-qPCR法檢測(cè)下丘腦中GABA信號(hào)相關(guān)分子基因表達(dá)用TRIzol試劑提下丘腦組織的總RNA。測(cè)定RNA濃度和純度，然后按照Thermo試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。測(cè)定目的基因和內(nèi)參β-actin的PCR產(chǎn)物Cq值。完成實(shí)驗(yàn)后,采用2-ΔΔCq法分析數(shù)據(jù)。使用Primer Premier 6.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物具體信息見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

2 結(jié)果

2.1 大鼠日常行為觀察和體質(zhì)量結(jié)果日常行為：空白對(duì)照組大鼠在落水1-2次后便能較快找到小平臺(tái)，適應(yīng)新環(huán)境的能力較強(qiáng)；經(jīng)過(guò)CUMS造模的各組大鼠落水4-5次后才能站在小平臺(tái)上，且短暫停歇后會(huì)再次落水，適應(yīng)新環(huán)境能力較差，可知慢性應(yīng)激能夠削弱動(dòng)物的記憶認(rèn)知能力。

體質(zhì)量增長(zhǎng)率：與空白對(duì)照比較，各模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率下降(P<0.05)，尤以CUMS+21 d SD組下降明顯；與CUMS組比較，CUMS+72 h組和CUMS+21 d SD組大鼠在造模后期體質(zhì)量增長(zhǎng)率下降；在造模后期，與CUMS+72 h組相比，CUMS+21 d SD組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率是下降的(P<0.01),見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Body weight growth rate of

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1開(kāi)野實(shí)驗(yàn) CUMS 14 d后：與空白組對(duì)照組相比，CUMS造模兩周后，除單純失眠組，各模型組大鼠均表現(xiàn)出了自主活動(dòng)降低的趨勢(shì)(P<0.01)，說(shuō)明大鼠已出現(xiàn)抑郁樣情緒。

復(fù)合造模后：造模結(jié)束后，兩個(gè)復(fù)合模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)和糞便粒數(shù)與空白對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05)，復(fù)合造模大鼠比純抑郁大鼠表現(xiàn)出更低的自主活動(dòng),見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Results of open field experiment after 14 days of CUMS modeling and end of composite model

2.2.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) CUMS 14 d后：與空白對(duì)照組相比較，經(jīng)過(guò)CUMS造模的模型組大鼠不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.05)。

復(fù)合造模后：與空白組相比，各模型組動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間增加(P<0.05)；兩個(gè)復(fù)合模型組不動(dòng)時(shí)間變化雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CUMS+21 d SD組大鼠不動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明長(zhǎng)期慢性的應(yīng)激失眠造模更能增加大鼠的絕望程度；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組大鼠不動(dòng)時(shí)間有所增加,見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Results of forced swimming experiment after 14 days of CUMS modeling and end of composite

2.2.3糖水偏好實(shí)驗(yàn) CUMS 14 d后：與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)14 d的CUMS，各造模組的平均糖水消耗率下降(P<0.01)；表明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的應(yīng)激后，大鼠的快感有一定程度的缺失，表現(xiàn)出抑郁樣情緒。

復(fù)合造模后：造模結(jié)束后，與空白對(duì)照組相比，各模型組糖水消耗率均下降(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組大鼠糖水消耗率有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CUMS+72 h SD組相比，CUMS+21 d SD組大鼠的糖水消耗率下降(P<0.05),見(jiàn)Tab 4。

Tab 4 Experimental results of sugar water consumption in CUMS modeling for 14 days and composite

2.3 復(fù)合造模后戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠睡眠潛伏期增長(zhǎng)(P<0.05)，睡眠時(shí)長(zhǎng)縮短(P<0.01)；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組大鼠的睡眠潛伏較長(zhǎng)，睡眠時(shí)長(zhǎng)變短，CUMS+72 h SD組大鼠則差異無(wú)顯著性,見(jiàn)Tab 5。

