陳鳳霞，楊天偉，李杰慶，劉鴻高，范茂攀, ，王元忠

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南昆明 650200；3.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

現(xiàn)代工業(yè)化發(fā)展加劇了重金屬污染，其中工業(yè)廢水、汽車尾氣排放、農(nóng)藥化肥殘留、礦產(chǎn)資源開發(fā)成為主要污染來源[1?2]。重金屬在大氣、土壤、生物中分布廣泛，難以降解，較強的富集性、持久性和不可逆轉(zhuǎn)性使重金屬污染問題日趨嚴(yán)重[3]。重金屬通過生物鏈進入人體，與人體中蛋白質(zhì)和酶發(fā)生相互作用，影響人體正常機能，此外，還能積蓄在器官中，造成慢性中毒，危害人體健康[4]。Cd、As、Pb 均被列入美國環(huán)保署（United States Environmental Protection Agency）有害空氣污染物名單。Cd 攝入過多會導(dǎo)致腎損害及心血管疾病[5]。美國毒物和疾病登記署（ATSDR）與國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將Cd 歸類為第7 位危害人體健康的物質(zhì)和人類致癌物。過量的As 會損害腸胃與皮膚病[6]，Pb 則會損害腦細胞，影響胎兒發(fā)育[7]。

菌類具有修復(fù)污染土壤及固體廢物、參與化合物有機質(zhì)的降解與轉(zhuǎn)化的功能，具有較強的重金屬富集能力，也可用于生物監(jiān)測，評價產(chǎn)區(qū)重金屬污染水平[8?10]。我國食用菌資源豐富，根據(jù)中國報告網(wǎng)及中國海關(guān)統(tǒng)計2019 年食用菌總產(chǎn)量3961.91 萬噸，出口金額達到3323947 千美元，具有較大的經(jīng)濟價值。然而，國內(nèi)外研究中食用菌重金屬超標(biāo)問題卻屢見不鮮[11?13]。Liu 等[14]測定云南16 個地區(qū)食用菌7 種重金屬含量，結(jié)果顯示，云南食用菌重金屬污染嚴(yán)重，As、Pb、Cd 含量超出國家標(biāo)準(zhǔn)值。Sun 等[15]測定云南40 個地區(qū)8 種野生食用牛肝菌元素含量，其中包括重金屬元素Pb、Cd，結(jié)果表明，牛肝菌中Pb 元素范圍在0.41～0.70 mg/kg 之間，低于法定限值，Cd 元素在0.51～15.14 mg/kg 之間，明顯超出法定限值；灰褐牛肝菌對Cd 的富集能力較強，Cd 是牛肝菌中主要的重金屬來源。Zhang 等[16]采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定云南三種野生菌礦質(zhì)元素含量，并對其重金屬元素As、Cd、Pb 進行健康風(fēng)險評估，結(jié)果表明，部分樣品重金屬含量高于糧農(nóng)組織/衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會建議的限度，云南牛肝菌科蘑菇有毒元素含量偏高。我國菌類重金屬研究較為單一，本文對牛肝菌重金屬進行了多種分析，包括子實體重金屬含量分析、污染情況和食用風(fēng)險評價。

Kokkoris 等[17]測定了希臘地區(qū)6 種野生菌和土壤重金屬元素，發(fā)現(xiàn)蘑菇中Pb、Ni 含量較高，有毒重金屬Pb 含量范圍為2.80～8.43 mg/kg 之間，超過法定限量，存在食用潛在風(fēng)險。Igbiri 等[18]對尼日利亞尼日爾三角洲地區(qū)三種食用菌重金屬進行健康風(fēng)險評估，結(jié)果顯示食用菌中重金屬含量超過規(guī)定攝入量，Ni 含量超標(biāo)，具有一定致癌風(fēng)險。Schlecht 等[19]測定了德國柏林地區(qū)野生食用菌中重金屬元素Cd、Pb 含量，結(jié)果表明，大部分野生蘑菇樣品中兩種重金屬含量均超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)。在相關(guān)菌類重金屬研究文獻中，研究人員對菌類重金屬含量及影響進行了大量的研究分析，但卻忽略了不同污染評價方法和國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致結(jié)果的差異性。本文中的研究內(nèi)容分析角度全面，彌補了以往研究中的不足，較為新穎。

