孫 雪 梁建慶,2* 何建成 馬利芳

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，全世界現(xiàn)有約580萬(wàn)PD患者，中國(guó)患病人數(shù)約為260萬(wàn)，居世界第一位[1]。PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性缺失，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA含量減少到80%以上，患者出現(xiàn)臨床癥狀[2]。明確DA能神經(jīng)元損傷的機(jī)制，對(duì)PD的防治具有重要意義。筆者利用Illumina HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)技術(shù)，獲得正常組、模型組、敦煌顫震方組大鼠右側(cè)黑質(zhì)及紋狀體的轉(zhuǎn)錄組信息，對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，旨在為深入探究DA能神經(jīng)元的存活方式以及對(duì)敦煌顫震方的藥理作用等分子應(yīng)答機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～200g，鼠齡38～40周，18只，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)碼：SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)期間保持自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(24±1)℃，濕度為(55±5)%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑和儀器 6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA, 批號(hào)：MKBP0832V)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO，批號(hào)：SLBF6369V)、抗壞血酸(批號(hào)：063K1082)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。戊巴比妥鈉(批號(hào)：WS20130212)：上海中西藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；慶大霉素(批號(hào): 20230675)：上海第一制藥廠產(chǎn)品，0.3 g/支。

大鼠腦立體定位儀：RWD-68003型，深圳瑞沃德生命科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)：Multifuge IS-R，德國(guó)THERMO公司；超聲破碎儀：XL 2000，美國(guó)MISONIX公司；微量進(jìn)樣器：5 μL，上海第三分析儀器廠；漩渦混勻器：XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；分析天平：910324，Sartorius anglytic；秒表：926266，上海秒表廠。

1.3 藥物制備 敦煌顫震方組成：山茱萸20 g，牛膝20 g，黃芪20 g，桂枝12 g，桃仁12 g，枳殼10 g，茯苓10 g，檳榔10 g，白蒺藜10 g。按既定工藝煎煮成湯藥，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥實(shí)驗(yàn)室提供。敦煌顫震方組的給藥劑量按人體每日用量換算成大鼠灌胃劑量，溶解于0.9%氯化鈉溶液，配制成相應(yīng)灌胃濃度[3]。

1.4 模型制備、分組及給藥 采用Ungerstedt等[4]建立并經(jīng)過(guò)本課題組驗(yàn)證的二點(diǎn)法進(jìn)行模型構(gòu)建[5-8]。術(shù)前按常規(guī)進(jìn)行行為測(cè)試，確認(rèn)無(wú)異常旋轉(zhuǎn)行為后，用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨(商品名:新潔爾滅)常規(guī)消毒。無(wú)菌條件下，沿正中線切開(kāi)大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準(zhǔn)，根據(jù)包新民等[6]著大鼠腦立體定位圖譜，確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo):①前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中線右側(cè)2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開(kāi)顱骨，用5 μL微量進(jìn)樣器將6-OHDA(溶于含0.2%維生素C的生理鹽水中，即秤量藥品抗壞血酸0.001 g，溶于生理鹽水0.5 mL中)注入右側(cè)黑質(zhì)部(以1.0 mm/min速度緩慢進(jìn)針)，每孔3 μL，注射速度為1 μL/min，注射完畢后留針5 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7 d，待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開(kāi)始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均7次/min者為合格的PD模型。

模型制備成功后，采用分層隨機(jī)法將12只PD陰虛動(dòng)風(fēng)證模型大鼠分為2組：模型組，敦煌顫震方組(14 g/kg)，每組6只；另取6只大鼠不作造模處理設(shè)為正常組。敦煌顫震方組用0.9%氯化鈉溶液溶解，每天灌胃1次；正常組和模型組以等體積0.9%氯化鈉溶液(2 mL/只)灌胃，連續(xù)用藥6周。處死大鼠，取右側(cè)黑質(zhì)及紋狀體組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 樣品檢測(cè) Nanodrop檢測(cè)右側(cè)黑質(zhì)及紋狀體組織中RNA的純度(OD260/280)、濃度、核酸吸收峰；Agilent 2100檢測(cè)RNA的完整性，檢測(cè)指標(biāo)包括：RIN值、28S/18S、圖譜基線有無(wú)上抬、5S峰。

1.5.2 文庫(kù)構(gòu)建 樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第一條cDNA(complementary DNA)鏈，然后加入緩沖液、dNTPs(Dideoxynucleotide)、RNase H(Ribonuclease H)和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后通過(guò)PCR(Polymerase Chain Reaction)富集得到cDNA文庫(kù)。

1.5.3 文庫(kù)質(zhì)控 使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后才可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nM)，完成庫(kù)檢。

1.5.4 上機(jī)測(cè)序 庫(kù)檢合格后，不同文庫(kù)按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行pooling，用IlluminaHi Seq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.6 生物信息學(xué)分析 將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到Clean Data，與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)；根據(jù)基因在不同樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因KEGG注釋及通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 各組比對(duì)結(jié)果作圖 將各組大鼠比對(duì)到不同染色體上的Reads進(jìn)行位置分布統(tǒng)計(jì)，繪制Mapped Reads在所選參考基因組上的覆蓋深度分布圖，便于后續(xù)分析。如圖1所示。

