根際微生物增強(qiáng)宿主植物耐鉻能力生理機(jī)制研究進(jìn)展

邢淑萍，陳保冬，郝志鵬，張莘,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

近年來(lái)，重金屬鉻(chromium , Cr)在地下水、土壤和沉積物中均有廣泛分布，其污染問(wèn)題倍受關(guān)注[1]。環(huán)境中的Cr除了來(lái)自地殼巖石風(fēng)化，主要來(lái)源于冶金、電鍍、制染、制革、使用殺蟲(chóng)劑和化肥等人為化工活動(dòng)[2-3]。Cr有很豐富的價(jià)態(tài)(-2～+6)，但其中最穩(wěn)定和常見(jiàn)的形式是三價(jià)鉻Cr(Ⅲ)和六價(jià)鉻Cr(Ⅵ)[4-5]。Cr(Ⅲ)的移動(dòng)性低，相較于Cr(Ⅵ)，其生物可利用性和毒性也更低[6]，在低濃度時(shí)，還可以作為葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor, GTF)的重要成分有益于動(dòng)物和人體健康[7]；而Cr(Ⅵ)無(wú)論是在土壤還是細(xì)胞膜表面都更易滲透，具有致突變性和致癌性，被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US EPA)劃為A級(jí)人類致癌物[8]。

除此之外，Cr還會(huì)對(duì)多種陸地植物產(chǎn)生危害[9]，比如，隨其濃度升高，會(huì)抑制植物體內(nèi)光合色素[10]、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC)[11]和吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA)[12]等物質(zhì)的合成；引發(fā)氧化脅迫[13]，增強(qiáng)依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosohate, NADPH)的超氧化物合成[14]；還會(huì)降低碳同化的速率[15-16]；影響營(yíng)養(yǎng)元素如氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鎂(Mg)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、鋁(Al)和錳(Mn)以及硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]及水分的平衡[18]等，最終抑制種子發(fā)芽和根的生長(zhǎng)，誘發(fā)植株的葉黃病等，甚至導(dǎo)致死亡[10,19-20]。Cr對(duì)水生植物也會(huì)產(chǎn)生相似的危害，比如抑制根、莖和葉等組織的生長(zhǎng)，降低植物體內(nèi)的葉綠素和蛋白質(zhì)水平，最終導(dǎo)致萎黃和根部脫落等；還會(huì)抑制浮游植物的細(xì)胞生長(zhǎng)，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)液泡化[20-25]。

不同植物對(duì)Cr的響應(yīng)有所不同，一些植物如白睡蓮(NymphaeaalbaL.)[19]、水稻(OryzasativaL.)和瓜爾豆(CyamopsistetragonolobaL.)[26]等對(duì)Cr比較敏感，小冠重(OcimumtenuiflorumL.)[10]、麻風(fēng)樹(shù)(JatrophacurcasL.)和假馬齒莧(BacopamonnieriL.)[27]等對(duì)Cr比較耐受[28]，而尼科菊(Dicomaniccolifera)和線蓬(Suterafodina)則對(duì)Cr展現(xiàn)出超強(qiáng)的富集能力，這些植物為了緩解Cr脅迫，發(fā)展出多樣的調(diào)控和防御機(jī)制，其中，除了自身的金屬抗性體系[9]，另外一部分則得益于植物根際微生物[29]。一些根際微生物可以分解重金屬?gòu)?fù)合物，通過(guò)生物吸附和生物沉淀等過(guò)程使之轉(zhuǎn)變成低毒或無(wú)毒的形式，降低其可移動(dòng)性與生物有效性，進(jìn)而提高植物的耐受性[30]。因此，筆者從植物與根際微生物相互作用的角度，重點(diǎn)綜述了4種根際微生物，即根際促生菌、叢枝菌根真菌、非麥角屬內(nèi)生真菌和外生菌根真菌，提高宿主植物Cr耐受的機(jī)制，這將為通過(guò)根際微生物來(lái)調(diào)節(jié)根際環(huán)境，促進(jìn)植物更好地適應(yīng)Cr污染環(huán)境提供借鑒。

1 根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)

接種PGPR能夠保護(hù)植物免受病原菌、營(yíng)養(yǎng)缺乏以及其他環(huán)境脅迫的危害[31-32]，是當(dāng)前比較熱門(mén)的一種緩解植物生物及非生物脅迫的高效且環(huán)境友好的方法[33-34]。已有研究總結(jié)了目前報(bào)道過(guò)的一些Cr耐受菌、Cr還原菌及其作為生物菌劑在Cr污染土壤中的具體應(yīng)用效果與作用機(jī)制。研究表明[35-36]，這些PGPR主要來(lái)自假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬和固氮菌屬。PGPR可以通過(guò)溶解礦物磷營(yíng)養(yǎng)，分泌鐵載體(siderophore)、吲哚乙酸和氫氰酸(HCN)等物質(zhì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，也可以釋放有機(jī)酸和生物表面活性劑等物質(zhì)降低土壤中Cr的生物有效性和毒性，以提高植物的耐受[37]。

1.1 促進(jìn)植物生長(zhǎng)