測定云南9 種牛肝菌不同部位有毒重金屬As、Cd、Pb 含量，利用單因子污染指數(shù)、內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)和相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)評價牛肝菌重金屬污染與健康風(fēng)險，以期為云南牛肝菌資源開發(fā)與消費者合理膳食提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰褐牛肝菌（A）40 份、美味牛肝菌（B）60 份、皺蓋疣柄牛肝菌（C）40 份、磚紅絨蓋牛肝菌（D）26 份、絨柄牛肝菌（E）47 份、金黃柄牛肝菌（F）19 份、灰疣柄牛肝菌（G）17 份、紅疣柄牛肝菌（H）20 份、黑絨蓋牛肝菌（I）21 份。牛肝菌共計290 份，采自于云南各個地區(qū)，詳情見圖1 和表1，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授進行品種鑒定。將不同種類不同地區(qū)的牛肝菌樣品進行分類，使用陶瓷刀去除表面雜物及泥土，自來水清洗干凈后用蒸餾水潤洗三遍。菌蓋與菌柄分開置于烘箱中50 ℃烘干至恒重。粉碎后過100 目標(biāo)準(zhǔn)篩，置于自封袋備用；65% HNO3、30%H2O2廣東西隴化工股份有限公司；茶葉標(biāo)準(zhǔn)物GBW07605 地礦部物化探研究所；元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液 濟南眾標(biāo)科技有限公司；超純水（電阻率>18.25 MΩ.cm）。

圖1 云南省牛肝菌采樣點示意圖Fig.1 Sketch map of Boletaceae sampling points in Yunnan Province

表1 9 種牛肝菌樣品代號及產(chǎn)地Table 1 Sample code and origin of 9 boletus mushroom samples

ICPE-9000 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀 日本島津公司；FW-100 型高速粉碎機 天津市華鑫儀器廠；101A-1 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海崇明實驗儀器廠；Mars6 微波消解儀 美國CEM 公司；UPT-I-10 超純水機 優(yōu)譜科技有限公司；奧豪斯電子分析天平 Ohaus 儀器有限公司；100 目不銹鋼篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肝菌重金屬元素測定 每份樣品粉末準(zhǔn)確稱取300 mg 置于微波消解罐，加入5 mL HNO3與3 mL H2O2微波消解儀進行消解，微波消解條件設(shè)置為4 步驟，功率和升溫時間均為1500 kW 與5 min，溫度設(shè)置分別為120、150、170、180 ℃。消解完畢冷卻并使用超純水定容25 mL，搖勻澄清待測。相同方法消解茶葉標(biāo)準(zhǔn)物，制備空白對照，使用HNO3將各元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成0.00、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL 建立元素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 牛肝菌重金屬污染評價

內(nèi)梅羅（Nemero）綜合污染指數(shù)法主要用于評估水質(zhì)、土壤、食品重金屬污染水平，也是常見的污染評價方法[20?21]。單因子污染指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為：Pi≤1無污染、13 重污染。內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為：Psum≤0.7安全，清潔、0.73 重污染，受到嚴(yán)重污染。本文采用單因子污染指數(shù)法和內(nèi)梅羅（Nemero）綜合污染指數(shù)法對每種牛肝菌樣品進行重金屬污染評價。

其污染指數(shù)計算公式如下[22?23]：

注：公式（1）中Pi為牛肝菌中重金屬i 的污染指數(shù)；Ci為牛肝菌重金屬i 的實測濃度；Si為牛肝菌重金屬i 的評價標(biāo)準(zhǔn)值（根據(jù)《GB2762-2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》）。公式（2）中Psum為某產(chǎn)地牛肝菌綜合污染；表示牛肝菌中重金屬i 單因子污染指數(shù)平均值；Pimax表示牛肝菌中重金屬i 的污染指數(shù)最大值。

1.4 牛肝菌的潛在健康風(fēng)險評估

2010 年FAO/WHO JECFA 取消了原先制定的Pb 暫定每周可耐受攝入量25 μg/kg 與As 每周最大耐受攝入量0.015 mg/kg，并認為人體對Pb、As 暴露量越低越好，無法確定限量標(biāo)準(zhǔn)對人體健康進行有效保護?？紤]到數(shù)據(jù)分析的局限性，本研究仍采用2010 年之前對于Cd、Pb、As 的每周可耐受攝入限量標(biāo)準(zhǔn)，分別為：Cd≤0.007 mg/kg、As≤0.015 mg/kg、Pb≤0.025 mg/kg。

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2014 軟件初步整理后運用SPSS18.0 進行描述統(tǒng)計與相關(guān)性分析，采用目標(biāo)危害系數(shù)法（THQ）計算攝入風(fēng)險。其風(fēng)險評估計算相關(guān)公式為[24]：