Tab 5 Results of correction experiment at the end

2.4 ELISA測(cè)定HPA軸各指標(biāo)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量

2.4.1血清中HPA軸各指標(biāo)含量 與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠血清中各激素含量均升高(P<0.05)，CUMS+21 d SD組增加趨勢(shì)最為明顯；與CUMS組或CUMS+72 h SD組相比，CUMS+21 d SD組大鼠3個(gè)指標(biāo)含量均增加(P<0.05)，可推測(cè)長(zhǎng)期睡眠不足更易加重抑郁狀態(tài)下的HPA軸亢進(jìn),見(jiàn)Tab 6。

Tab 6 Changes in contents of CRH,ACTH,CORT in serum and hypothalamus of n=6; hypothalamus n=3)

2.4.2下丘腦中HPA軸各指標(biāo)含量 與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠下丘腦中CRH、ACTH、CORT含量升高(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+21 d SD組CRH含量均增加(P<0.01)，ACTH、CORT含量的增加雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但趨勢(shì)也較明顯；與CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組HPA軸各指標(biāo)含量均增加,見(jiàn)Tab 6。

2.4.3下丘腦中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量 與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠下丘腦Glu含量上升，GABA含量下降(P<0.05)，其中兩個(gè)復(fù)合模型組和21 d SD組的Glu/GABA失調(diào)(P<0.01)；與CUMS組或CUMS+72 h SD組相比，CUMS+21 d SD組大鼠Glu和GABA含量變化明顯(P<0.05)，二者比例失調(diào)(P<0.05),見(jiàn)Tab 7。

Tab 7 Changes of Glu and GABA content in hypothalamus

2.5 HPLC-ECD法測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量

下丘腦中NE、DA、5-HT含量，與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠下丘腦中3種單胺遞質(zhì)含量均下降(P<0.05)；與CUMS組或CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組3種單胺遞質(zhì)的含量均降低(P<0.05),見(jiàn)Tab 8。HPLC-ECD檢測(cè)3種單胺遞質(zhì)示例色譜圖,見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Example chromatograms of different samples detected by HPLC-ECD

Tab 8 Changes of monoamine transmitter contents in

2.6 HE染色觀察下丘腦組織病理狀態(tài)空白對(duì)照組大鼠下丘腦細(xì)胞大小均勻，排列有序，細(xì)胞無(wú)空泡樣現(xiàn)象；CUMS+72 h SD和CUMS+21 d SD組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，尤以后者更為明顯，細(xì)胞排列紊亂、間隙變大，胞體增大，空泡樣性狀明顯，細(xì)胞形態(tài)病變，出現(xiàn)神經(jīng)元丟失現(xiàn)象；對(duì)比72 h SD和21 d SD兩組細(xì)胞，后者的病變程度更深,見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 HE staining results of rat hypothalamus(×200)

2.7 Western blot檢測(cè)下丘腦中GABA相關(guān)蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠下丘腦中GAD67、GABAAR、GABABR、CaMKⅡ、CREB蛋白灰度值均下降(P<0.05)；與CUMS組比較，CUMS+21 d SD組各分子蛋白含量降低(P<0.01)，而CUMS+72 h SD組則只有GAD67和CaMKⅡ的變化差異有顯著性；與CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組大鼠下丘腦中GABA相關(guān)蛋白表達(dá)均降低(P<0.01或P<0.05),見(jiàn)Fig 4,5。

Fig 4 The gray value expression of GABA signal molecule protein in hypothalamus of

Fig 5 Expression of GABA signaling related molecules in hypothalamus of rats

2.8 RT-qPCR檢測(cè)下丘腦中GABA相關(guān)基因表達(dá)與空白對(duì)照組相比，各模型組大鼠下丘腦中GAD67、GABAAR、GABABR、CaMKⅡ、CREB基因表達(dá)均下降(P<0.05)；與CUMS組或CUMS+72 h SD組比較，CUMS+21 d SD組大鼠下丘腦中GABA相關(guān)分子基因表達(dá)量均下降(P<0.01),見(jiàn)Tab 9。