圖1 Mapped Reads在參考基因組上的位置及覆蓋深度分布注：A.正常組(右側(cè)黑質(zhì))；B.正常組(右側(cè)紋狀體)；C.模型組(右側(cè)黑質(zhì))；D.模型組(右側(cè)紋狀體)；E.敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；F.敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)。橫坐標(biāo)為染色體位置；縱坐標(biāo)為覆蓋深度以2為底的對(duì)數(shù)值。藍(lán)色為正鏈，綠色為負(fù)鏈。

2.2 差異基因表達(dá)篩選火山圖 正常組和模型組(右側(cè)黑質(zhì)/右側(cè)紋狀體)之間有143/149個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中78/86個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，65/63個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；正常組和敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì)/右側(cè)紋狀體)之間有83/91個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中47/50個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，36/41個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；模型組和敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì)/右側(cè)紋狀體)之間有56/61個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中31/31個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，25/30個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。如圖2所示。

圖2 3組組間差異基因表達(dá)篩選火山圖注：A.正常組VS模型組(右側(cè)黑質(zhì))；B.正常組VS模型組(右側(cè)紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)。差異表達(dá)火山圖中的每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)基因，橫坐標(biāo)表示某一個(gè)基因在兩樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值；縱坐標(biāo)表示基因表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的負(fù)對(duì)數(shù)值。圖中綠色的點(diǎn)代表下調(diào)差異表達(dá)基因，紅色的點(diǎn)代表上調(diào)差異表達(dá)基因，黑色的點(diǎn)代表非差異表達(dá)基因。

2.3 差異基因表達(dá)篩選MA圖 通過(guò)MA圖可以直觀地查看兩組樣品之間差異基因表達(dá)水平的整體分布。具體結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。

圖3 3組組間差異基因表達(dá)篩選MA圖注：A.正常組VS模型組(右側(cè)黑質(zhì))；B.正常組VS模型組(右側(cè)紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)。差異表達(dá)基因MA圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因。橫坐標(biāo)為A值，縱坐標(biāo)為M值，用于衡量表達(dá)量差異的大小。圖中綠色的點(diǎn)代表下調(diào)差異表達(dá)基因，紅色的點(diǎn)代表上調(diào)差異表達(dá)基因，黑色的點(diǎn)代表非差異表達(dá)基因。

表1 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

2.4 差異表達(dá)基因KEGG注釋 對(duì)差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類，分類結(jié)果如圖4所示。

圖4 3組組間差異表達(dá)基因KEGG注釋注：A.正常組VS模型組(右側(cè)黑質(zhì))；B.正常組VS模型組(右側(cè)紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)?？v坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標(biāo)為注釋到該通路下的基因個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的基因總數(shù)的比例。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析 通過(guò)KEGG富集分析得到：PI3K-Akt Signaling pathway(PI3K-Akt信號(hào)通路)、MAPK Signaling pathway(MAPK信號(hào)通路)、cAMP signaling pathway(cAMP信號(hào)通路) 、TNF signaling pathway(腫瘤壞死因子信號(hào)通路)、cGMP-PKG signaling pathway(cGMP-PKG信號(hào)通路)等通路, 這些均與PD相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)Valine, leucine and isoleucine degradation(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解)、Protein digestion and absorption(蛋白質(zhì)消化吸收)、Vitamin B6 metabolism(維生素B6代謝)等途徑的差異顯著,說(shuō)明這些代謝途徑極有可能與DA能神經(jīng)元分化相關(guān)。

圖5 3組組間差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析注：A.正常組VS模型組(右側(cè)黑質(zhì))；B.正常組VS模型組(右側(cè)紋狀體)； C.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；D.正常組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)；E.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)黑質(zhì))；F.模型組VS敦煌顫震方組(右側(cè)紋狀體)。圖中每一個(gè)圓表示一個(gè)KEGG通路，縱坐標(biāo)表示通路名稱。