PGPR能夠分泌有機(jī)酸、生物吸附劑和鐵載體[38-39]，這些物質(zhì)會(huì)抑制金屬與土壤礦質(zhì)顆粒的結(jié)合，并以更強(qiáng)的親和性與金屬螯合后降低其生物有效性，減輕金屬對(duì)植物根系產(chǎn)生的危害。另外，鐵載體可以緩解金屬脅迫導(dǎo)致的缺鐵，減少植物根系自由基的形成，這有利于葉綠素的合成和植物對(duì)病原菌免疫力的提高[40]。PGPR還能分泌植物生長(zhǎng)素IAA，刺激細(xì)胞的分裂和延長(zhǎng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，通過(guò)“生長(zhǎng)稀釋”的效應(yīng)提高植物對(duì)Cr的耐受[41]，與此同時(shí)，ACC脫氨酶(ACC deaminase)的活性也被激發(fā)，通過(guò)降解乙烯合成的前體ACC，減少乙烯的生成，幫助植物形成更長(zhǎng)更密集的根系，提高植物對(duì)Cr的耐受[42]。

Gupta等[43]通過(guò)給向日葵接種克雷伯氏菌屬耐Cr促生菌Klebsiellasp.和腸桿菌屬耐Cr促生菌Enterobactersp.發(fā)現(xiàn)，菌群可以通過(guò)釋放IAA、鐵載體、HCN、氨氣(ammonia)和生物表面活性劑等物質(zhì)，以及溶解土壤中的部分P，提高植物體內(nèi)葉綠素和可溶性蛋白的含量，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)元素如N、P和Fe的吸收和富集，促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，同時(shí)增強(qiáng)了向日葵對(duì)Cr的耐受與富集。

不同的抗Cr促生菌(chromium resistance)或Cr還原促生菌(chromium reduction)發(fā)揮促生功能時(shí)的機(jī)制也各有不同。如假單胞菌屬抗Cr菌Pseudomonassp. VRK3可以分泌IAA和鐵載體，也具有解P能力[44]；同樣的專性抗Cr緩病類芽孢桿菌PaenibacilluslentimorbusB-30488(r)就只能分泌IAA[45]；而兼具抗Cr和還原Cr性能的戴爾福特屬促生菌Delftiasp. JD2除了能分泌IAA，還有固氮的功能[46]；芽孢桿菌(Bacillusspp.)也兼具抗Cr和還原Cr的能力，它既能分泌IAA、鐵載體、HCN和氨氣，也有較強(qiáng)的解P能力[47]。

1.2 緩解氧化脅迫

為了緩解Cr導(dǎo)致的氧化脅迫，接種PGPR的植株會(huì)上調(diào)抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)和過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)的表達(dá)，但是不同菌種的產(chǎn)酶能力不同[43]。

有研究者給向日葵和番茄接種惡臭假單胞菌(Pseudomonasputidastrain CPSB21)之后發(fā)現(xiàn)，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，向日葵和番茄體內(nèi)的SOD和CAT活性較未接種均有顯著增加，POD活性也略有提高。另外，在接種處理的植物中檢測(cè)到更低的丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，說(shuō)明接種CPSB21有效減輕了氧化脅迫的危害[43]。

1.3 影響根際菌群

除了細(xì)菌自身，宿主植物也會(huì)分泌小分子氨基酸、有機(jī)酸、糖類、維生素和酶等，這些物質(zhì)會(huì)結(jié)合一部分的金屬以減少植物對(duì)金屬的吸收，同時(shí)，也使有益的菌群通過(guò)趨化性遷移定殖在植物根部[37]。

一些熒光假單胞菌既是根際促生菌，也是菌根輔助細(xì)菌(mycorrhiza helper bacteria)，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)，也提高了菌根在植物根系的定殖率和孢子的產(chǎn)量，促進(jìn)了根外菌絲的生長(zhǎng)。有研究表明，侵染有惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaUW4)的黃瓜被刺激合成ACC脫氨酶，減少了乙烯的生成量，同時(shí)提高了根際巨孢囊霉(GigasporaroseaBEG9)的定殖率，類似的現(xiàn)象在侵染放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的草莓中也被發(fā)現(xiàn)[48-49]。

除了相互影響，PGPR和叢枝菌根真菌(AMF)有時(shí)還表現(xiàn)出協(xié)同促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，這也是導(dǎo)致植物對(duì)金屬耐受性提高的一個(gè)原因[50]。另外，除了和AMF的協(xié)同促生作用，PGPR還表現(xiàn)出與水楊酸的協(xié)同作用。Islam等[51]同時(shí)接種PGPR和水楊酸(salicylic acid, SA)到Cr污染的玉米上，發(fā)現(xiàn)SA通過(guò)產(chǎn)生更多的分泌物，使具有金屬抗性的PGPR聚集到宿主根系，顯著促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。相較于單獨(dú)接種PGPR，葉片中α-淀粉酶和β-淀粉酶的水平提高了，即植物中碳水化合物儲(chǔ)備如淀粉以及可溶性糖類的有效性提高了，這不僅有利于植物生長(zhǎng)，也改善了植物的防御和調(diào)節(jié)能力。另外，植物和微生物的互作增強(qiáng)，還刺激了總酚和黃酮等用于重金屬解毒的次級(jí)代謝物的生成。但是，可能是由于接種了PGPR的植物受到的金屬脅迫和膜損傷程度相對(duì)較輕，聯(lián)合接種并沒(méi)有顯著提高組氨酸的富集。

