綦崢，齊越，李芳，楊紅，張鐵林，凌娜

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076

2. 哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心，哈爾濱 150028

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在環(huán)境中的形成、傳播和擴(kuò)散作為一個新的全球性污染問題正在引起高度重視[1]?？股氐膹V泛使用通常被認(rèn)為是致病菌中ARGs水平升高的主要原因[2]。環(huán)境抗生素殘留可影響動物腸道菌群[3]，顯著增加細(xì)菌獲得ARGs的頻率，并通過基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)加速ARGs的傳播，從而使畜禽糞便成為抗生素和ARGs的重要儲存庫[4-5]，然而在我國畜禽糞便利用率不足50%，含有ARGs的糞肥很容易通過各種途徑進(jìn)入土壤，從而威脅食物鏈，引起人類的健康風(fēng)險，因此土壤被認(rèn)為是抗生素殘留和ARGs的最重要受納體之一[6]。

近年來，使用含有重金屬元素的殺蟲劑和促進(jìn)動物生長劑導(dǎo)致了更廣泛的重金屬非點源污染[7-8]。越來越多的報道表明，ARGs的豐度增加還可能是由于重金屬的廢物排放，與抗生素不同的是，重金屬作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧場中，因其不易降解，在暴露的生物體中會對ARGs產(chǎn)生長期的選擇壓力，常常促進(jìn)了ARGs在環(huán)境細(xì)菌種群中的傳播[9]。許多試驗研究表明，重金屬與ARGs之間存在極大的相關(guān)性[10-11]。Ji等[12]對上海地區(qū)3個典型飼料廠采集土壤和肥料樣品，發(fā)現(xiàn)某些ARGs與典型重金屬之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)，如sulA和sulⅢ與Cu、Zn和Hg的濃度水平高度相關(guān)。Wang等[13]在厭氧消化過程中，研究了金霉素和Cu對ARGs的影響，結(jié)果表明，Cu對ARGs有一定的選擇壓力，但金霉素和Cu共同作用會對ARGs有極大的選擇壓力，特別是tetA和intⅠ1。Knapp等[14]檢測了澳大利亞的西澳大利亞州的90個花園土壤，比較12種重金屬和13種四環(huán)素、內(nèi)酰胺和磺胺類AGRs的相關(guān)性，除Se和Co外，所有重金屬在絕對基因數(shù)上與至少一個ARGs相關(guān)，但Al、Mn和Pb與多種ARGs的相關(guān)性顯著。已有研究證實，Cu和Ni的暴露增加了土壤中ARGs的多樣性和豐度[15-16]。

然而很少有研究調(diào)查大型畜牧場土壤中重金屬與ARGs的關(guān)系和分布，因此本研究以杜爾伯特蒙古族自治縣畜牧園區(qū)不同深度土壤為研究對象，采用地理信息系統(tǒng)(Geographic Information System/Geo-Information system, GIS)模型的空間分析和可視化功能模擬污染物的污染范圍和趨勢，以此獲得ARGs與重金屬在畜牧場土壤中的空間分布規(guī)律及相關(guān)性。為預(yù)測未來ARGs和重金屬對北方特色黑土的污染特征提供了理論依據(jù)，并為下一步尋找有效的預(yù)防措施奠定基礎(chǔ)，同時為相關(guān)部門提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息以制定控制ARGs污染的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)方針。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

