熊張平，周世萍，楊廣斌，解思達(dá)，朱鑫澤

西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國(guó)家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西南林業(yè)大學(xué))，昆明 650224

生物標(biāo)志物是衡量環(huán)境污染物的暴露及效應(yīng)的生物反應(yīng)，被廣泛用于土壤污染的生態(tài)毒理學(xué)診斷及評(píng)價(jià)[1-2]。蚯蚓作為土壤環(huán)境污染的重要指示生物[3-5]，在受到外源污染物影響時(shí)，其在分子、細(xì)胞和生理水平上都會(huì)發(fā)生明顯的變化，進(jìn)而會(huì)對(duì)蚯蚓個(gè)體的存活、生長(zhǎng)和繁殖等產(chǎn)生影響[6]，這些不同功能層次的生物反應(yīng)可以作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于土壤污染的生態(tài)毒理學(xué)診斷[7-9]。

生殖系統(tǒng)是蚯蚓的敏感系統(tǒng)，與蚯蚓生殖系統(tǒng)相關(guān)的生物標(biāo)志物不僅可以靈敏地反映污染物對(duì)蚯蚓的生殖毒性影響，而且對(duì)可能產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要的指示性[10]。目前用于污染物土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的蚯蚓生物標(biāo)志物主要有：個(gè)體及種群水平的生物標(biāo)志物、細(xì)胞水平的生物標(biāo)志物、生物酶蛋白標(biāo)志物、暴露和生物效應(yīng)標(biāo)志物[11-13]。與生殖毒性相關(guān)的生物標(biāo)志物主要是產(chǎn)卵數(shù)量、卵孵化率等個(gè)體及種群水平的生物標(biāo)志物[11]，這些標(biāo)志物雖能直觀、真實(shí)地反映污染物對(duì)蚯蚓個(gè)體及種群的生殖毒性影響，但這些指標(biāo)一般需要較長(zhǎng)的暴露時(shí)間才能檢測(cè)，如產(chǎn)卵量和卵孵化率等指標(biāo)需要28 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能檢出，難以滿足農(nóng)田土壤健康質(zhì)量快速診斷和評(píng)價(jià)的實(shí)際需求[14]。

頂體反應(yīng)是生物受精過(guò)程中極其重要的環(huán)節(jié)，是獲能精子在穿越卵丘細(xì)胞與透明帶之前或穿透這些結(jié)構(gòu)期間，精子被激活后釋放頂體內(nèi)容物，溶解卵丘細(xì)胞和透明帶，進(jìn)而穿過(guò)透明帶與卵細(xì)胞融合完成受精的過(guò)程，只有發(fā)生頂體反應(yīng)的精子才能與卵子結(jié)合[15-17]。精子頂體酶是參與頂體反應(yīng)的重要酶類(lèi)物質(zhì)之一，此酶能水解卵細(xì)胞的透明帶糖蛋白，使精子能夠與卵子融合[18-19]，還能夠促進(jìn)生殖系統(tǒng)中的激肽釋放，從而增強(qiáng)精子的活力和促進(jìn)精子的運(yùn)動(dòng)，是頂體反應(yīng)能否成功的關(guān)鍵[17]。精子質(zhì)量是受精的前提，也是生殖功能是否正常的重要標(biāo)志，近年來(lái)研究證實(shí)精子頂體酶與精子密度、精子質(zhì)量和受精率之間呈顯著正相關(guān)[20]，因此頂體酶活性不僅可以反映精子質(zhì)量的變化，同時(shí)對(duì)生殖功能的變化也具有指示作用，是較有希望用于污染物生殖毒性及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