2 叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)

AMF是環(huán)境中常見(jiàn)的一種土壤真菌，它可以和大多數(shù)的陸地植物以及部分水生植物[52]形成良好的共生關(guān)系。并且共生AMF的植物對(duì)干旱、鹽堿、重金屬污染和澇土等環(huán)境脅迫耐受性更高[53-55]。

有研究調(diào)查了Cr污染土壤中的菌根真菌，發(fā)現(xiàn)以無(wú)梗囊霉屬、球囊霉屬、巨孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬和類球囊霉屬等為主[56]。而影響這些AMF定殖率的因素也有很多，如植物種類、P營(yíng)養(yǎng)水平、土壤Cr污染水平和理化性質(zhì)[57]、AMF的種類等，定殖率又會(huì)進(jìn)一步影響AMF提高植物Cr耐受的效率。以土壤中的P水平為例，植物如果能夠獲取充足的P營(yíng)養(yǎng)，就會(huì)降低對(duì)AMF的依賴[58]，利用含P化合物直接結(jié)合重金屬，以此提高自身的耐性[59]?？偟膩?lái)說(shuō)，AMF共生可以通過(guò)直接和間接2種途徑改善植物對(duì)Cr的耐受，其中，直接途徑主要是通過(guò)AMF利用自身結(jié)構(gòu)吸收固持Cr或改變根際Cr的形態(tài)和生物有效性，間接途徑主要是通過(guò)改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況以及調(diào)控植物體內(nèi)對(duì)Cr的防御機(jī)制以提高植物對(duì)Cr的抗性[60]。

2.1 間接作用

2.1.1 改善植物營(yíng)養(yǎng)狀況

AMF沒(méi)有分解土壤中復(fù)雜有機(jī)質(zhì)的能力，需要依賴于宿主植物獲取生長(zhǎng)所需要的碳水化合物，如植物光合作用產(chǎn)生的蔗糖，會(huì)在AMF的胞內(nèi)菌絲(intraradical mycelium, IRM)附近被降解為單糖后被IRM吸收利用[61]。再如AMF(主要為異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)和巨孢囊霉(Gigasporarosea)等)缺乏脂肪酸合成酶I(FAS-I)的基因，需要依賴宿主將合成的部分脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至AMF[62-63]。作為交換，AMF可以活化土壤中的養(yǎng)分如N和P(尤其是無(wú)機(jī)磷)和一些大量元素，吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)給宿主植物，供植物生長(zhǎng)。同時(shí)，植物的生長(zhǎng)環(huán)境改善，光合作用增強(qiáng)，也會(huì)增加光合產(chǎn)物向根系的轉(zhuǎn)運(yùn)[62]。

土壤中的P大多結(jié)合在有機(jī)分子和礦質(zhì)表面，或者形成難溶磷酸鹽沉淀物，生物有效性較低[64]。因此，植物通過(guò)直接磷酸鹽吸收途徑(direct phosphate uptake pathway, DPU)獲取P的能力是有限的。而菌根磷酸鹽吸收途徑(mycorrhizal phosphate uptake pathway, MPU)可以大大提高植物吸收P的效率。AMF的菌絲不僅可以伸長(zhǎng)并獲取植物根系無(wú)法接觸到的無(wú)機(jī)磷，還可以和共生微生物協(xié)同水解有機(jī)磷[65]。有研究發(fā)現(xiàn)，在低P的環(huán)境中，植物會(huì)分泌更多的獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactores, SL)、赤霉酸(gibberellic acid, GA)和乙烯(ethlene)等以提高AMF的定殖率及促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)[66]。

Gil-Cardeza等[67]發(fā)現(xiàn)給蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)接種異形根孢囊霉(R.irregularisMULC 41833)后暴露在Cr(Ⅵ)中，4 h后就可以刺激P的吸收，而且根外菌絲暴露在Cr(Ⅵ)中的根系可以吸收更多的Cr。短期暴露就可以刺激根外菌絲對(duì)P的吸收，這說(shuō)明AMF促進(jìn)植物吸收P的過(guò)程是比較高效的。另外，在一些AMF中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了高親和或低親和的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子，但是目前它們參與P從真菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的機(jī)制仍然存在很多未知[68-70]。

綜上，較于未接種的植物，根部定殖有AMF[56]的植物在Cr污染土中可以生長(zhǎng)得更好。這是因?yàn)锳MF共生緩解了Cr脅迫導(dǎo)致的養(yǎng)分缺失，尤其是Cr競(jìng)爭(zhēng)硫酸鹽和磷酸鹽的吸收通道導(dǎo)致的P和S缺失。Wu等[71]發(fā)現(xiàn)接種了AMF的蒲公英在Cr(Ⅵ)污染的土壤中顯著增加了對(duì)P、S和N的吸收，而營(yíng)養(yǎng)狀況的改善大大增加了植物生物量，產(chǎn)生“生長(zhǎng)稀釋”的效果[72]，表現(xiàn)為接種AMF降低了植株體內(nèi)的Cr濃度，進(jìn)而提高了植物對(duì)Cr的耐受。

