程亮亮,田 毅,譚義文,李美霞

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院麻醉與疼痛醫(yī)學(xué)科,?？?570208)

圍生期缺氧缺血性腦病是臨床常見病,是導(dǎo)致新生兒急性或慢性神經(jīng)功能損傷的重要原因。 據(jù)調(diào)查,我國約20%新生兒死亡是由于分娩窒息造成的,30%左右新生兒窒息導(dǎo)致聽力障礙、腦癱等永久性神經(jīng)功能障礙,給患兒家庭造成巨大影響[1]。 目前,臨床中對圍生期缺氧缺血的治療多以亞低溫結(jié)合其他方法的對癥治療,但效果不甚理想[2],因此,尋找有效的防治方法對降低該病發(fā)病率、減輕神經(jīng)功能損傷有重要臨床意義。 七氟醚屬于臨床新型麻醉藥,廣泛用于兒科麻醉鎮(zhèn)痛、麻醉誘導(dǎo)和術(shù)中維持[3-4]。 近年來研究發(fā)現(xiàn),七氟醚預(yù)處理可有效減輕中樞神經(jīng)損傷,對新生大鼠缺氧缺血性腦病具有腦保護(hù)作用[5],但關(guān)于七氟醚分娩鎮(zhèn)痛對新生鼠缺氧的改善作用及調(diào)控通路仍需要進(jìn)一步探討。本研究采用前列腺素誘導(dǎo)分娩窒息模型,給予七氟醚吸入處理進(jìn)行分娩鎮(zhèn)痛,觀察七氟醚對新生子鼠缺氧的影響,并進(jìn)一步探討其調(diào)控機(jī)制,為臨床新生兒缺氧缺血性腦病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級發(fā)情期 SD 大鼠 12 只,均 8 周齡,其中雄性 4 只,體重 250 ～ 270 g,雌性 8 只,體重 180 ～ 220 g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(粵)2018-0002],飼養(yǎng)于海南省藥物安全性評價研究中心[SYXK(瓊)2016-0013]。 飼養(yǎng)于 22℃ ～25℃,50%～60%濕度,12 h 明暗交替環(huán)境,自由進(jìn)食和飲水。動物實(shí)驗(yàn)通過海南省藥物安全性評價研究中心動物倫理委員會批準(zhǔn)(2018-020),實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循動物使用的3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(北京邁瑞達(dá)科技有限公司);Revert AidTM第一鏈 cDNA Synthesis 試劑盒(美國 Thermo公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);尼氏染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔抗大鼠MAPK、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease-3,Caspase-3)單抗(一抗)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(美國Abcam 公司);RM2235 徠卡切片機(jī)(德國Leica Biosystems 公司);7500 Fast 實(shí)時熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems 公司);CheniDoc XRS 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備及分組

以雄性:雌性1 ∶2合籠飼養(yǎng),陰道涂片法確認(rèn)雌鼠妊娠第1 天[6-7],選取6 只妊娠雌鼠入組,隨機(jī)分為自然分娩組、模型組和七氟醚組,各2 只。 模型組、七氟醚組大鼠妊娠第21 天靜脈注射5 mg/kg 前列腺素誘發(fā)分娩窒息,待大鼠宮縮開始時,模型組給予50%體積分?jǐn)?shù)的氧氣,七氟醚組持續(xù)給予50%體積分?jǐn)?shù)的氧氣和體積分?jǐn)?shù)2.5%七氟醚;自然分娩組大鼠不干預(yù)自然分娩。 3 組各娩出12 只子鼠,其中模型組娩出1 只死鼠,予以剔除,自然分娩組、模型組和七氟醚組分別納入12、11、12 只新生子鼠。