目前蚯蚓與生殖毒性相關(guān)的生物標(biāo)志物中，缺乏可以靈敏快速反映污染物生殖毒性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。如果蚯蚓受精過(guò)程中也存在精子頂體反應(yīng)，就可以利用蚯蚓精子頂體酶的活性變化對(duì)土壤污染物的生殖毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而對(duì)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)警，但目前已有的動(dòng)物頂體反應(yīng)研究主要涉及哺乳動(dòng)物，對(duì)于蚯蚓等土壤生物的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究對(duì)蚯蚓精子的頂體反應(yīng)進(jìn)行了研究，采用考馬斯亮藍(lán)染色法[21-25]驗(yàn)證對(duì)蚯蚓精子的頂體率進(jìn)行檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)頂體酶活性測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了蚯蚓精子的頂體酶活性測(cè)定方法，希望該方法能夠應(yīng)用于土壤污染物生殖毒性的快速診斷，為土壤污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警提供可行的監(jiān)測(cè)指標(biāo)及其測(cè)定方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 蚯蚓

供試蚯蚓為云南哀牢山地區(qū)采集的皮質(zhì)遠(yuǎn)盲蚓(Amynthascorticis)，培養(yǎng)條件為：土壤含水量為田間最大持水量的50%，溫度20 ℃；實(shí)驗(yàn)蚯蚓選用2～3月齡，體重0.4～0.5 g，具有成熟環(huán)帶的健康蚯蚓。實(shí)驗(yàn)前將蚯蚓在供試土壤中適應(yīng)1周后取出，用純水沖洗放入鋪有濕潤(rùn)滅菌紗布的玻璃皿中，恒溫(20±2) ℃暗室培養(yǎng)24 h，進(jìn)行清腸處理備用[26-28]。

1.1.2 供試土壤

本實(shí)驗(yàn)選取人工土作為培養(yǎng)基質(zhì)，按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)規(guī)定的人工土標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成成分為：石英砂70%，高嶺土20%，苔蘚草碳土10%，以碳酸鈣調(diào)節(jié)pH為6.0±0.5[13]。

1.1.3 試劑

乙醇脫氫酶(ADH)，比活力是300 U·mg-1，優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；氧化型輔酶Ⅰ (NAD)，優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)，優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；復(fù)方醋酸棉酚片購(gòu)自西安北方藥業(yè)有限公司。其他藥品均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司，UV-1950)；倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司，Axiovert 200)；智能高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司，3H20RI)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，YLD-300)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司，DK-98-Ⅱ)。

1.2 蚯蚓頂體反應(yīng)檢測(cè)

參考考馬斯亮藍(lán)染色法[21-25]并改良，用于觀察檢測(cè)蚯蚓精子頂體反應(yīng)。即蚯蚓用清水浸泡，洗去泥沙污物等，放在濾紙上吸干，70%乙醇麻醉，冰浴的條件下，按組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖，取出儲(chǔ)精囊，放入盛有1 mL磷酸緩沖液或生理鹽水的離心管中。眼科剪剪碎儲(chǔ)精囊，4 000 r·min-1條件下離心3 min，棄掉上清液，沉淀以1 mL 4%多聚甲醛溶液懸浮固定10 min，4 000 r·min-1條件下離心3 min，棄上清液，1 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，洗滌1次；適量PBS懸浮沉淀，吸取適量精子懸液涂片晾干；精子涂片入染色缸，浸染20 min，水沖洗玻片，晾干備檢[24]。在顯微鏡下，對(duì)蚯蚓精子的染色形態(tài)進(jìn)行拍照，鏡檢計(jì)數(shù)>200個(gè)精子，記錄頂體率[29]。