2.1.2 調(diào)節(jié)植物代謝過(guò)程

Cr會(huì)介導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起DNA氧化損傷[73]，研究者[58]發(fā)現(xiàn)有菌根共生的蒺藜苜蓿會(huì)上調(diào)高親和硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因MtSULTR1.1和MtSULTR1.2的表達(dá)，提高植物對(duì)S的吸收，增加體內(nèi)半胱氨酸(cysteine, Cys)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、植物螯合肽(phytochelatins, PCs)等S代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，提高谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)的活性。其中，GR既可以清除活性氧，也是其他植物螯合劑的合成前體，可以抑制HO·自由基的產(chǎn)生[74-75]，與其他S代謝產(chǎn)物一同螯合重金屬，達(dá)到解毒的效果。

除了通過(guò)調(diào)節(jié)S代謝解毒，接種AMF還可以提高植物體內(nèi)抗氧化酶的活性以及調(diào)節(jié)功能蛋白(如膜聯(lián)蛋白和親環(huán)素等)的表達(dá)以緩解重金屬危害。常見(jiàn)的抗氧化酶如CAT、POD、SOD和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase)，這些酶可以通過(guò)抑制自由基反應(yīng)減少氧化的危害[25]。沈亞琴等[76]研究銻(Sb)脅迫下AMF對(duì)玉米抗氧化性能的影響，發(fā)現(xiàn)接種AMF之后隨著土壤中Sb添加量的增加，植株體內(nèi)的MDA含量、CAT活性及POD活性均顯著上升。結(jié)合其他如Cd脅迫[77]下小麥接種AMF后體內(nèi)抗氧化酶水平的提高，Cu和Zn復(fù)合污染下接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)誘導(dǎo)白楊體內(nèi)與抗氧化防御有關(guān)的基因AL35的表達(dá)[78]，Cd脅迫下蒺藜苜蓿體內(nèi)膜聯(lián)蛋白及親環(huán)素的表達(dá)上調(diào)等，可以推測(cè)AMF共生可能也會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)植物代謝緩解Cr產(chǎn)生的氧化脅迫，但需要更多的實(shí)驗(yàn)加以證明。

2.2 直接作用

2.2.1 影響根際Cr有效性

AMF可以通過(guò)直接影響根際或植物根部的Cr以提高植物的耐受性。有研究表明，AMF能夠分泌小分子酸(low molecular weight acids, LMWA)或球囊霉素相關(guān)蛋白(glomalin related soil protein, GRSP)，不僅改變了根際微環(huán)境，也可以螯合重金屬，影響其形態(tài)與生物有效性，如提高根際酸溶態(tài)Cr的濃度[74]。

GRSP有螯合多種金屬如Cr、Cu、Pb和Zn等的能力。Gil-Cardeza等[79]研究了Cr污染土壤中GRSP的濃度及與Cr的螯合情況，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的Cr(Ⅲ)都與總球囊霉素相關(guān)蛋白(total glomalin related soil protein, T-GRSP)結(jié)合，并且這種結(jié)合力較靜電吸附更強(qiáng)。

2.2.2 影響Cr在根系的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)

除了吸收過(guò)程，AMF還會(huì)減少Cr從根系到地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[80]，有研究者發(fā)現(xiàn)菌根植物中的Cr主要分布在根的表皮，而非維管束，也就是說(shuō)AMF共生會(huì)減少Cr從側(cè)根向主根的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)[81]，Wu等[82]后續(xù)通過(guò)掃描透射X射線顯微成像(scanning transmission X-ray microscopy, STXM)觀察菌根中Cr的分布，進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。

另外，AMF會(huì)利用真菌結(jié)構(gòu)如菌絲或分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)等[82]改變氧化還原環(huán)境，將毒性更高的Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，使之以磷酸鹽或組氨酸結(jié)合態(tài)等更穩(wěn)定的形式[58]固持在根系和菌絲等真菌結(jié)構(gòu)中[82]。根外菌絲通過(guò)硫酸鹽通道[83]等主動(dòng)吸收Cr后，會(huì)將其中一部分轉(zhuǎn)運(yùn)到菌根根系，同時(shí)限制Cr從根系到地上部的移動(dòng)[84]，另一部分則被真菌結(jié)構(gòu)區(qū)隔或固定在根外菌絲體中[85]，從而緩解Cr毒性[81]，增強(qiáng)植物的Cr耐受。

2.2.3 參與Cr的吸收與固定

AMF可以在植物根際形成根外菌絲(extraradical mycelium, ERM)。根外菌絲細(xì)胞壁組分中的幾丁質(zhì)、纖維素等物質(zhì)可以結(jié)合金屬離子，其本身能夠延伸到根系接觸不到的區(qū)域，擁有相比根系更強(qiáng)的吸收營(yíng)養(yǎng)和重金屬的能力，并且不會(huì)將Cr轉(zhuǎn)運(yùn)到植物的地上部。