杜爾伯特蒙古族自治縣是黑龍江省唯一的少數(shù)民族自治縣(以下簡稱杜蒙)。地處松嫩平原、嫩江東岸。在地層結(jié)構(gòu)上，以大型雜色礫巖塊為主的第三系太康組和表層1.0 m為灰黑色腐殖土、砂礫層等的第四系組成。在中部、北部和東部地區(qū)，經(jīng)常形成不同程度的鹽化和堿化草甸土壤，因此，杜蒙在具有我國特色的鹽堿化土地上發(fā)展畜牧業(yè)，使畜牧業(yè)成為杜蒙不可替代的支柱產(chǎn)業(yè)。本次研究的畜牧場面積約7萬m2，奶牛約200頭，是國內(nèi)某知名奶業(yè)品牌奶源的提供基地。結(jié)合GIS優(yōu)化布點，發(fā)現(xiàn)初步調(diào)查第1階段預(yù)設(shè)采樣點與第2階段實際采樣點因采樣區(qū)域地貌存在些許偏差，因此10個實際土壤采樣點的布設(shè)如圖1所示，采樣點S01～S08為成牛的自由活動區(qū)，S09和S10為犢牛的自由活動區(qū)。分別在每個采樣點采集土壤表面以下10 cm和50 cm的土壤樣品各500 g[17-18]。在每個采樣點1 m2內(nèi)采集3份土壤樣品混勻，按照四分法縮減，過0.25 mm(20目)尼龍篩，共20份土壤樣品。20份土壤樣品分別均勻分成2部分：一部分土壤過0.15 mm(100目)篩，自然風(fēng)干，用于后續(xù)重金屬含量的測定；另一部分土壤過0.25 mm(60目)篩，-80 ℃保存，用于后續(xù)DNA的提取和ARGs的測定。樣品的基本信息如表1所示。

表1 樣品編號和精確采樣經(jīng)緯度

圖1 采樣點分布圖

1.2 重金屬含量的檢測

土壤pH值的測定采用土壤的去CO2水懸浮液，土液比為1∶2.5，攪拌靜置后用多參數(shù)測定儀測定[19]；土壤中的Cu、Zn、Pb、Ni、Cr和Cd經(jīng)HNO3-HF-HClO4(體積分別為5 mL、2 mL和1 mL)石墨消解后用原子吸收光譜儀測定[20-21]；Hg和As經(jīng)(1+1)王水(1份硝酸與3份鹽酸混合，去離子水稀釋1倍)沸水浴后用原子熒光分光光度計測定[22-23]；同時進(jìn)行空白試樣的制備。為保證分析的準(zhǔn)確性，對質(zhì)控樣品(GBW07427)和試驗樣品進(jìn)行平行樣分析，并確定了平均值，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<15%。

1.3 DNA的提取

土壤基因組DNA的提取使用快速提取試劑盒TIANNAMP Soil DNA Kit(DP336，天根生化科技(北京)有限公司，中國)，按照說明書要求提取。提取完畢后，超微量紫外分光光度計(Q3000，Quawell，美國)檢測含量及純度，A260/A280在1.8～2.0之間，-80 ℃保存，進(jìn)行后續(xù)定量分析。

1.4 ARGs相對豐度的實時熒光定量PCR檢測

標(biāo)準(zhǔn)PCR定性檢測ARGs后，采用StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀(Thermo，美國)對β-內(nèi)酰胺類(ampC2、ampC4、blaOXA1/blaOXA30、blaOXA10、blaPSE、blaTEM、cfxA和fox5)、磺胺類(sul1、sul2和sul3)、四環(huán)素類(tet32、tet34、tet36、tetAP、tetB、tetC、tetG、tetM、tetO、tetPA、tetR、tetS、tetT、tetW、tetX、tetY和tetZ)共28種ARGs及16S rRNA進(jìn)行靶向定量測定[24-25]。qPCR采用10 μL體系，包含5 μL的TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)，2個引物各0.4 μL，0.2 μL的ROX Reference Dye(50×)，1 μL的DNA模板以及3 μL的ddH2O。反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，△CT方法計算ARGs的相對豐度。每個樣品設(shè)置3個平行樣，同時做空白對照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用ArcGIS 10.4.1軟件繪制重金屬和ARGs空間污染云圖，分析重金屬和ARGs垂直、水平污染空間分布特征；利用Cluster 3.0和Java Treeview軟件繪制熱圖，對比分析重金屬對ARGs的選擇壓力是否存在差異；采用SPSS 23.0對重金屬和ARGs進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析；應(yīng)用Origin 2017繪圖軟件進(jìn)行堆積柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 不同土層中重金屬污染情況及污染評價