3 討論

課題組以中西醫(yī)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為PD病在筋脈，與肝、脾、腎等臟關(guān)系密切?；静C(jī)為肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，筋脈失養(yǎng)。《素問(wèn)·痿論》曰：“肝主身之筋膜?！薄端貑?wèn)·六節(jié)臟象論》云：“肝者……其充在筋?！薄端貑?wèn)·經(jīng)脈別論》道：“食氣入胃，散精于肝，淫氣于筋?！薄端貑?wèn)·上古天真論》認(rèn)為：“七八，肝氣衰，筋不能動(dòng)?！备螢轱L(fēng)木之臟，其氣血虧虛，筋脈失養(yǎng)，則肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，筋脈不能任持自主，隨風(fēng)而動(dòng)，牽動(dòng)肢體及頭頸顫抖搖動(dòng)。《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》岐伯曰：“人年四十而陰氣自半也，起居衰矣?！备文I乙癸同源，年高體衰，腎精漸虧，或勞欲過(guò)度，致肝腎陰虛，腎虛髓減，腦髓不充，風(fēng)陽(yáng)上擾，上盛下虛則高搖。肝木橫克脾土，可致痰濕內(nèi)生。日久可導(dǎo)致絡(luò)脈瘀阻，出現(xiàn)肢體僵硬，動(dòng)作遲滯乏力之象。故本病的病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)證，本虛為肝腎虧損，臟腑功能失調(diào)；標(biāo)實(shí)為風(fēng)、痰、瘀互結(jié)，蘊(yùn)塞腦竅。內(nèi)風(fēng)是本病病理演變過(guò)程中始終貫穿的因素之一，是發(fā)病的主要原因。故課題組提出“滋補(bǔ)肝腎、活血祛瘀、化痰消積”諸法合用是其治療法則。據(jù)此立法組方，充分挖掘敦煌醫(yī)學(xué)的文獻(xiàn)資料，研制了治療PD的中藥復(fù)方—敦煌顫震方[9]。該方由山茱萸、牛膝、黃芪、桂枝、桃仁、枳殼、茯苓、檳榔、白蒺藜組成，方中山茱萸性微溫味酸，歸肝、腎經(jīng)，可補(bǔ)益肝腎、補(bǔ)精助陽(yáng)。《日華子本草》認(rèn)為山茱萸善“暖腰膝，助水臟。”牛膝性平味苦酸，歸肝、腎經(jīng)，可補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、活血祛瘀。共為君藥；黃芪性微溫味甘，歸脾、肺經(jīng)，可補(bǔ)氣生血、活血壯筋骨。桂枝性熱味辛甘，入心經(jīng)，根據(jù)中醫(yī) “赤入心”的理論, 可助心陽(yáng)、交心腎、暖腰膝、續(xù)筋骨、疏通血脈。二者配伍，可共奏活血祛瘀的作用。桃仁性平味苦，歸心、肝、肺、大腸經(jīng)，可活血祛瘀。共為臣藥；枳殼性微寒味辛苦，歸脾、胃、大腸經(jīng)，可破氣消積化痰。茯苓性平味甘淡，歸心、脾、腎經(jīng)，可利水滲濕、健脾祛痰。檳榔性溫味辛苦，可行氣消積利水、導(dǎo)滯化痰。共為佐藥；白蒺藜性平味辛苦，歸肝經(jīng)，可平肝疏肝、祛風(fēng)平顫，為使藥。上述諸藥合用，可滋補(bǔ)肝腎、活血祛瘀、化痰消積。

本研究構(gòu)建PD陰虛動(dòng)風(fēng)證大鼠模型[8]，給敦煌顫震方灌胃干預(yù)，并利用IlluminaHi Seq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)PD大鼠黑質(zhì)-紋狀體組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，按照差異基因表達(dá)變化FDR≤0.01、log2(Fold Change)≥|1|的原則，正常組和模型組(右側(cè)黑質(zhì)/右側(cè)紋狀體)之間共篩選出143/149個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中78/86個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，65/63個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。敦煌顫震方組明顯抑制了差異基因的表達(dá)富集程度。根據(jù)報(bào)道，PI3K-Akt信號(hào)通路在PD模型小鼠中被激活，抑制體內(nèi)細(xì)胞自噬、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。MAPK信號(hào)通路激活與氧化應(yīng)激引起的PD細(xì)胞凋亡存在著密切聯(lián)系，若能抑制MAPK信號(hào)通路的激活則可能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11]。cAMP信號(hào)通路中cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)作為一個(gè)經(jīng)典的第二信使，參與機(jī)體的所有生理和病理活動(dòng)[12]。cAMP表達(dá)水平升高，可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、再生、分化，從而保護(hù)小鼠的認(rèn)知功能[13]。TNF信號(hào)通路在PD的炎癥病理過(guò)程中起著重要作用。在PD 患者腦脊液和黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)中，TNF-α表達(dá)量較健康對(duì)照組增高，提示TNF-α對(duì)DA 能神經(jīng)元造成了損害[14]。近年來(lái)，有關(guān)cGMP-PKG信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的知識(shí)不斷涌現(xiàn)，cGMP的作用機(jī)制可能涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、突觸可塑性和認(rèn)知功能[15]。經(jīng)過(guò)敦煌顫震方治療后，抑制PD模型大鼠上述信號(hào)通路的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞再生、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、突觸可塑性和認(rèn)知功能等，這可能是敦煌顫震方發(fā)揮抗PD作用的機(jī)制。還發(fā)現(xiàn)氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素B6等代謝途徑與DA能神經(jīng)元的存活有關(guān)。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，DA替代藥物左旋多巴-直是PD的臨床主導(dǎo)用藥，然而該藥長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起患者癥狀波動(dòng)和運(yùn)動(dòng)障礙[16]。本研究結(jié)果顯示，敦煌顫震方可望成為DA能神經(jīng)元保護(hù)劑，可再生與修復(fù)變性的DA能神經(jīng)元，值得進(jìn)一步研究。