Wu等[85]利用雙重?zé)o菌培養(yǎng)體系添加甲醛或2,4-二硝基苯酚抑制菌絲的活性發(fā)現(xiàn)Cr在菌絲中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)量也減少了，這說(shuō)明菌絲對(duì)Cr的吸收可能是一個(gè)主動(dòng)吸收的過(guò)程，且利用的可能是硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道。另外，有部分Cr(Ⅵ)被還原成Cr(Ⅲ)，這說(shuō)明在菌絲中，除了有鉻酸鹽酶或羧基、硫醇等小分子參與的酶還原途徑，還存在非代謝的還原途徑。

菌絲內(nèi)的Cr(Ⅲ)主要有2種形態(tài)，其中，磷酸鹽結(jié)合態(tài)主要沉積在菌絲表面，這些磷酸鹽主要來(lái)自菌絲表面分泌的大量胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，比較穩(wěn)定，而一部分Cr會(huì)以組氨酸結(jié)合態(tài)的形式被轉(zhuǎn)運(yùn)固持到各個(gè)真菌結(jié)構(gòu)如叢枝、液泡以及內(nèi)生菌絲中[82]，從而緩解植物重金屬毒害。

3 非麥角屬內(nèi)生真菌(Non-clavicipitaceous endophytes, NC endophytes)

非麥角屬內(nèi)生真菌主要包括子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和毛霉亞門(mén)(Mucoromycotina)，它們的宿主范圍十分廣泛，包括苔蘚類、蕨類、裸子植物和被子植物。NC endophytes與植物共生，相較于AMF不會(huì)導(dǎo)致宿主產(chǎn)生可見(jiàn)的侵染性狀，既可能在逆境脅迫下促進(jìn)宿主生長(zhǎng)，也可能成為潛在的病原菌[86]。它們既通過(guò)參與土壤的形成過(guò)程間接影響植被，也能調(diào)節(jié)表觀和轉(zhuǎn)錄基因，分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抗氧化酶、金屬螯合蛋白、有機(jī)酸、鐵載體、氨基酸和胞外聚合物等物質(zhì)直接提高植物對(duì)金屬的抗性[87-88]。

3.1 與AMF的區(qū)別

AMF和NC endophytes都屬于內(nèi)生真菌(endophytic fungi, EF)，但在生活方式和功能上差別較大。研究表明，NC endophytes可以定殖在難以形成菌根的十字花科植物[89]，在超耐受(metallophytes)和超富集植物中也比較常見(jiàn)。它們的生長(zhǎng)并不依賴于宿主，可以獨(dú)立地完成生命周期，因此可以進(jìn)行體外培養(yǎng)[90]。另外，它們還能定殖在宿主的葉片、莖和花等地上部組織中，而不局限于宿主的根部，這與AMF有很大的差異[91-92]。但是，在一些菌根植物中，也發(fā)現(xiàn)了NC endophytes的定殖，這說(shuō)明AMF和NC endophytes可以同時(shí)共生于一種宿主，且NC endophytes的定殖比較自由。另外，這也引發(fā)了關(guān)于共生真菌功能的討論，即NC endophytes有何完全區(qū)別于AMF的功能？在二者功能重疊時(shí)，宿主如何進(jìn)行共生選擇[90,93-95]？這些問(wèn)題都還有待探究。并且這些研究對(duì)于理解AMF和NC endophytes，或者說(shuō)對(duì)于根際微生物群如何影響宿主植物的Cr耐受也有重要的意義。

3.2 影響植物對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)

AMF的菌絲結(jié)構(gòu)在吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利用分泌物螯合及固持重金屬，降低重金屬的有效性，進(jìn)而在提高植物的耐受中起到了很重要的作用，因此，與AMF共生的植物往往有比較短的根系[90]。但NC endophytes沒(méi)有為宿主吸收轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，雖然它也可以分泌螯合劑，利用菌絲固持部分重金屬，卻主要是通過(guò)刺激宿主根的伸長(zhǎng)，增加根的表面積來(lái)獲取更多的營(yíng)養(yǎng)[96-97]，當(dāng)然在實(shí)際情況中，植物根系往往共生著多種真菌和細(xì)菌，它們的響應(yīng)遠(yuǎn)比單一接種時(shí)要復(fù)雜得多，即使共生有NC endophytes，它們也不一定會(huì)發(fā)揮出這種功能[98]。另外，在營(yíng)養(yǎng)極度缺乏的條件下，NC endophytes可以利用自身的腐生性分解有機(jī)質(zhì)[99]，必要時(shí)還直接被宿主捕食，改善宿主的營(yíng)養(yǎng)狀況[100]。

另外，NC endophytes會(huì)通過(guò)分泌一些有機(jī)酸[101]、鐵載體、胞外聚合物及多酚類物質(zhì)來(lái)降低金屬的有效性和毒性。而且NC endophytes可以分泌AMF無(wú)法分泌的檸檬酸鹽、草酸及鐵載體等物質(zhì)[90]；還可以通過(guò)靜電吸附金屬離子或利用細(xì)胞質(zhì)膜上的酶(如硝酸還原酶、依賴黃素腺嘌呤二核苷酸的GR等)、蛋白質(zhì)和小分子等還原沉淀金屬離子，形成一些納米顆粒(nanoparticles, NPs)，降低金屬的毒性[102-103]。但是關(guān)于NPs的合成在植物根際的具體影響以及是否在AMF中也有應(yīng)用還需要進(jìn)一步探索。