對不同土層樣品進(jìn)行pH值測定，結(jié)果所有樣品pH>8；對10 cm和50 cm土壤深度的Cu、Zn、Pb、Ni、Cr、Cd、Hg和As含量進(jìn)行描述性分析，統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。以國家土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)值(pH>7.5)為評價基準(zhǔn)，采用單因子污染指數(shù)法[26]和內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)法[27]對杜蒙園區(qū)土壤重金屬(10 cm和50 cm)污染狀況進(jìn)行評價，并與黑龍江省土壤重金屬含量背景值進(jìn)行對比。污染程度等級為：單因子污染指數(shù)Pi≤1為不存在污染；Pi≥3為重度污染，內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法P綜≥3為重度污染。由表2可知，檢測的As、Zn、Cu、Cr、Cd、Ni、Pb和Hg這8種重金屬中，As處于重度污染，其余7種重金屬均為安全等級，其中，50 cm土層的As的單因子污染指數(shù)最高，達(dá)到7.74，遠(yuǎn)高于其他7種重金屬。從超標(biāo)率來看，10 cm和50 cm的As遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑龍江土壤背景值[28]7.3 mg·kg-1和11.4 mg·kg-1，10 cm的Zn超背景值1.26倍，10 cm的Cd超背景值1.06倍，且超標(biāo)率均≥60%，表明杜蒙畜牧園區(qū)土壤可能已受這3種重金屬污染。內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)法的公式為：

表2 土壤重金屬統(tǒng)計分析

式中：P綜為內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)；Pi為單因子污染指數(shù)；Pimax為各重金屬元素單因子污染指數(shù)的最大值；Piave為各重金屬元素單因子污染指數(shù)的平均值。P綜10 cm=4.608、P綜50 cm=5.526，同樣表明杜蒙畜牧園區(qū)土壤重金屬污染已達(dá)到重度污染等級。

變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)代表樣本中重金屬含量的離散性，可反映人為活動對重金屬含量的影響，CV值越大，說明受人為活動的干擾越明顯。Wilding[29]發(fā)現(xiàn)，CV<0.15為輕度變異，0.150.36為高度變異。在這8種重金屬中，As、Cr和Pb的變異系數(shù)均高于0.36，說明土壤中As、Cr和Pb受外界干擾顯著，空間分散程度較大，很大程度上歸結(jié)為畜牧業(yè)和交通等人為活動的影響。

2.2 不同土層中重金屬的空間分布特征

利用ArcGIS對土壤重金屬進(jìn)行反距離加權(quán)插值，繪制杜蒙畜牧園區(qū)10 cm和50 cm土壤中8種重金屬空間分布云層圖。由圖2可知，8種重金屬的分布差異較大，但仍存在一定的規(guī)律性。垂直剖面分析來看，As、Hg、Cr、Ni和Pb由上至下呈逐漸增大的污染特征，但Cu、Zn和Cd隨著土壤深度的增加由上至下呈逐漸減小的污染特征，很大程度上與牧場園區(qū)使用動物生長劑有關(guān)[30]，這與阮心玲等[31]和梁玉峰等[32]研究得出的土壤中Cu、Zn和Cd更易在表層富集的結(jié)論一致。研究表明，多數(shù)重金屬不僅易在表層富集，且隨著土壤深度的增加會逐漸遷移及蓄積[33-34]。因此，重金屬垂直分布變化的原因有待進(jìn)一步的深入研究。從水平結(jié)構(gòu)分析來看，As在10 cm和50 cm土層的水平結(jié)構(gòu)類似，從西向東污染特征呈先增加后減小再增加的趨勢，且污染主要集中于東南部地區(qū)，很大程度上與大氣沉降[35]及牧場園區(qū)施用殺蟲劑和除草劑等有關(guān)。Pb在10 cm和50 cm土層的水平結(jié)構(gòu)類似，從西向東呈先增加再減小的趨勢，且在中部地區(qū)污染最嚴(yán)重；Hg和Cr在10 cm土層的結(jié)構(gòu)類似，主要污染特征集中在東南部，由于該地區(qū)Hg的平均含量較低，推測該分布特征與自然來源土壤母巖等有關(guān)[36]；Ni和Zn在10 cm土層的結(jié)構(gòu)類似，污染特征在西部和中部聚集；As和Ni、Pb和Zn、Cu和Cr分別在50 cm土層水平結(jié)構(gòu)類似，污染特征分別在東南部、中部和西部地區(qū)較高?？傮w來說，畜牧場重金屬污染呈重度等級，很大程度上與天然礦石、大氣沉降以及畜牧場的養(yǎng)殖模式有關(guān)。同時，重金屬之間存在同源性，污染來源可能與畜牧場農(nóng)業(yè)活動和土壤母質(zhì)因素等有關(guān)。