1.3 蚯蚓頂體酶測(cè)定方法的建立

目前測(cè)定精子頂體酶的方法主要有明膠分解試驗(yàn)方法[30]、精氨酸酰胺酶活性檢測(cè)法[31]和BAEE/ADH聯(lián)合檢測(cè)法等[32-33]，BAEE/ADH聯(lián)合測(cè)定法是目前檢測(cè)精子頂體酶常用方法，已用于對(duì)豬和人等物種精子頂體酶活性的測(cè)定，但由于蚯蚓的品種特性，跟其他動(dòng)物存在種屬差異，已報(bào)道的BAEE/ADH聯(lián)合測(cè)定法不能有效檢測(cè)出蚯蚓頂體酶活性，需針對(duì)蚯蚓物種特性對(duì)頂體酶測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。筆者采用響應(yīng)面分析法對(duì)蚯蚓精子頂體酶活性測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化，以確保測(cè)定方法的高效、低成本，便于推廣和應(yīng)用。對(duì)測(cè)定方法影響最顯著的洗滌次數(shù)、ADH濃度、NAD濃度和抽提時(shí)間進(jìn)行四因素五水平正交組合實(shí)驗(yàn)，因素水平表如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.4 方法學(xué)考察

棉酚作為非激素類(lèi)干擾生精的代表藥物，研究證明，醋酸棉酚可抑制大鼠和人精子的數(shù)目、活率和活力[34-35]。因此利用醋酸棉酚對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)考察。參考急性毒性實(shí)驗(yàn)方法[36]，在蚯蚓未表現(xiàn)出回避反應(yīng)的濃度范圍內(nèi)設(shè)置6個(gè)濃度梯度，染毒濃度梯度(0、4、8、12、16和20 mg·kg-1)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)濃度劑量處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。稱(chēng)取300 g人工土于500 mL培養(yǎng)瓶中，將所需藥劑與人工土充分混勻[37]，調(diào)節(jié)水分，然后各放入10條健康的蚯蚓，用保鮮膜(解剖針扎孔)密封，橡皮筋扎住，置于(20±1) ℃培養(yǎng)箱中，進(jìn)行12 h光照、12 h黑暗培養(yǎng)。

頂體酶活性的測(cè)定方法采用本研究建立的方法。于染毒處理后第3天取出蚯蚓，按其組織結(jié)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行解剖，取出儲(chǔ)精囊，稱(chēng)其質(zhì)量。用1 mL 0.15 mol·L-1NaCl制成組織勻漿并洗滌2次，然后將洗滌后的精子懸浮于0.25 mL 2%的醋酸溶液，4 ℃冰箱內(nèi)進(jìn)行24 h頂體酶的抽提，然后在>1 200 r·min-1離心10 min，其上清液用于頂體酶活性測(cè)定。測(cè)定時(shí)在試管內(nèi)依次加入12 mg·mL-1NAD 0.1 mL、1 mg·mL-1BAEE 0.5 mL、1.8 mg·mL-1ADH 0.1 mL和pH 8.7、0.05 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液2.25 mL，25 ℃下水浴5 min。記錄加入0.05 mL上清液后，10 min反應(yīng)液在366 nm處吸光度的變化值。

蚯蚓精子頂體酶活性單位為每毫克蛋白質(zhì)的頂體酶活性，因1個(gè)毫單位(mU)的頂體酶活性等于在上述反應(yīng)條件下(pH 8.5和25 ℃)，每分鐘水解1 nmol·L-1的BAEE所需要的頂體酶量。因?yàn)樗? nmol·L-1的BAEE使反應(yīng)液的吸光度變化0.0011，所以每毫克蛋白質(zhì)內(nèi)的頂體酶活性按下列公式計(jì)算[38]：

式中：t是反應(yīng)時(shí)間(10 min)，△A是在t時(shí)內(nèi)吸光度的變化值，V是加入酶液的體積(0.05 mL)。所以，頂體酶活性公式為:

1.5 精子密度測(cè)定方法

取出蚯蚓，麻醉后解剖，取出貯精囊放入盛有適量生理鹽水或PBS的離心管中，通過(guò)擠壓方法釋放貯精囊中的精子形成懸液，置于37 ℃水浴箱孵育，液化后使用Cell-VU計(jì)數(shù)池(Millennium Sciences Inc，美國(guó))在光鏡下進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Design-expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和回歸分析，利用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 蚯蚓頂體效應(yīng)檢測(cè)

