陳沛芬，賴瑾瑜，陳俊君

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院，廣東東莞 523059

流行病學(xué)調(diào)查顯示，乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發(fā)病率約占甲狀腺癌的80%，10年生存率＞90%［1］；但部分患者腫瘤侵襲性強，易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病死率增加。既往臨床篩查及早期診斷PTC較為有效方法為細針穿刺細胞學(xué)活檢，但仍存在一些假陰性及難確診病例，診斷特異度不甚理想。因此，探尋一種合理有效的早期診斷預(yù)警手段是當(dāng)前PTC的研究重點。超聲彈性成像技術(shù)可有效反映組織形變能力，客觀、真實且量化反映病灶與附近組織彈性硬度差別，從而為甲狀腺病變定性提供一定診斷依據(jù)［2］。大量研究表明，微小RNA（miRNA）會破壞癌基因與抑癌基因的平衡從而參與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展［3］，客觀反映惡性腫瘤的侵襲程度［4］。2019年6月—12月，我們分析了超聲彈性成像參數(shù)聯(lián)合miR-663、miR-221診斷PTC的價值，并通過分析其與PTC組織中增殖、侵襲、自噬基因表達的關(guān)系，以探討其可能的病理學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)東莞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選取我院同期收治的PTC及甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PTC符合《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療專家共識（2016版）》［5］的診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)病理證實，甲狀腺良性結(jié)節(jié)經(jīng)病理診斷確診為良性結(jié)節(jié)；②臨床資料均完整；③患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有甲狀腺手術(shù)史；②合并頸部局部或全身感染性疾??；③近期有免疫調(diào)節(jié)劑、激素類藥物服用史或腫瘤治療史；④合并肝腎功能異?；蜓合到y(tǒng)疾病；⑤合并甲狀腺彌漫性病變、橋本甲狀腺炎或甲狀腺功能亢進；⑥精神行為異常。共收集甲狀腺疾病患者352例，其中患者PTC（惡性組）、甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者（良性組）各176例。惡性組中男69例、女107例，年齡（47.75±2.96）歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期70例、Ⅲ～Ⅳ期106例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移96例；良性組中男72例、女104例，年齡（48.11±3.15）歲。兩組年齡、性別具有可比性。

1.2 超聲彈性成像參數(shù)獲取 采用MyLab 90彩色多普勒超聲診斷儀，選取LA523探頭，頻率5～13MHz。患者取仰臥位，顯露頸部。先實施二維灰階超聲檢查，確認(rèn)結(jié)節(jié)位置與大小。后切換至彈性成像檢查，以結(jié)節(jié)為中心選取感興趣區(qū)（ROI），主要囊括結(jié)節(jié)及周圍正常組織；探頭與皮膚呈垂直狀態(tài)，手持探頭，輕微震動，頻率為2～4次/秒；待“彈簧”圖標(biāo)呈綠色，繼續(xù)穩(wěn)持3～4 s；反復(fù)實施3次，取得良好彈性成像圖像。由2位具備＞5年經(jīng)驗的醫(yī)師進行圖像分析，定量參數(shù)取平均值。彈性比值：在彈性成像圖像上手動圈定ROI（盡量包含全部病灶）及對照區(qū)域，兩者深度盡量在同一平面且面積基本相似，軟件自動獲取彈性圖像ROI與對照區(qū)比較所得彈性比值。藍色面積比值：沿結(jié)節(jié)及其內(nèi)藍色區(qū)域邊緣對輪廓進行勾畫，軟件分析計算藍色面積所占ROI的比值。

1.3 血漿miR-663、miR-221檢測 采集靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中；以3 000 r/min離心10 min，分離血漿后再以12 000 r/min離心10 min，取上清置于微量離心管（不含RNA酶）中，-80℃低溫保存待檢。采用qRT-PCR法檢測血漿miR-663、miR-221，按試劑盒說明書操作，相對表達水平以2-ΔΔCt方法計算。