與AMF相似的是，NC endophytes提高宿主對(duì)重金屬的耐受也基本展現(xiàn)出2種模式[88,104-105]。第1種模式是誘導(dǎo)植物抗性，降低金屬的吸收，有研究者發(fā)現(xiàn)給油菜(Brassicacampestris)接種一種從高污染土中分離的NC endophytesMucorsp. (class 2)之后發(fā)現(xiàn)Cr的吸收量降低了90%，這主要是因?yàn)檎婢軌蚧罨寥乐械腃r后富集在菌絲結(jié)構(gòu)中[105]。另外，隨著宿主植物和NC endophytes類型的改變，在植物均對(duì)重金屬的耐受性提高的前提下，有時(shí)重金屬?gòu)母虻厣喜康霓D(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，有時(shí)則降低，這說(shuō)明NC endophytes提高宿主對(duì)重金屬耐受的機(jī)制是多樣的，但目前針對(duì)此的研究還明顯不足。第2種模式是增加植物對(duì)金屬的富集，尤其是在超富集植物中，但無(wú)論是AMF還是NC endophytes，它們?cè)谔岣叱患参飳?duì)重金屬耐受的過(guò)程中扮演著怎樣的角色都還需要更深入的探究。

3.3 調(diào)節(jié)植物生理和分子過(guò)程

NC endophytes和AMF[58]都可以通過(guò)調(diào)節(jié)S代謝，生成GSH、PCs和金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)等物質(zhì)螯合重金屬[106]，降低其生物有效性，并利用液泡區(qū)隔達(dá)到解毒的效果，大大提高植物對(duì)重金屬的耐受。另外，GSH還作為抗氧化劑緩解氧化脅迫[107]，Zhao等[108]對(duì)暴露在Cd中的NC endophytes嗜魚(yú)外瓶霉(Exophialapisciphila)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)一些與金屬絡(luò)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒，緩解氧化脅迫，維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及S代謝有關(guān)的基因被上調(diào)表達(dá)[108]。

另外，Rozp?dek等[88]發(fā)現(xiàn)接種毛霉菌屬內(nèi)生真菌Mucorsp.的擬南芥屬物種Arabidopsisarenosa在受到重金屬脅迫時(shí)根毛的長(zhǎng)度、凈光合速率、體內(nèi)的水分和P含量均顯著增加，并利用qPCR驗(yàn)證植物體內(nèi)與合成乙烯，維持離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)、金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)和P內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因均上調(diào)表達(dá)，影響了重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)和富集過(guò)程，提高了宿主對(duì)重金屬的耐受。但是，除此之外，對(duì)于NC endophytes如何通過(guò)調(diào)節(jié)植物生理和代謝過(guò)程以緩解金屬脅迫的研究少之又少。

4 外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi, EMF)

EMF也是植物根際的一種共生菌根真菌。與AMF相似的是，它也能改善宿主的營(yíng)養(yǎng)狀況，緩解干旱、病原菌、鹽分及重金屬等環(huán)境脅迫對(duì)宿主造成的損害[109]。有研究給黑松(Pinusthunbergia)接種土生空?qǐng)F(tuán)菌(Cenococcumgeophilum)、彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)、紅蠟?zāi)?Laccarialaccata)和酒紅褶滑繡傘(Hebelomavinosophyllum)后通過(guò)盆栽和根袋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種EMF可以促進(jìn)宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而提高生物量，增強(qiáng)植物對(duì)Cu和Cd的耐受。在一個(gè)短期的暴露實(shí)驗(yàn)中，接種EMF加速了植物對(duì)Cu和Cd的吸收。這說(shuō)明EMF并非完全起到一個(gè)屏障的作用，而是可以通過(guò)改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況促進(jìn)生長(zhǎng)，像AMF一樣起到“生長(zhǎng)稀釋”的作用[110]。

過(guò)去對(duì)EMF提高宿主對(duì)金屬的耐受機(jī)制的研究中，很大一部分強(qiáng)調(diào)了共生EMF基因型的重要作用。研究者認(rèn)為可以根據(jù)基因型將共生EMF分成2類，即敏感型和耐受型。敏感型通常分離于污染較輕的地區(qū)，對(duì)金屬脅迫的響應(yīng)比較靈敏和強(qiáng)烈。而耐受型通常分離于高污染地區(qū)，是已經(jīng)對(duì)金屬脅迫產(chǎn)生基因適應(yīng)的物種，因此共生有耐受型EMF的植物往往對(duì)金屬的耐性也比較高[111]。

EMF會(huì)利用復(fù)雜的菌絲網(wǎng)絡(luò)，為根際的其他細(xì)菌提供礦質(zhì)元素、水、光合產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物[112]。同時(shí)，EMF還會(huì)釋放一些揮發(fā)性的信號(hào)分子如有機(jī)酸、海藻糖和乙醇等，影響共生微生物的種類，并與根際的微生物互作[113]。Fransson等[114]發(fā)現(xiàn)歐洲赤松(PinussylvestrisL.)接種雜色羊肚菌(Suillusvariegatus)和Pilodermafallax之后分泌出的有機(jī)酸和一種未鑒別出具體組成的復(fù)合物是影響微生物群落多樣性的首要因素。而有研究將黃硬皮馬勃(Sclerodermacitrinum)、捕蠅菌(Amanitamuscaria)和紅褐乳菇(Lactariusrufus)和一種假單胞菌共同接種到PinussylvestrisL.后發(fā)現(xiàn)植物增加了對(duì)Zn、Pb和Cd的富集，且減少了金屬?gòu)母饺~的轉(zhuǎn)運(yùn)[115]，這說(shuō)明EMF能與根際的其他微生物協(xié)同提高宿主對(duì)金屬的耐受。

