和胃理氣方對肝郁型功能性消化不良大鼠Ghrelin表達(dá)的影響

張鑫 劉陽 姜巍 王垂杰 李玉鋒

摘要：目的 研究肝郁型功能性消化不良大鼠胃排空率以及胃和下丘腦組織Ghrelin 蛋白的表達(dá)變化，以探究和胃理氣方對功能性消化不良干預(yù)的可能機(jī)制。方法 選取40只健康Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，隨機(jī)分為空白組（10只）及模型組（30只）?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)，其余大鼠通過夾尾刺激法建立肝郁型FD大鼠模型，造模14 d。造模結(jié)束后按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、嗎丁啉組、和胃理氣方組（每組10只）。期間監(jiān)測大鼠進(jìn)食以及毛發(fā)、行為等一般狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測量各組大鼠胃排空率，并通過Western blot法測定胃組織以及下丘腦組織Ghrelin蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組胃排空率明顯低于和胃理氣方組、嗎丁啉組（P<0.05）;與模型組相比，和胃理氣方組和嗎丁啉組的胃及下丘腦Ghrelin蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。結(jié)論 和胃理氣方可能通過上調(diào)Ghrelin蛋白表達(dá)來有效干預(yù)功能性消化不良。

關(guān)鍵詞：功能性消化不良;腦腸互動(dòng);胃;下丘腦;Ghrelin

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）04-0063-04

Effect of Hewei Liqi Decoction on Ghrelin Expression in Rats withLiver-Stagnation Type of Functional Dyspepsia

ZHANG Xin1， LIU Yang1， JIANG Wei2， WANG Chui-jie2， LI Yu-feng2

（1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China;2. The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China）

【Abstract】Objective： To study the gastric emptying rate and the expression changes of Ghrelin protein in stomach and hypothalamus in rats with liver-stagnation functional dyspepsia in order to explore the possible mechanism of Hewei Liqi decoction on functional dyspepsia. Methods： 40 healthy Wistar rats were selected， half male and half male， and weighed （200±20） g. They were randomly divided into a blank group （10） and a model group （30）. The blank group was bred routinely and the rest of the rats were used to create a liver depression type FD rat model by the tail-clamping method， and the model was established for 14 days. After modeling， the rats were divided into model group， domperidone group and Hewei Liqi Decoction group （10 each group） according to the random number table. During this period， the general conditions of the rats' food intake， hair， behavior， etc. were monitored. After the experiment， the gastric emptying rate of rats in each group was measured and the expression of Ghrelin protein in gastric tissue and hypothalamic tissue was determined by Western blot. Results： The gastric emptying rate of the model group was significantly lower than that of the Hewei Liqi Decoction group and the domperidone group（P<0.05）. Compared with that of the model group， the gastric and hypothalamic Ghrelin protein expression in the Hewei Liqi Decotion group and the domperidone group increased （P<0.05）. Conclusion： Hewei Liqi Decoction may effectively interfere with functional dyspepsia by up-regulating the expression of Ghrelin protein.

【Key words】Functional dyspepsia;Brain-intestine interaction;Stomach;Hypothalamus;Ghrelin