1.4 甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達檢測 留取組織標(biāo)本，添加TRIzol試劑、氯仿裂解細胞；4℃下以12 000 r/min離心15 min，取無色液相層；添加等體積異丙醇，沉淀RNA生成膠塊。以75%乙醇對RNA沉淀進行清洗，室溫干燥后采用紫外光吸收法檢測總RNA純度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成樣品cDNA，用RT-PCR試劑盒實施增殖基因（Twist1、TPX2）、侵襲基因（CXCR4、ADAM9）、自噬基因（Beclin1、LC3）mRNA擴增，獲取反應(yīng)后PCR擴增曲線，計算目標(biāo)基因mRNA表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，組間比較行t檢驗；各指標(biāo)診斷PTC的價值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，各指標(biāo)與PTC組織中增殖、侵襲、自噬基因表達的關(guān)系行Pearson線性相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較 惡性組藍色面積比值、彈性比值及血漿miR-221水平高于良性組，而血漿miR-663水平低于良性組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

表1 兩組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

注：與良性組比較，*P＜0.05。

組別惡性組良性組n 176 176藍色面積比值（%）45.36±15.48*33.82±13.65彈性比值1.76±0.59*1.31±0.38血漿miR-663 2.52±1.04*3.97±1.25血漿miR-221 0.87±0.14*0.32±0.07

2.2 惡性組不同臨床病理特征患者超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較 惡性組臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者藍色面積比值、彈性比值、血漿miR-221水平高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，血漿miR-663水平低于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P均＜0.05）。見表2。

2.3 超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221診斷PTC的價值 超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221單一、聯(lián)合診斷均有較高曲線下面積（AUC），尤以聯(lián)合診斷最高。見表3。

表2 惡性組不同臨床病理特征患者超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

表2 惡性組不同臨床病理特征患者超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221水平比較（±s）

注：與臨床分期Ⅰ～Ⅱ期者比較，*P＜0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較，#P＜0.05。

臨床病理特征臨床分期Ⅲ～Ⅳ期Ⅰ～Ⅱ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無n 106 70 96 80藍色面積比值（%）51.68±16.47*35.79±15.28 52.35±16.70#36.97±13.94彈性比值2.24±0.63*1.03±0.52 2.35±0.69#1.05±0.51血漿miR-663 1.94±0.89*3.40±1.15 1.86±0.89#3.31±1.17血漿miR-221 1.03±0.11*0.63±0.16 1.06±0.13#0.64±0.17

表3 超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221單一、聯(lián)合診斷PTC的價值

2.4 兩組甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達量比較 惡性組組織中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9表達量高于良性組，LC3、Beclin1表達量低于良性組（P均＜0.05）。見表4。

表4 兩組甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達量比較（±s）

表4 兩組甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達量比較（±s）

注：與良性組比較，*P＜0.05。

組別惡性組良性組n 176 176 Twist1 mRNA 117.62±13.57*90.84± 9.50 TPX2 mRNA 141.74±14.05*105.26±11.67 CXCR4 mRNA 131.29±15.72*107.68±12.37 ADAM9 mRNA 124.37±15.59*93.63±10.54 LC3 mRNA 63.29± 7.98*96.38±10.61 Beclin1 mRNA 78.49± 8.51*113.46±13.83

2.5 惡性組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221與甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達量的相關(guān)性 Pearson分析顯示，惡性組藍色面積比值、彈性比值、血漿miR-221水平與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9表達量呈正相關(guān)，與LC3、Beclin1表達量呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05）；血漿miR-663水平與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9表達量呈負(fù)相關(guān)，與LC3、Beclin1表達量呈正相關(guān)（P均＜0.05）。見表5。

表5 惡性組超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221與甲狀腺病變組織中增殖、侵襲、自噬基因表達量的相關(guān)性