與AMF不同的是，EMF無(wú)法侵入根細(xì)胞內(nèi)，因此更多的是通過(guò)提高自身對(duì)金屬的耐受，在根表起到“保護(hù)屏障”的作用，間接地影響宿主對(duì)金屬的耐受，而非直接提高宿主對(duì)金屬的耐受能力。故接下來(lái)就圍繞EMF自身對(duì)金屬的耐受機(jī)制展開(kāi)闡述。

4.1 胞外作用

4.1.1 對(duì)金屬的阻攔

真菌的細(xì)胞壁往往由含葡聚糖、幾丁質(zhì)和半乳糖胺等的聚合物以及蛋白質(zhì)組成，伴隨有大量游離的羧基、氨基酸、羥基、磷酸鹽和巰基官能團(tuán)，可以結(jié)合重金屬[116]，并且不受真菌代謝活性的影響[117]。除此之外，細(xì)胞壁上的黑色素也可以增強(qiáng)金屬的生物吸附[118]。有研究聯(lián)合利用13C-NMR光譜、X射線衍射和紅外光譜觀察到了粗糙脈胞霉(Neurosporacrassa)細(xì)胞壁上Cd和幾丁質(zhì)的復(fù)合物[119]。Martino等[120]發(fā)現(xiàn)在Cd和Zn的脅迫下，粉樹(shù)孢菌(Oidiodendronmaius)提高了體內(nèi)聚半乳糖醛酸酶的活性，加強(qiáng)了果膠的水解，從而增強(qiáng)了對(duì)金屬的結(jié)合。

除此之外，EMF可以在宿主根表形成菌鞘(sheath)。Ashford等[121]利用熒光示蹤發(fā)現(xiàn)從根外到根表的溶液通道分布著密集的菌鞘結(jié)構(gòu)，它像一個(gè)“屏障”阻擋金屬進(jìn)入根表，抑制了金屬的遷移。而且，菌絲里的多酚也有結(jié)合和沉淀金屬的功能，有效地減少了進(jìn)入根細(xì)胞的金屬量。

4.1.2 對(duì)金屬的結(jié)合

真菌的細(xì)胞壁可以釋放一些可以結(jié)合金屬的有機(jī)小分子，如二羧酸和三羧酸，也可以分泌有機(jī)酸，提供溶解金屬礦物復(fù)合物的質(zhì)子[122]。但分泌有機(jī)酸的過(guò)程，受到金屬類型和真菌種類的影響[123]。

除了細(xì)胞壁及其分泌物，EMF的菌絲也在與金屬的結(jié)合中發(fā)揮著重要的作用。密集的菌絲既可以保護(hù)宿主[124]，也有利于宿主形成更強(qiáng)大的根系[125]，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。Denny等[126]利用X射線微量分析研究卷邊網(wǎng)褶菌(Paxillusinvolutus)侵染的樺樹(shù)(Betulaspp.)中Zn的分布發(fā)現(xiàn)，有高濃度的Zn富集在根外菌絲的細(xì)胞壁和多糖黏液(polysaccharide slime)中。

4.2 胞內(nèi)作用

4.2.1 對(duì)金屬的區(qū)隔

進(jìn)入EMF胞內(nèi)的金屬會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡等組織，與聚磷酸鹽[127]、無(wú)機(jī)離子、PCs、MTs、GSH和有機(jī)酸螯合[117]。在不同的真菌中，受到不同金屬類型的脅迫時(shí)產(chǎn)生的螯合劑可能不同。比如，受到Cd脅迫的Paxillusinvolutus會(huì)上調(diào)體內(nèi)GSH、γ-谷氨酰半胱氨酸和一種金屬硫蛋白的表達(dá)，但PCs的表達(dá)量基本沒(méi)有變化。但是在耐受As的曲霉菌(Aspergillus)分離物中，則在As的脅迫下檢測(cè)到大量類植物螯合肽2(phytochelatin 2, PC2)復(fù)合物的生成。受到Hg和Cd脅迫的L.laccata沒(méi)有改變體內(nèi)金屬硫蛋白的水平，而是上調(diào)了體內(nèi)半胱氨酸、非蛋白的GSH以及它的前體γ-谷氨酰半胱氨酸的表達(dá)。

除了這些螯合劑，EMF還會(huì)在金屬脅迫時(shí)增加聚胺和精胺的合成，也能通過(guò)提高酪氨酸酶的活性，增加菌絲中的黑色素，進(jìn)一步抑制金屬或其他離子通過(guò)菌絲進(jìn)入細(xì)胞[128]。