功能性消化不良（functional gastriointestinal disease，F(xiàn)D）是全球范圍內(nèi)常見的功能性胃腸病之一，全球各國的消化不良患病率相差較大，總患病率約為11.5%～15.5%[1]。目前認(rèn)為它是一種生物-心理-社會(huì)病癥，其病因和發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，多考慮與遺傳易感性、胃腸運(yùn)動(dòng)障礙、內(nèi)臟敏感性增高、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)、黏膜免疫和炎癥反應(yīng)、腦腸軸異常及精神-心理社會(huì)因素等有關(guān)[2]。近年來隨著對神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說的深入研究，越來越多的學(xué)者認(rèn)為腦腸軸在FD的發(fā)病中起著重要的作用[3]。由精神心理因素導(dǎo)致的FD患者除了有上腹部不適，早飽等胃腸道癥狀以外，還伴隨著不同程度的焦慮緊張，而腦腸肽在此過程中有至關(guān)重要的作用。Ghrelin，又稱促饑餓素或促生長素，是一種由28個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性腦腸肽，是生長激素促分泌受體（GSHR）的天然內(nèi)源性配體。主要由胃黏膜下層的 X/A 樣細(xì)胞分泌。Ghrelin在乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下，變成有功能活性的?；疓hrelin，酰基化Ghrelin可通過血液及迷走神經(jīng)，透過血腦屏障傳遞至下丘腦，與其受體GHSR-1a在弓狀核結(jié)合，激活下丘腦神經(jīng)肽Y（NPY）和刺鼠相關(guān)蛋白（AgRP）神經(jīng)元，從而促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，增加攝食行為。功能性消化不良的中醫(yī)病名對應(yīng)“胃痛”、“胃痞”，其中肝郁型的發(fā)病過程與腦腸互動(dòng)相對應(yīng)[4]，肝失疏泄，情志不暢，憂思傷脾，導(dǎo)致脾運(yùn)化不利，胃失和降而痞滿。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測和胃理氣方對FD大鼠模型的胃排空率及胃和下丘腦組織中Ghrelin的表達(dá)結(jié)果，探討其對FD治療作用機(jī)制，為以后臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取40只健康Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200± 20）g，隨機(jī)分為空白組（10只）及模型組（30只）。

1.2 藥物 和胃理氣方：柴胡 15 g，黨參 20 g，枳實(shí) 12 g，木 香 6 g，厚樸 12 g，陳皮 12 g，豆蔻 9 g，甘草 12 g。濃縮至每毫升相當(dāng)于生藥1 g;嗎丁啉：以蒸餾水配制成 0.25 mg/mL的混懸液備用;生理鹽水。

1.3 主要試劑 RIPA裂解液（強(qiáng)）：碧云天（貨號P0013B）;5×蛋白電泳上樣緩沖液：鼎國（貨號WB-0091）;Bradford蛋白濃度測定試劑盒：碧云天（貨號P0006）;蛋白預(yù)染marker：Bio-rad（貨號161-0363）;SDS-PAGE凝膠配置試劑盒：碧云天（貨號P0012A）;PVDF膜：Bio-rad（貨號162-0177）;ECL顯色液：Bio-rad（貨號170-5060）;Ghrelin抗體：proteintech（貨號13309-1-AP）;二抗（鼠）：CST（貨號7076s）;二抗（兔）：CST（貨號7074s）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及分組 空白組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組參照文獻(xiàn)采用郭氏夾尾激怒法制備FD肝胃不和模型。每日2次，連續(xù)刺激14 d。每天夾尾時(shí)間固定[5]。造模結(jié)束后按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、嗎丁啉組、和胃理氣方組（每組10只）。

1.4.2 給藥方法 造模結(jié)束日起開始給藥。按藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算給藥劑量，和胃理氣方組給予和胃理氣方40 g/kg/d（即4mL/100 g），嗎丁啉組給予已配制的嗎丁啉懸濁液0.01 g/kg/d（即0.001/100 g），空白對照組及模型組以等體積生理鹽水灌胃。每日給藥2次，連續(xù)14 d。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠的進(jìn)食進(jìn)水量，毛發(fā)，行為等變化。