3 討論

近年來，甲狀腺超聲憑借分辨率高、可重復(fù)性、無創(chuàng)等優(yōu)勢已成為臨床篩查PTC首選輔助檢查手段。超聲彈性成像是新型超聲檢查手段，借助人體組織在壓力作用下會發(fā)生形變原理，利用病灶組織及周圍正常組織間彈性差異，從而分辨有關(guān)組織彈性或硬度屬性，對甲狀腺結(jié)節(jié)具有潛在診斷價值［6-7］。BARDET等［8］研究發(fā)現(xiàn)，超聲彈性成像通過應(yīng)變率比值等定量指標(biāo)，有助于反映甲狀腺癌組織與同層正常甲狀腺組織硬度差異。本研究結(jié)果顯示，與甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者比較，PTC患者藍色面積比值、彈性比值更高，且隨臨床分期增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)明顯增長趨勢。這與張鵬等［9］研究觀點基本一致，惡性結(jié)節(jié)纖維組織大量增殖及腫瘤組織缺血可能是誘導(dǎo)局部區(qū)域彈性比值、藍色面積比值升高的主要機制。繪制ROC曲線顯示，當(dāng)彈性比值臨界值設(shè)定為1.37時，其診斷PTC的敏感度為82.96%。這提示超聲彈性成像對甲狀腺病變的判定具有良好前景，有望成為診斷PTC的有效影像學(xué)方法。另外，文獻報道，腫瘤細胞促增殖基因與抗增殖基因表達紊亂是腫瘤細胞惡性增殖的主要原因［10］，而侵襲基因異常表達參與腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移，是腫瘤惡性進展的核心原因［11］；同時，自噬也是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的重要方式［12］。經(jīng)Pearson線性相關(guān)分析，PTC藍色面積比值、彈性比值與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9 mRNA表達量存在正相關(guān)關(guān)系，與LC3、Beclin1 mRNA表達量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明超聲彈性成像參數(shù)可有效反映PTC腫瘤細胞的增殖、侵襲、自噬活性，為其診斷及評估腫瘤惡性生物學(xué)行為提供了一定病理學(xué)依據(jù)。

miR-663、miR-221屬于miRNA成員，其可通過調(diào)節(jié)腫瘤增殖、凋亡、侵襲、自噬等相關(guān)基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前，一般認(rèn)為miR-221具有促癌作用，而miR-663在不同腫瘤類型中可發(fā)揮腫瘤抑制或促進作用［13］。本研究結(jié)果顯示，惡性組血漿miR-221水平升高而miR-663水平降低，且臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者變化更顯著。這與相關(guān)報道結(jié)果一致［14］，表明miR-663、miR-221參與PTC的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-221可抑制p27 kip1蛋白表達，調(diào)控腫瘤細胞周期，并通過抑制長壽保障基因、蛋白絡(luò)氨酸磷脂酶等表達，繼而參與PTC腫瘤細胞的分化、成長及轉(zhuǎn)移過程；miR-663表達下調(diào)可導(dǎo)致對腫瘤細胞的抑制能力減弱，腫瘤細胞生長能力增強，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果也顯示，血漿miR-221水平 與PTC組 織 標(biāo) 本 中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9mRNA表達量呈正相關(guān)，與LC3、Beclin1mRNA表達量呈負(fù)相關(guān)；而血漿miR-663水平與組織標(biāo)本中Twist1、TPX2、CXCR4、ADAM9 mRNA表達量呈負(fù)相關(guān)，與LC3、Beclin1表達量呈正相關(guān)。因此，miR-221、miR-663可通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲、自噬基因表達，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移。基于上述病理學(xué)基礎(chǔ)，我們進一步分析其診斷價值。ROC曲線顯示，血漿miR-221、miR-663診斷PTC特異度為均小于73%，雖具有較一定診斷價值，但單獨應(yīng)用仍有一定局限性。故本研究采取聯(lián)合診斷模式，藍色面積比值、彈性比值及血漿miR-663、miR-221聯(lián)合診斷PTC的AUC為0.883，敏感度為80.11%，特異度為83.52%，充分說明三者聯(lián)合對提高PTC診斷價值具有積極意義，而其與PTC組織中增殖、侵襲、自噬基因表達相關(guān)是其診斷的病理學(xué)基礎(chǔ)。因此，超聲彈性成像參數(shù)及血漿miR-663、miR-221聯(lián)合檢測可作為鑒別診斷甲狀腺疾病良惡性的有效輔助手段。