1.3.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

出生后14 d 各組新生子鼠進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn):水迷宮水溫控制在20℃～24℃,水池分為4 個象限,并在第三象限放置直徑12 cm 的安全平臺,沒于水下1.5 cm,水池中加入二氧化硅制成白色乳液將安全平臺隱蔽,每象限標(biāo)記1 個入水點(diǎn);出生后14～18 d 定位巡航實(shí)驗(yàn):隨機(jī)選取1 個入水點(diǎn),將新生子鼠面壁輕放入水,60 s 內(nèi)登陸安全平臺則拿出新生子鼠擦干水分,放置保溫箱,若60 s 內(nèi)未找到則人工引導(dǎo)其登陸安全平臺,并停留15 s;30 min 后順時針繼續(xù)其他象限入水,每天4 次。 出生后19 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):撤去安全平臺,隨機(jī)選擇入水象限,記錄60 s 內(nèi)的游泳軌跡,軟件分析大鼠在目標(biāo)象限(第三象限)停留時間及穿越目標(biāo)象限內(nèi)安全平臺的次數(shù)。

1.3.3 血清SOD、MDA 水平檢測

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,眼眶靜脈叢采血2 mL,靜置后分層,3 000 r/min 離心8 min,離心半徑10 cm,取上層血清,采用試劑盒檢測血清 SOD、MDA 水平,按照試劑盒說明書步驟操作。

1.3.4 腦組織海馬CA1 區(qū)尼氏染色

靜脈采血后,斷頭處死各組新生子鼠,冰上取左側(cè)海馬區(qū)腦組織,放入體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定48 h,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度7 μm),石蠟切片脫臘入水,加入甲基紫染色液,室溫染色20 min,蒸餾水徹底沖洗,切片乙醇梯度脫水(70%→80%→90%→95%→100%),轉(zhuǎn)入分色液4 ～8 s,然后浸入無水乙醇中2 min(2 次),二甲苯透明3 min(2 次),中性樹膠封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目,以神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)呈藍(lán)色均勻斑塊狀為陽性細(xì)胞。

1.3.5 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)量檢測

斷頭處死各組新生子鼠,冰上取右側(cè)海馬區(qū)腦組織75 mg,應(yīng)用TRIzol 試劑提取組織中的總RNA,采用Revert AidTM第一鏈 cDNA Synthesis 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,然后SYBR Green I 實(shí)時PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件設(shè)置為:94℃預(yù)變性2 min;94℃20 s,58℃45 s,72℃60 s,重復(fù) 40 循環(huán)。 以 βactin 為內(nèi)參對照,計(jì)算 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3相對表達(dá)強(qiáng)度(2-△△CT)。 引物序列:MAPK:F:5′-ACTGTGCCATGCTGATCG-3′,R:5′-CTGATGCTGAG CTGATGC-3′;Bax:F:5′-AGCGACTGAG CGATGCTG-3′,R:5′-ATGCGTTGATAGCTGAGA-3′;Bcl-2:F:5′-CTGATGAACTGATAGCCTGGG-3′,R:5′-CTGATGCT GGCTGAGATGCTG-3′; Caspase-3: F: 5′-CTGATGC TGAACTGCATGC-3′,R:5′-CTGAGTGCCTGACTGCT GA-3′;β-actin:F:5′-TAGCTCTGCTGGATGCTACTA-3′,R:5′-CTAGTCGTGATGCTGATGTGA-3′。

1.3.6 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)量檢測

取右側(cè)海馬區(qū)腦組織50 mg,加入0.5 mL 組織裂解液于冰上裂解25 min,4℃預(yù)冷離心機(jī)12000 r/min 離心18 min,離心半徑12 cm,取上清液進(jìn)行BCA 蛋白定量,取 20 μg 蛋白與 80 μg 上樣緩沖液混勻,沸水浴10 min,常溫12000 r/min 離心15 min,離心半徑12 cm,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(200 mA、90 min),TBST 洗滌5 min×3 次;加入封閉液封閉2.5 h,按照一抗說明書加入稀釋一抗 [MAPK(1 ∶200),Bax(1 ∶500),Bcl-2、Caspase-3(1 ∶300)],4℃ 搖床孵育約 12 h,TBST 洗滌 3 次;加入 HRP 標(biāo)記的二抗稀釋液(1 ∶5000),室溫孵育2.5 h,TBST 洗滌3 次,于暗室中進(jìn)行顯影、曝光;應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片采集,使用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析,計(jì)算MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白與內(nèi)參 β-actin 灰度值比值,計(jì)算Bcl-2/Bax。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多樣本比較采用單因素方差分析,兩樣本比較采用 SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠分娩情況觀察