蚯蚓精子經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖1所示，蚯蚓精子尾部被染成紫藍(lán)色，頭部呈現(xiàn)出2種染色特征a和b，a型精子頂體區(qū)染成淺紫色，b型精子頂體區(qū)染成紫藍(lán)色。a型為已經(jīng)發(fā)生頂體反應(yīng)。蚯蚓精子頂體率的測(cè)定結(jié)果如表2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蚯蚓精子存在頂體反應(yīng)，頂體率(47.67±3.87)%。

表2 蚯蚓頂體效應(yīng)

圖1 精子考馬斯亮藍(lán)染色圖像

2.2 蚯蚓頂體酶測(cè)定條件的優(yōu)化及方法建立

采用Design-expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得出洗滌次數(shù)(A)、抽提時(shí)間(B)、ADH濃度(C)與NAD濃度(D)與蚯蚓精子頂體酶活性(Y)這個(gè)響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，得到二次回歸方程(模型)為：Y=-1.12A2+0.45B2-1.36C2-2.19D2-0.31A+1.22B+0.76C+1.23D-0.66AB-0.42AC-0.59AD-0.014BC-0.18BD-0.51CD+16.84。

利用正交實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面回歸方法對(duì)頂體酶活性測(cè)定條件與各影響因素的關(guān)系進(jìn)行了擬合。結(jié)果表明，擬合方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)與交互項(xiàng)對(duì)于響應(yīng)值的影響都顯著，按照各因素的F值大小，各因素對(duì)蚯蚓精子頂體酶活性測(cè)定條件影響的顯著性從大到小依次為：NAD濃度>抽提時(shí)間>ADH濃度>洗滌次數(shù)[39]。

通過(guò)擬合模型響應(yīng)面分析，優(yōu)化后最佳試驗(yàn)條件為洗滌2次，抽提時(shí)間24 h，ADH濃度1.8 mg·mL-1、NAD濃度12 mg·mL-1，其測(cè)定過(guò)程中試劑消耗量減少，分析時(shí)間縮短，檢測(cè)成本下降。優(yōu)化條件下預(yù)測(cè)頂體酶活性為18.5038 mU·mg prot-1，試驗(yàn)值為18.4839 mU·mg prot-1，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合較好，表明此法適用于蚯蚓物種，響應(yīng)面回歸模型的有效性得到驗(yàn)證[40]。

2.3 測(cè)定時(shí)間的選擇

建立的測(cè)定方法中，測(cè)定頂體酶活性依舊是一段時(shí)間內(nèi)頂體酶活性變化值，因此蚯蚓精子頂體酶活性測(cè)定法需探究反應(yīng)液隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)時(shí)，時(shí)間與吸光度變化值的線性關(guān)系。頂體酶活性隨時(shí)間變化的吸光度變化結(jié)果如圖2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，頂體酶活性在15 min內(nèi)對(duì)BAEE有極好的線性水解反應(yīng)。因此測(cè)定10 min的酶反應(yīng)速度能夠保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

圖2 蚯蚓精子頂體酶活性測(cè)定

2.4 方法學(xué)考察

蚯蚓儲(chǔ)精囊中蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考郭垠利[41]的方法，測(cè)定595 nm處吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為y=4.5014x-0.005，R2=0.9995。

醋酸棉酚暴露3 d后對(duì)蚯蚓精子頂體酶活性的影響如表3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蚯蚓精子密度從(8.61×107±0.75) 個(gè)·mL-1隨著醋酸棉酚濃度的增加衰減為(1.91×107±2.5) 個(gè)·mL-1，其精子被殺死、抑制效果越來(lái)越明顯。蚯蚓精子頂體酶活性從(18.15±0.89) mU·mg prot-1隨著醋酸棉酚濃度的增加衰減至(3.16±0.37) mU·mg prot-1。而精子頂體酶活性與精子密度之間存在線性關(guān)系，線性方程為y=2.1686x-0.3504，相關(guān)性為0.9908。因此，隨著精子密度的下降，其頂體酶活性也呈下降趨勢(shì)，結(jié)果表明，蚯蚓精子頂體酶活性可作為生殖指標(biāo)來(lái)檢測(cè)環(huán)境污染變化。