1.5.2 檢測大鼠胃排空率 各組動(dòng)物用藥結(jié)束時(shí)，禁食1 d，第2 d以10%酚紅溶液灌胃，20 min后處死，剖腹、結(jié)扎賁門和幽門。取胃，沿胃大彎側(cè)切開，以蒸餾水沖洗胃內(nèi)容物，定容為6mL，加入0.15 mol/L的Ba（OH）2溶液2 mL攪拌混勻，靜置10 min，再加入5%ZnSO4溶液2 mL振蕩5 min，以3000 r/min離心10 min。吸取上清液4 mL，再加10%NaOH溶液0.5 mL混合，用分光光度計(jì)在560 nm波長下測定吸光度值（試驗(yàn)組A560），再測0.4%酚紅溶液1 mL+1 mL蒸餾水+10%NaOH溶液0.5 mL的吸光度值（標(biāo)準(zhǔn)A560）。胃排空率計(jì)算公式：胃排空率（%）=（試驗(yàn)組A560-標(biāo)準(zhǔn)A560）/試驗(yàn)組A560*100%

1.5.3 Western blot法檢測胃竇及下丘腦組織中Ghrelin表達(dá) 末次給藥結(jié)束后24h禁食不禁水，斷頸處死后暴露腹部，于無菌環(huán)境下取胃竇部組織及下丘腦組織，于-80℃保存。通過蛋白印跡法（Western blot）測定Ghrelin蛋白表達(dá)。使用Quantity One軟件檢測蛋白條帶的灰度值，每個(gè)樣品的目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值進(jìn)行比較，然后再進(jìn)行組間比較，最后得出目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（x±s）表示。所有相關(guān)數(shù)據(jù)均作方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀況 空白組大鼠一般狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，活動(dòng)靈敏，進(jìn)食正常，大便呈球狀。模型組大鼠進(jìn)食明顯減少，毛發(fā)變暗、枯黃、不順，并有緊張、焦慮。和胃理氣方組和嗎丁啉組在治療過程中，毛發(fā)漸漸恢復(fù)光澤，進(jìn)食量和進(jìn)水量逐漸增加，體質(zhì)量均逐漸回升，和胃理氣方組大鼠效果更明顯。

2.2 和胃理氣方對大鼠胃排空功能的影響 模型組大鼠胃排空率顯著低于空白組;和胃理氣方組和嗎丁啉組大鼠胃排空率顯著高于模型組;和胃理氣方組大鼠胃排空率相比嗎丁啉組更高（P<0.05）。見圖1

2.3 各組大鼠胃黏膜組織Ghrelin蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織Ghrelin蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組比較，和胃理氣方組、嗎丁啉組大鼠胃黏膜組織Ghrelin蛋白表達(dá)水平顯著升高。與嗎丁啉組比較，和胃理氣方組無明顯差異（P>0.05），見表1。

2.4 各組大鼠下丘腦組織Ghrelin蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠下丘腦中 Ghrelin 蛋白表達(dá)明顯低于正常組，和胃理氣方組和嗎丁啉組均可不程度地升高FD大鼠下丘腦中Ghrelin的含量，和胃理氣方組稍高于嗎丁啉組，見表1。