自然分娩組、模型組、七氟醚組分別納入12、11、12 只新生子鼠;自然分娩組12 只新生子鼠精神正常,反應(yīng)迅速,均能夠正常吮吸母乳;模型組11 只新生子鼠精神萎靡不振,反應(yīng)遲鈍,吮吸母乳減少;七氟醚組12 只新生子鼠精神、反應(yīng)及吮吸母乳量均有所改善。

2.2 各組新生子鼠目標(biāo)象限停留時間、穿越平臺次數(shù)比較

目標(biāo)象限停留時間、穿越平臺次數(shù)組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組及七氟醚組目標(biāo)象限停留時間短于自然分娩組,穿越平臺次數(shù)少于自然分娩組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);七氟醚組目標(biāo)象限停留時間長于模型組,穿越平臺次數(shù)多于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組新生子鼠血清SOD、MDA 水平比較

新生子鼠血清SOD、MDA 水平組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組及七氟醚組新生子鼠血清SOD 水平低于自然分娩組,血清MDA 水平高于自然分娩組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);七氟醚組新生子鼠血清SOD 水平高于模型組,血清MDA 水平低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表 2。

2.4 各組新生子鼠腦組織海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目比較

尼氏染色顯示,自然分娩組新生子鼠海馬神經(jīng)元及尼氏小體豐富,椎體細(xì)胞層排列有序;模型組海馬神經(jīng)元數(shù)目減少,淺染,尼氏小體丟失,椎體細(xì)胞層排列紊亂,七氟醚組上述改變均緩解。 自然分娩組、模型組及七氟醚組新生子鼠海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目分別為每平方毫米(213.20±16.17)個、每平方毫米(67.00±8.90)個、每平方毫米(153.20±12.24) 個,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=317.531,P＜0.001);模型組及七氟醚組新生子鼠海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目均少于自然分娩組(t=371.531、10.249,P＜0.001),七氟醚組新生子鼠海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目多于模型組(t=19.157,P＜0.001)。 見圖 1。

2.5 各組新生子鼠腦組織 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量比較

新生子鼠腦組織 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組及七氟醚組新生子鼠腦組織Bcl-2 mRNA 相對表達(dá)量低于自然分娩組,腦組織MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量高于自然分娩組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);七氟醚組新生子鼠腦組織Bcl-2 mRNA 相對表達(dá)量高于模型組,腦組織 MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表3。

2.6 各組新生子鼠腦組織 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量比較

腦組織 MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax 組間比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組及七氟醚組腦組織Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax 低于自然分娩組,腦組織MAPK、Bax、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量高于自然分娩組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);七氟醚組腦組織Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax 高于模型組,腦組織 MAPK、Bax、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表4,圖 2。

3 討論

圍生期胎兒由于大腦尚未發(fā)育完全,神經(jīng)細(xì)胞對缺氧敏感性更高,導(dǎo)致的損害更大,可能引起不可逆性神經(jīng)功能障礙[8]。 分娩過程易導(dǎo)致圍生兒缺氧,其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確,有研究認(rèn)為,產(chǎn)婦分娩時神經(jīng)內(nèi)分泌水平異常改變,機(jī)體兒茶酚胺水平驟然升高,可能引起子宮、胎盤血流量驟減,從而易導(dǎo)致胎兒缺氧[9];此外,分娩疼痛可導(dǎo)致產(chǎn)婦過度緊張和呼吸性堿中毒,母體血紅蛋白釋放氧氣能力下降,加重胎盤缺氧情況[10]。 因此,分娩鎮(zhèn)痛對緩解產(chǎn)婦緊張、提升胎盤血流量并降低胎兒缺氧風(fēng)險十分重要。

表1 各組新生子鼠目標(biāo)象限停留時間、穿越平臺次數(shù)比較(ˉx±s)Table 1 Comparison of target quadrant dwell time and number of times of crossing the platform of newborn rats in each group

表2 各組新生子鼠血清SOD、MDA 水平比較(ˉx±s)Table 2 Comparison of serum SOD and MDA levels of newborn rats in each group

圖1 腦組織海馬CA1 區(qū)尼氏染色Note. A, Natural delivery group. B, Model group. C, Sevoflurane group.Figure 1 Nissl staining of the hippocampal CA1 area of brain tissue