注：公式（3）中THQi為重金屬i 的目標(biāo)危害系數(shù)；BW 為消費者體重（60 kg）；ED 為牛肝菌暴露年限（70 年）；EFR為牛肝菌暴露頻率（365）；FIR為牛肝菌日攝入量；AT 為牛肝菌平均作用時間（ED×365）；Ci為牛肝菌中重金屬i 濃度；RfD 為重金屬每日最大耐受攝入量標(biāo)準(zhǔn)；TTHQ 為綜合目標(biāo)危害商數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

在元素含量測定中，每個樣品重復(fù)三次，每測定三個樣品進行一次空白試驗對照用于減少儀器的不穩(wěn)定性以減少誤差。元素數(shù)據(jù)使用Excel 2007 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，采用Epess Statics 20 單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 元素測定方法準(zhǔn)確性分析

如表2 所示，三種元素Cd、Pb、As 測定波長分別為214.438、220.353、189.042 nm，檢出限0.0104、0.1243、0.5634 μg/L。樣品元素回收率在105%、95%、93.1%，標(biāo)準(zhǔn)物元素測定值與標(biāo)準(zhǔn)值非常相近，分別在0.060 與0.057 mg/kg、4.2 與4.4 mg/kg、0.283 與0.280 mg/kg，說明此方法準(zhǔn)確可靠。

2.2 不同部位牛肝菌Cd、Pb、As 含量分析

牛肝菌味道鮮美，富含多種維生素和礦質(zhì)元素，但牛肝菌對重金屬也具有較強的富集能力，重金屬超標(biāo)會使人體健康受到影響。牛肝菌菌蓋、菌柄中重金屬含量及重金屬比值見表3。牛肝菌菌蓋Cd、Pb、As 含量在0.36～20.89 mg/kg、0.21～4.42 mg/kg、0.26～13.33 mg/kg 之間。牛肝菌菌柄Cd、Pb、As 含量在0.07～19.91 mg/kg、0.59～18.48 mg/kg、0.29～17.10 mg/kg 之間。牛肝菌不同部位對重金屬的吸收存在差異性。對相同種類、部位不同產(chǎn)地牛肝菌進行差異性分析，發(fā)現(xiàn)大部分牛肝菌重金屬含量具有顯著性差異（P<0.05），牛肝菌對重金屬元素的富集可能與產(chǎn)地有關(guān)。Schlecht 等[19]測定了德國柏林地區(qū)野生食用菌中重金屬元素Cd、Pb 含量，結(jié)果表明，大部分野生蘑菇樣品中兩種重金屬含量均超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)。我國規(guī)定了食品中污染物限量（GB2762-2017），食用菌及其制品中有毒重金屬元素限量分別為Cd≤0.5 mg/kg、Pb≤1.0 mg/kg、As≤0.5 mg/kg。表3 中部分牛肝菌樣本Cd、Pb、As 含量超標(biāo)，牛肝菌菌蓋Cd、Pb、As 超標(biāo)率為91.43%、77.14%、82.86%；菌柄Cd、Pb、As 超標(biāo)率分別為68.57%、77.14%、82.86%，相同部位不同品種的牛肝菌重金屬元素含量差異明顯，大部分牛肝菌菌蓋重金屬大于菌柄。Cd 在牛肝菌菌蓋中的超標(biāo)率遠大于菌柄，這與Zhang 等[25]對美味牛肝菌不同部位礦質(zhì)元素的研究結(jié)果一致。比較不同部位重金屬元素含量（Q（c/s））可知，91%的牛肝菌Cd 含量菌蓋大于菌柄。60%的牛肝菌Pb 含量菌柄大于菌蓋。51%的牛肝菌As 含量菌蓋大于菌柄。此結(jié)果表明Cd、As 更易富集在牛肝菌菌蓋，Pb 易富集在牛肝菌菌柄。

表2 茶葉標(biāo)準(zhǔn)物（GBW 07605）礦質(zhì)元素含量及檢出限Table 2 Mineral elements contents in tea standard（GBW 07605）and limits of detection

表3 云南牛肝菌中有毒重金屬含量及菌蓋與菌柄含量之比（mg/kg dm）Table 3 The content of toxic heavy metals in Boletaceae in Yunnan and the ratio of the content of the cap to the stipe (mg/kg dm)