Tab 9 The gene expression of GABA signaling related molecules in hypothalamus of

3 討論

目前，抑郁癥中最常用的造模方法是慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激，失眠的造模方法主要有化學(xué)試劑刺激法和物理應(yīng)激法。化學(xué)試劑法易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)對(duì)操作人員技術(shù)要求高[4]。物理應(yīng)激法[5-6]包括強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法、足休克法、輕柔刺激法、慢性束縛法和水平臺(tái)法。對(duì)比研究，本實(shí)驗(yàn)選擇水平臺(tái)法，其共經(jīng)歷了單平臺(tái)、多平臺(tái)及改良多平臺(tái)3個(gè)階段，其中改良多平臺(tái)睡眠剝奪法(modified multiple platform method，MMPM)應(yīng)用更為普遍[7]。利用大鼠厭畏水的特性，在平臺(tái)的周圍注滿水，水面距平臺(tái)約1.0 cm。大鼠在平臺(tái)上可以自行進(jìn)食飲水，若其睡眠，則由于肌張力松弛而落入水中，需重新振作精神爬上平臺(tái)，如此反復(fù)達(dá)到選擇性剝奪快動(dòng)眼睡眠(rapid eye movement sleep，REMS)的效果。抑郁癥狀態(tài)下的睡眠質(zhì)量變差最顯著表現(xiàn)在REMS潛伏期縮短、密度增加，因此采用REMS剝奪更貼近人類患病特點(diǎn)。一般采用72 h的短期快速睡眠剝奪，或者每天剝奪10-18 h連續(xù)2-3周的長(zhǎng)期慢性睡眠剝奪[8-9]。結(jié)合本研究目的選擇對(duì)比觀察72 h快速睡眠剝奪，和每天造模18 h連續(xù)3周慢性睡眠剝奪這兩種方式，最終確定最佳造模方式。因可使動(dòng)物受到制動(dòng)、浸水等刺激，設(shè)置環(huán)境對(duì)照組來(lái)排除干擾。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)體質(zhì)量增長(zhǎng)率、攝食量、日常大鼠行為觀察發(fā)現(xiàn)，CUMS+21 d SD組大鼠的體重增長(zhǎng)率最低，攝食量減少程度最大。而通過(guò)糖水偏好、開(kāi)野實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳行為學(xué)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)各模型組大鼠快感顯著缺失、自主活動(dòng)下降及求生欲降低，其中以復(fù)合模型CUMS+21 d SD組明顯。表明長(zhǎng)時(shí)間失眠可使大鼠萎靡不振。此外，與空白組對(duì)比，戊巴比妥鈉實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CUMS組大鼠睡眠潛伏期增長(zhǎng)，睡眠時(shí)長(zhǎng)顯著縮短，表明抑郁癥本身具有誘發(fā)失眠的傾向。但復(fù)合模型較純抑郁組睡眠潛伏期更長(zhǎng)，睡眠時(shí)長(zhǎng)更短，同時(shí)慢性睡眠剝奪比快速睡眠剝奪效果更佳。通過(guò)環(huán)境對(duì)照組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境的制動(dòng)、浸水刺激對(duì)大鼠影響較小，基本可忽略。兩個(gè)復(fù)合模型組較貼切地復(fù)制了抑郁癥失眠的臨床表征，CUMS+21 d SD組各方面數(shù)據(jù)優(yōu)于CUMS+72 h SD組，更符合人類失眠發(fā)病緩慢、病程長(zhǎng)等特點(diǎn)。因此，抑郁失眠模型可通過(guò)慢性輕度應(yīng)激聯(lián)合21 d睡眠剝奪來(lái)復(fù)制。