4.2.2 對(duì)金屬的解毒

硫氧還蛋白的2個(gè)半胱氨酸殘基可以參與折疊和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，減少脫氫抗壞血酸的生成，修復(fù)受氧化損傷的蛋白以及S代謝等過(guò)程[129]，在金屬的解毒中起到很重要的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，受到Cu2+和Cd2+脅迫的Paxillusinvolutus上調(diào)了PiTrx1基因的表達(dá)[130]。另外，和其他微生物抗金屬氧化脅迫的機(jī)制相似，Ott等[131]發(fā)現(xiàn)在Cd脅迫下的Paxillusinvolutus誘導(dǎo)了SOD的生成，并且增加了GSH、依賴GSH的過(guò)氧化酶以及GSH還原酶的生成。

在分子水平上，有研究者直接從一種外生真菌Suillushimalayensis中分離出2個(gè)金屬硫蛋白基因：shMT1和shMT2，并在酵母突變型cup1Δ(Cu敏感)、ycf1Δ(Cd敏感)和zrc1Δ(Zn敏感)中做了功能互補(bǔ)表達(dá)，驗(yàn)證了shMTs的功能，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因相較于Cd更容易被Cu誘導(dǎo)，并在解毒的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[132]。

4.2.3 對(duì)金屬的外排

在耐受型EMF中，金屬的外排是為了防止金屬在細(xì)胞質(zhì)和液泡中過(guò)度累積。這個(gè)外排體系不僅減少了金屬?gòu)恼婢焦采缑娴霓D(zhuǎn)移量，也不會(huì)妨礙正常的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[133]。

目前關(guān)于EMF提高宿主植物Cr耐性機(jī)制的研究十分少，只能根據(jù)上述對(duì)其他金屬的研究進(jìn)行了解和推測(cè)。例如，在受到Cr脅迫時(shí)，EMF的細(xì)胞壁是否可以發(fā)揮阻擋、結(jié)合的功能？是否可以在亞細(xì)胞水平上揭示Cr在EMF細(xì)胞壁或菌鞘、菌絲等結(jié)構(gòu)中的微區(qū)分布？也可以從解毒機(jī)制的角度出發(fā)，探究不同EMF在受到Cr脅迫時(shí)，會(huì)分泌何種螯合劑，影響何種基因的表達(dá)？S的代謝產(chǎn)物是否也在Cr解毒中發(fā)揮著重要作用？有無(wú)對(duì)Cr敏感或Cr耐受的基因？關(guān)于EMF如何響應(yīng)Cr的脅迫，提高植物對(duì)Cr的耐受，還存在太多未知有待探索。

5 總結(jié)與展望(Conclusion and prospect)

4種根際微生物作為金屬與植物接觸的“第一道屏障”，在提高宿主Cr耐受的過(guò)程中發(fā)揮著多樣且重要的作用。它們大多都能利用自身結(jié)構(gòu)組織的特性或分泌一些螯合劑，結(jié)合根際環(huán)境中的金屬，降低金屬的有效性。此外，有的微生物如PGPR和AMF，可以顯著地改善宿主的營(yíng)養(yǎng)條件，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。也有一些微生物可以刺激自身或植物細(xì)胞內(nèi)與GSH、PCs和MTs等解毒關(guān)鍵物質(zhì)相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，以此降低金屬的毒性。另外，還有包括這4種在內(nèi)的很多微生物及其功能沒(méi)有被完整和深入地研究和認(rèn)識(shí)，因此展望如下：

(1)關(guān)于Cr在植物體內(nèi)定位、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)和富集的過(guò)程還存在很多未知，需要更深入全面的探究。在未來(lái)生理和分子水平的研究中，可以通過(guò)利用更精密的分析方法如X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)、掃描透射X射線顯微分析等，揭示Cr在共生界面和植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化行為和微區(qū)分布，及利用分子學(xué)手段定位與鑒定參與調(diào)節(jié)植物內(nèi)穩(wěn)態(tài)、影響金屬行為的相關(guān)基因等，以期從更微觀的角度解釋微生物提高宿主Cr耐受的機(jī)制，為未來(lái)利用分子生物和基因工程等技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，更安全更高效地提高植物的產(chǎn)量，提高植物對(duì)金屬污染土壤的耐受等工作提供理論基礎(chǔ)。

(2)在實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境中，植物會(huì)受到微生物尤其是病原菌以及土壤酸化、鹽堿化和干旱等環(huán)境脅迫的多重影響，其根際的微生物也非互相獨(dú)立，而是和其他微生物形成一個(gè)復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)[134]，植物與微生物，微生物與微生物之間都在相互影響著[98]。當(dāng)植物受到Cr脅迫時(shí)，功能相近的根際微生物占據(jù)的生態(tài)位有何不同，有多大程度的不同，植物會(huì)如何權(quán)衡以提高對(duì)Cr的耐受都是亟待回答的問(wèn)題[90]。因此，可以開(kāi)展一些田間試驗(yàn)，并結(jié)合根際微生物互作網(wǎng)絡(luò)的研究，拓寬對(duì)實(shí)際環(huán)境中植物與微生物互作，微生物行為和功能的認(rèn)識(shí)。反過(guò)來(lái)，這些研究也會(huì)幫助我們更深刻地認(rèn)識(shí)根際微生物提高宿主Cr耐受的機(jī)制。