圖2 不同土層中重金屬的空間分布圖

2.3 不同土層中ARGs的空間分布特征

土壤中28種ARGs的檢測結(jié)果如圖3和圖4所示，可以看出，各類ARGs在不同土層中的含量有較大差異。在磺胺類ARGs中，sul2的相對豐度最高，趙祥等[37]用real-time qPCR對土壤中ARGs的豐度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)磺胺類ARGs中sul2的含量較高，與本研究結(jié)果相似。張?zhí)m河等[38]研究土壤ARGs的分布特征發(fā)現(xiàn)磺胺類ARGs中sul1和sul2的檢出率均為100%，與本實驗結(jié)果相似。同樣有研究表明，磺胺甲噁唑的污染會引起土壤中磺胺抗性基因sul1的豐度顯著增加且能提高sul2的豐度[39]，飼料添加劑中的磺胺脒也可能是磺胺類ARGs豐度增加的原因之一[40]。垂直方向上，磺胺類ARGs都隨著土壤深度的增加呈逐漸降低的趨勢，水平方向上，從西向東污染特征逐漸增大，主要污染特征集中在東部地區(qū)；β-內(nèi)酰胺類ARGs中，50 cm中blaTEM的相對豐度極大，主要集中在S02～S04的成牛自由活動區(qū)和S9～S10犢牛自由活動區(qū)。這也是造成50 cm土層中ARGs明顯升高的原因，但在10 cm土層中，β-內(nèi)酰胺類ARGs相對豐度含量極小，且隨土壤深度的增加有明顯上升趨勢，表明β-內(nèi)酰胺類ARGs可能有垂直向下傳播轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，也可能是杜蒙畜牧場奶牛食用頭孢類抗生素治療奶牛乳腺炎的緣故，有研究表明，頭孢菌素或重金屬脅迫條件下，β-內(nèi)酰胺類ARGs的相對豐度逐漸升高[41]，例如，袁曉春[42]在乳制品中檢測出了頭孢氨芐，含量為45.0 μg·L-1。從水平方向看，β-內(nèi)酰胺類ARGs污染特征差異較大，主要集中于西部的犢?；顒訁^(qū)和東北部成?；顒訁^(qū)，推測β-內(nèi)酰胺類ARGs可能在親代和子代之間有傳播轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。四環(huán)素類ARGs的種類和相對豐度較高，這與Zhou等[43]研究得出的我國農(nóng)田土壤ARGs的分布結(jié)果一致，說明四環(huán)素類ARGs在環(huán)境中的持久性強(qiáng)于磺胺類ARGs[44]，且隨著土壤深度的增加有逐漸降低的趨勢，其中，除tet32、tet34、tet36、tetO、tetPA和tetR外，其余四環(huán)素類ARGs的檢出率均為100%，且tetAP和tetX的相對豐度較高。蔣臨正等[45]的研究表明，長期使用四環(huán)素對奶牛乳房炎進(jìn)行治療會導(dǎo)致耐藥性的增加。水平方向上，四環(huán)素類ARGs從西向東污染特征逐步增大，主要集中于東部地區(qū)。

圖4 磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類ARGs在不同土層的空間分布圖

圖3 抗生素抗性基因(ARGs)在不同土層的相對豐度

不同奶牛場的ARGs分布特征各有不同。Liu等[46]研究美國華盛頓州中部地區(qū)6個不同的住房區(qū)域奶牛場糞便和土壤的ARGs分布時，發(fā)現(xiàn)犢牛區(qū)域的土壤ARGs最高，特別是rmtC和fosA3。與本研究犢牛自由活動區(qū)的土壤中所含blaTEM較高的結(jié)果有明顯差異。Zhou等[47]研究了中國山西省17個奶牛場的ARGs的分布，發(fā)現(xiàn)土壤中的四環(huán)素類ARGs>磺胺類ARGs>β-內(nèi)酰胺類ARGs，與本研究中β-內(nèi)酰胺類ARGs的相對豐度最高的結(jié)論相反。Sun等[48]對中國南京市郊區(qū)的7個奶牛場的土壤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，sul1和sul2在每一個奶牛場的檢出率均為100%，且相對豐度范圍為4.5×10-7～5.5×10-4拷貝數(shù)/16S rRNA基因拷貝數(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于本研究結(jié)果中磺胺類ARGs的相對豐度。以上不一致的研究結(jié)果表明，ARGs差異較大的原因可能與不同區(qū)域的土壤理化性質(zhì)、歷史抗生素使用背景及重金屬、細(xì)菌群落等其他因素有關(guān)[49-52]。