實(shí)驗(yàn)使用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑郁癥失眠大鼠血清和下丘腦中CRH、ACTH和CORT含量上升，下丘腦中Glu/GABA比例上升，大腦興奮性毒性增加，GABA信號(hào)分子表達(dá)下降。而通過(guò)Western blot和RT-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了此想法，對(duì)于抑郁癥失眠大鼠，其下丘腦中GABA相關(guān)分子GABAAR、GABABR、GAD67、CaMKⅡ、CREB的蛋白及基因表達(dá)顯著下降，表明GABA相關(guān)分子表達(dá)被抑制，導(dǎo)致樹(shù)突障礙和神經(jīng)元存活率下降。HPLC-ECD發(fā)現(xiàn)下丘腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA和5-HT顯著減少。進(jìn)一步通過(guò)HE染色觀察下丘腦，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂、間隙變大，胞體增大，空泡樣性狀顯著，細(xì)胞形態(tài)病變，出現(xiàn)神經(jīng)元丟失現(xiàn)象，表明抑郁癥失眠大鼠下丘腦受損?？偠灾?，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)慢性應(yīng)激聯(lián)合睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠HPA軸亢進(jìn)，使CRH、ACTH和CORT表達(dá)上升，下丘腦中單胺遞質(zhì)及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變，下丘腦神經(jīng)元和突觸受損，這些改變可能是抑郁合并失眠的發(fā)病機(jī)制。

抑郁與失眠均涉及神經(jīng)內(nèi)分泌的變化，下丘腦作為HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)的首要環(huán)節(jié)和神經(jīng)內(nèi)分泌中心，啟動(dòng)激素分泌，發(fā)揮其對(duì)HPA軸的調(diào)控作用[10]。GABA通過(guò)抑制興奮性神經(jīng)元，阻斷Glu的興奮毒性，二者比例失調(diào)被認(rèn)為是抑郁癥和失眠的重要因素。Glu增多導(dǎo)致的興奮毒性可誘導(dǎo)抑郁樣行為，而臨床上抗失眠藥物多是模擬GABA作用，增強(qiáng)受體與GABA的親和力和GABA能神經(jīng)元的傳遞作用，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮等作用[11]。GABA能神經(jīng)元廣泛分布于下丘腦視交叉上核區(qū)域[12]，GAD67是其直接標(biāo)記物[13]，腦內(nèi)主要分布的是GABAA和GABAB受體。GABABR介導(dǎo)未成熟神經(jīng)元興奮，進(jìn)而激活CaMKII，磷酸化CREB結(jié)合位點(diǎn)，從而促進(jìn)樹(shù)突成熟與神經(jīng)元存活[14]。在應(yīng)激狀態(tài)下，HPA軸亢進(jìn)，ACTH和GC分泌過(guò)度，GC進(jìn)一步誘導(dǎo)Glu釋放和興奮性傳遞異常增強(qiáng)，導(dǎo)致Glu/GABA比例增大，GABA相關(guān)信號(hào)被抑制，引起神經(jīng)毒性，損傷下丘腦，反過(guò)來(lái)加重抑郁失眠的發(fā)生發(fā)展[15]。單胺遞質(zhì)假說(shuō)是抑郁癥發(fā)病機(jī)制中最為經(jīng)典的一種，同時(shí)與失眠的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)于睡眠-覺(jué)醒節(jié)律的調(diào)節(jié)具有重要意義，Menon等[16]使用微透析技術(shù)證明單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在不同時(shí)長(zhǎng)的睡眠剝奪期間發(fā)揮著重要作用，同時(shí)HPA軸失調(diào)可導(dǎo)致單胺遞質(zhì)的改變[17]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立抑郁失眠大鼠模型，研究其對(duì)HPA軸和下丘腦中氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑郁合并失眠大鼠中存在HPA軸功能障礙，GABA/Glu比例失調(diào)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少，同時(shí)結(jié)合他人研究，進(jìn)一步推測(cè)HPA軸失調(diào)導(dǎo)致氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變，可能是抑郁合并失眠的發(fā)病機(jī)制。另外，本實(shí)驗(yàn)因時(shí)間技術(shù)有限，未對(duì)抑郁癥失眠大鼠進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)，其造模期間腦電波的活動(dòng)特征能反應(yīng)出大鼠的睡眠狀態(tài)，這值得下一步深入探討。