表3 醋酸棉酚對(duì)蚯蚓的影響

3 討論(Discussion)

精子獲能是正常受精的前提，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為頂體反應(yīng)。受精過(guò)程中具有完整頂體的精子才能成功受精，因此，精子頂體反應(yīng)檢測(cè)是精子質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]?？捡R斯亮藍(lán)法是目前檢測(cè)精子頂體反應(yīng)的常用方法，根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，考馬斯亮藍(lán)法可以用于不同動(dòng)物品種的頂體檢測(cè)，不僅適用于小鼠和人的精子，在其他種屬間中有一定的通用性[42-43]。近年來(lái)，Moller等[21]和Aarons等[22-23]采用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)小鼠精子頂體反應(yīng)，江一平等[24]將此法移用于人精子頂體反應(yīng)的檢測(cè)，并推廣到多種哺乳動(dòng)物精子頂體反應(yīng)的檢測(cè)。Larson和Miller[25]采用考馬斯亮藍(lán)染色法來(lái)檢測(cè)包括人、牛、豬、兔和小鼠等精子的頂體反應(yīng)，并采用經(jīng)典的熒光親和技術(shù)(PSA)證明其可靠性[43]。本研究結(jié)果表明，蚯蚓精子中也存在頂體反應(yīng)，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)到蚯蚓精子頂體率為47.67%±3.87%。

為了考察建立的蚯蚓精子頂體酶測(cè)定方法的可靠性，采用目前公認(rèn)的具有生殖毒性物質(zhì)的醋酸棉酚來(lái)對(duì)蚯蚓進(jìn)行土壤暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，蚯蚓在醋酸棉酚污染的土壤中暴露3 d后，就可以快速檢測(cè)出它的頂體酶活性的變化，而且活性變化與精子密度質(zhì)量的變化具有顯著的相關(guān)性(r=0.9908)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[44-45]，棉酚藥理作用機(jī)制是通過(guò)破壞雄性睪丸細(xì)精管的生精上皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致精子數(shù)量的減少，直至無(wú)精子產(chǎn)生，停藥后可恢復(fù)[46]，即頂體酶活性在判定精子的受精能力方面更具有客觀性[47]；Cui等[48]研究發(fā)現(xiàn)，精子頂體酶與精子繁育性能密切相關(guān)；Howes和Jones[49]認(rèn)為，頂體酶可以作為判斷動(dòng)物生育力的一項(xiàng)指標(biāo)。

蚯蚓頂體酶活性與目前常用于評(píng)價(jià)土壤污染物的生殖毒性相關(guān)指標(biāo)相比，蚯蚓頂體酶的響應(yīng)時(shí)間均優(yōu)于產(chǎn)卵量和孵化量等常用指標(biāo)[13]。如孵化量指標(biāo)需要56 d后才能檢出，產(chǎn)卵量指標(biāo)異常變化的檢出時(shí)間為28 d，而蚯蚓頂體酶活性的異常變化3 d后即可檢出。與產(chǎn)卵量和孵化量等常用的生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)相比，蚯蚓頂體酶指標(biāo)對(duì)污染監(jiān)測(cè)具有時(shí)效性和靈敏性的特點(diǎn)，與實(shí)驗(yàn)農(nóng)藥的毒性機(jī)理及可能產(chǎn)生的生態(tài)后果具有一定的相關(guān)性[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蚯蚓精子頂體酶可作為土壤污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及早期預(yù)警的可行的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，因此蚯蚓頂體效應(yīng)及其在土壤健康質(zhì)量診斷中的應(yīng)用具有重要意義，有望作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于土壤污染的生態(tài)毒理學(xué)快速診斷。