2.4 重金屬與ARGs的相關(guān)性分析

重金屬與ARGs的相關(guān)性分析如表3所示，在P<0.05水平上，Cr與sul2、tetX和As與tetR呈中度正相關(guān)(r>0.5)；Pb與tetW呈低度正相關(guān)(r=0.495)；Cd與tetC呈低度正相關(guān)(r=0.463)，但在P<0.01水平上，Cd與tet34呈中度負(fù)相關(guān)(r=-0.590)；總體而言，重金屬As對總四環(huán)素類ARGs呈低度正相關(guān)(r=0.469，P=0.037)，其他重金屬與ARGs之間則沒有較明顯的相關(guān)性。事實上，在某些情況下，重金屬可能比特定的抗生素對ARGs更有選擇性[12]。而對于重金屬與ARGs之間關(guān)系的研究，不同研究者得到的結(jié)論也不盡相同。Zhao等[53]對英國北愛爾蘭地區(qū)受金屬污染的城市土壤金屬含量和ARGs進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)24種金屬與ARGs呈顯著正相關(guān)，其中，Cr、Zn與β-內(nèi)酰胺類ARGs顯著相關(guān)。Deng等[54]研究重金屬、抗生素和營養(yǎng)物質(zhì)影響施肥土壤中ARGs的結(jié)果表明，Cu與ARGs呈顯著正相關(guān)。Knapp等[55]對英國蘇格蘭土壤重金屬和ARGs的關(guān)系進(jìn)行定量研究，發(fā)現(xiàn)許多ARGs與Cu呈正相關(guān)，而Cr、Ni、Pb和Fe也與特定的ARGs顯著相關(guān)。而Ding等[56]的研究結(jié)果表明，當(dāng)Zn或Cu與土霉素同時存在時會對ARGs產(chǎn)生很強(qiáng)的協(xié)同作用。因此重金屬對土壤中ARGs有潛在的影響，但多種因素聯(lián)合發(fā)揮作用往往是造成重金屬對ARGs的選擇差異的原因。

表3 重金屬與ARGs相對豐度的相關(guān)性

通過聚類分析，進(jìn)一步分析重金屬與ARGs的關(guān)系，如圖5所示，熱圖的橫向代表ARGs的相對豐度，縱向代表8種重金屬的聚類情況，可反映出重金屬對ARGs是否有選擇壓力的相似性，由圖5可知，重金屬污染程度較重的As和Cr可以聚類，污染程度一般的Cd、Zn和Cu可以聚類，污染程度較輕的Hg、Ni和Pb可以聚類。這表明，As和Cr對ARGs的選擇壓力相似，Cd、Zn和Cu對ARGs的選擇壓力相似，Hg、Ni和Pb對ARGs的選擇壓力相似。

圖5 重金屬與ARGs的聚類分析

綜上所述，本研究結(jié)果表明：

(1)杜蒙畜牧園區(qū)不同土層重金屬污染嚴(yán)重，內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)等級為重度污染，其中As污染最為嚴(yán)重，單因子污染指數(shù)為重度污染等級(Pi>3)，其他7種元素屬于安全等級(Pi≤1)。

(2)杜蒙畜牧園區(qū)空間污染分布云層圖顯示重金屬As由上至下呈逐漸增加的垂直污染，而Cu、Zn和Cd更易在表層富集，污染主要集中于東南部地區(qū)。

(3)ARGs污染特征明顯，在不同土層中的相對豐度有較大差異，其中，blaTEM在50 cm的土層污染較為嚴(yán)重，主要集中于西部和東南部地區(qū)。

(4)杜蒙畜牧園區(qū)土壤中個別四環(huán)素類ARGs和磺胺類ARGs相對豐度與重金屬As、Pb、Cd和Cr存在不同程度的相關(guān)性，同時重金屬污染程度較重的As和Cr對ARGs的選擇壓力相似。