3 討論

現(xiàn)在精神心理因素導(dǎo)致的FD已經(jīng)引起廣泛重視，而腦腸肽在此過程中具有重要作用。有大量研究表明Ghrelin具有促進(jìn)食欲的作用。毛蘭芳等[6]研究發(fā)現(xiàn)腦腸肽水平變化是引起胃腸動(dòng)力障礙的最主要因素之一。陳蘇寧等[7]研究證實(shí) FD患者可能存在Ghrelin分泌異常，促胃動(dòng)力藥可能通過改變Ghrelin水平來促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。林亞平等[8]研究表示電針針刺“足三里”促進(jìn)糖尿病胃輕癱大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制可能與上調(diào)ghrelin的表達(dá)有關(guān)，說明外治法也可以使體內(nèi)ghrelin含量變化。同時(shí)也有研究表示抑郁模型大鼠體內(nèi)ghrelin 水平的異常升高，可能是對應(yīng)激的一種反應(yīng)，或許與 ghrelin 調(diào)控HPA軸相關(guān)[9]。薛香莉等[10]研究表示，ghrelin與GHSR結(jié)合可以產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)，注射適宜劑量Ghrelin可產(chǎn)生抗焦慮行為。而Kazemi等[11]研究表明發(fā)現(xiàn)隨著進(jìn)食的時(shí)間變化，體內(nèi)Ghrelin的含量也發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化，而Ghrelin與疾病狀態(tài)之間的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)取決于不同的測定方法以及是否排除了體內(nèi)基礎(chǔ)Ghrelin含量。另有國外學(xué)者研究表明，Ghrelin還能降低血清中內(nèi)源性配體高遷移率族蛋白 1（HMGB1）水平并且改善腸黏膜屏障功能，通過刺激迷走神經(jīng)減少腸道缺血-再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)參照郭氏夾尾激怒法進(jìn)行造模，在造模第四天大鼠進(jìn)食明顯減少，毛發(fā)變暗、枯黃，并有緊張、焦慮，提示造模成功。在給予和胃理氣方和嗎丁啉治療后對比發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠存在胃動(dòng)力障礙和焦慮，和胃理氣方組及嗎丁啉藥組能夠加快FD大鼠的胃排空，提高胃竇組織及下丘腦組織Ghrelin的表達(dá)。本研究進(jìn)一步證明Ghrelin的水平在FD 的發(fā)病中起重要作用。進(jìn)一步推測和胃理氣方對FD的治療作用是通過增強(qiáng)胃動(dòng)力、改善腦腸肽Ghrelin的正常分泌而實(shí)現(xiàn)的。然而影響Ghrelin表達(dá)的因素很多，包括饑餓、應(yīng)激、血糖變化及機(jī)體其他激素的分泌等。本研究僅從大鼠胃排空功能和Ghrelin蛋白在胃竇及下丘腦表達(dá)水平探討和胃理氣方對FD的治療機(jī)制，而是否有其他機(jī)制來改善肝郁型FD大鼠的癥狀還需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

《景岳全書·痞滿》記載：“痞者，痞塞不開之謂;滿者，脹滿不行之謂。”指出“怒氣暴傷，肝氣未平而痞”。意為情志失調(diào)，氣機(jī)郁滯，肝失疏泄，脾胃升降失調(diào)而為痞滿。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)FD肝郁型發(fā)病過程中腦腸互動(dòng)為重要環(huán)節(jié)[4]。治療當(dāng)以疏肝理氣和胃。和胃理氣方中柴胡用量大取其疏肝解郁之用，現(xiàn)代研究表示，柴胡有促進(jìn)小腸推進(jìn)的功能[12]。

黨參補(bǔ)中益氣，健脾生津，與柴胡配伍共為君藥;枳實(shí)厚樸為行氣消脹常用的對藥，現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)厚樸中的酚類及枳實(shí)中的黃酮類物質(zhì)都能不同程度促進(jìn)胃排空。劉元素稱木香散滯氣，調(diào)諸氣，和胃氣?，F(xiàn)代研究表明木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯可加速胃排空和增強(qiáng)胃動(dòng)素的釋放[13]。豆蔻化濕行氣，溫中止嘔，右旋龍腦和右旋樟腦為其主要揮發(fā)油成分，可促進(jìn)胃液分泌，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)。陳皮理氣燥濕，健脾和胃，為脾胃之圣藥;此五味藥共為臣藥。甘草益氣健脾，緩急，調(diào)和諸藥，緩諸藥之峻猛，健脾胃之氣，為佐使藥。八味藥共同達(dá)到疏肝理氣，健脾除滿之功效。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過檢測大鼠腦腸肽Ghrelin在下丘腦及胃組織的表達(dá)以及胃排空功能探討了和胃理氣方治療肝郁型FD的機(jī)制，可以合理推測和胃理氣方可能通過上調(diào)體內(nèi)Ghrelin蛋白的表達(dá)，來調(diào)節(jié)肝郁型FD大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)障礙及焦慮狀態(tài)，從而發(fā)揮治療FD的作用，為中醫(yī)藥治療FD提供有效依據(jù)。

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（收稿日期：2020-11-09）