表3 各組新生子鼠腦組織MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)量比較(ˉx±s)Table 3 Comparison of the relative expressions of MAPK, Bax, Bcl-2 and Caspase-3 mRNA in the brain tissue of newborn rats

表4 各組新生子鼠腦組織MAPK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量比較(xˉ±s)Table 4 Comparison of the relative expressions of MAPK, Bax, Bcl-2 and Caspase-3 proteins in the brain tissue of newborn rats

圖2 蛋白免疫印跡圖Note. A, Natural delivery group. B, Model group. C,Sevoflurane group.Figure 2 Immunoblotting pictures of protein

臨床調(diào)查顯示,分娩期宮縮過強(qiáng)、產(chǎn)程延長等因素均可引起急性胎兒窘迫,進(jìn)而導(dǎo)致新生兒缺氧缺血腦損傷發(fā)生風(fēng)險升高[11-12]。 分娩疼痛作為重要的應(yīng)激源,可能引起產(chǎn)婦宮縮過強(qiáng)、產(chǎn)程延長,七氟醚是近年來新型吸入麻醉、鎮(zhèn)痛劑,吸收和清除較為迅速,且神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)少[13]。 分娩期間應(yīng)用七氟醚全麻,有助于緩解子宮過度收縮,縮短產(chǎn)程,從而降低胎兒缺氧缺血腦損傷風(fēng)險,間接發(fā)揮胎兒腦保護(hù)作用[14]。 SOD 是機(jī)體重要的抗氧化酶,具有清除自由基阻斷氧化損傷的作用;MDA 屬于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,反映機(jī)體氧化損傷水平。 本研究發(fā)現(xiàn),與自然分娩組比較,模型組新生子鼠目標(biāo)象限停留時間縮短,穿越平臺次數(shù)、海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目均減少,血清SOD 水平降低,MDA 水平升高,說明孕鼠分娩窒息可導(dǎo)致新生鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降、海馬神經(jīng)元損傷及氧化應(yīng)激損傷;應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)2.5%七氟醚處理后,結(jié)果顯示新生子鼠目標(biāo)象限停留時間延長,穿越平臺次數(shù)、海馬CA1 區(qū)尼氏小體數(shù)目均增多,血清SOD 水平升高,MDA 水平降低,提示七氟醚可有效改善新生鼠學(xué)習(xí)記憶能力,分析原因可能為七氟醚通過減輕分娩疼痛造成的胎鼠供氧供血不足,從而有效緩解海馬神經(jīng)元損傷及氧化應(yīng)激損傷。

神經(jīng)元細(xì)胞損傷過程涉及多條信號通路,MAPK 信號是其中重要的通路之一[15-16]。 研究發(fā)現(xiàn),缺氧缺血腦損傷后,MAPK 被過度激活,可通過刺激下游Bcl-2、Bax 及Caspase-3 線粒體相關(guān)凋亡通路,進(jìn)而使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡通路激活[17]。 李恒杰等[18]研究表明,七氟醚可通過激活心臟驟停大鼠腦組織中 Bcl-2 表達(dá),抑制 Bax 的表達(dá),上調(diào) Bcl-2/Bax,從而意識海馬神經(jīng)元凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用,與本研究結(jié)果相似。 本研究中,與自然分娩組比較,模型組新生子鼠腦組織Bcl-2 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量及 Bcl-2/Bax 降低,MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量升高,說明孕鼠分娩窒息可導(dǎo)致新生鼠MAPK 信號通路激活;應(yīng)用七氟醚干預(yù)后,新生子鼠腦組織Bcl-2 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量 及 Bcl-2/Bax 升 高, MAPK、 Bax、 Caspase-3 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量降低,提示七氟醚可有效抑制MAPK 信號通路及其下游凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),從而發(fā)揮心生鼠缺氧腦保護(hù)作用。

綜上所述,七氟醚分娩鎮(zhèn)痛可有效改善新生鼠缺氧缺血腦損傷狀況,可能通過抑制MAPK 信號通路,從而抑制海馬神經(jīng)元損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用,為臨床中七氟醚分娩鎮(zhèn)痛改善預(yù)防新生兒缺氧缺血腦損傷提供理論基礎(chǔ)。