2.3 牛肝菌重金屬污染評價

菌類具有較強的重金屬富集能力，研究菌類重金屬污染問題可為了解產(chǎn)區(qū)重金屬污染狀況、優(yōu)化環(huán)境，合理資源開發(fā)提供借鑒意義。大部分牛肝菌樣品重金屬污染狀況嚴(yán)重，牛肝菌中相同部位不同種類，相同種類不同部位的污染程度具有差異。從單因子污染指數(shù)來看，處于輕度污染與重度污染的樣品數(shù)較多。Cd 在牛肝菌中超標(biāo)率最高，其次是Pb 和As。根據(jù)表4 可知，重度污染且超過50%的牛肝菌菌蓋樣品有絨柄牛肝菌66%（As）、灰褐牛肝菌100%（Cd）、美味牛肝菌65%（Cd）、金黃柄牛肝菌52.6%（Cd）。無污染且超過50%的牛肝菌菌蓋樣品有灰褐牛肝菌62.5%（As）、絨柄牛肝菌53.1%（Cd）；灰褐牛肝菌67.5%（Pb）；磚紅絨蓋牛肝菌57.7%（Pb）；金黃柄牛肝菌52.6%（Pb）。

表4 牛肝菌污染程度占比（%）Table 4 Proportion of pollution degree of Boletaceae(%)

Pb 重度污染率最高為灰疣柄牛肝菌（70.6%）菌柄與紅疣柄牛肝菌（65%）的菌柄，而菌蓋重度污染率僅僅為0%和5%。多數(shù)樣品Pb 重度污染率菌柄高于菌蓋，也就說明菌柄比菌蓋更易富集Pb。處于重度污染且超過50%的牛肝菌菌柄樣品有絨柄牛肝菌66%（As）、灰褐牛肝菌100%（Cd）、灰疣柄牛肝菌70.6%（Pb）、紅疣柄牛肝菌60.5%（Pb）。絨柄牛肝菌和灰褐牛肝菌的菌柄菌蓋重度污染率均為66%與100%。表5 中灰褐牛肝菌Cd 的Pi最高，為73.53，超出重污染最低限制的24.51 倍，屬于重度超標(biāo)，牛肝菌受不同重金屬污染程度具有差異性，可能與牛肝菌對不同重金屬的富集能力有關(guān)。內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為：Psum≤0.7 安全，清潔、0.73 重污染，受到嚴(yán)重污染。梅羅綜合污染指數(shù)結(jié)果顯示，金黃柄牛肝菌菌蓋菌柄的As-Psum值最?。?.79、1.82）；其次是灰褐牛肝菌（1.86、2.56），它們的梅羅綜合污染指數(shù)相對較低，屬于輕度污染與中度污染之間?；液峙８尉w菌柄的Cd-Psum值（55.12、28.16）與灰疣柄牛肝菌的Cd-Psum值（31.45、52.56）屬于嚴(yán)重污染。皺蓋疣柄牛肝菌菌蓋菌柄的Pb-Psum值最大（6.49、24.96），屬于嚴(yán)重污染。金黃柄牛肝菌菌柄的Pb-Psum值最?。?.47），屬于輕度污染。研究結(jié)果顯示，不同種類牛肝菌中均有超標(biāo)現(xiàn)象，其中Cd 是牛肝菌重金屬污染的主要特征污染元素。

表5 牛肝菌單一污染指數(shù)和內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)的統(tǒng)計表Table 5 Statistical table of Boletaceae single pollution index and Nemero comprehensive pollution index

2.4 不同部位牛肝菌膳食健康風(fēng)險評價

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（FAO/WHO JECFA）推薦的暫定每周可耐受攝入量（Provisionally tolerable weekly intake，PTWI）結(jié)合目標(biāo)危害商數(shù)對不同種類牛肝菌進行膳食健康風(fēng)險評價。假設(shè)一個60 kg 的成年人每周攝入300 g 新鮮牛肝菌，則根據(jù)公式（3）（4）計算出不同種類牛肝菌的單一重金屬目標(biāo)危害商數(shù)（THQ）和綜合目標(biāo)危害商數(shù)（TTHQ）。由表6 可知，食用牛肝菌均有攝入重金屬危害人體健康的風(fēng)險。通過牛肝菌目標(biāo)危害商數(shù)分析可知，除了磚紅絨蓋牛肝菌菌柄與絨柄牛肝菌菌柄的Cd-THQ<1，其他種類牛肝菌的Cd-THQ>1。菌蓋Cd-THQ>1 的比例為100%。菌柄Cd-THQ>1 的比例為78%，范圍在0.597～18.157 之間，最小值與最大值相差30 倍。Cd 在牛肝菌綜合健康風(fēng)險中占比最大，城市密集地區(qū)蔬菜重金屬污染研究中也發(fā)現(xiàn)Cd 更易富集在蔬菜里[22]。牛肝菌菌蓋As-THQ、Pb-THQ 范圍為0.464～6.499、0.580～7.957。牛肝菌菌柄As-THQ、Pb-THQ 范圍在0.520～1.281、0.470～3.282 之間，牛肝菌具有不同程度重金屬攝入風(fēng)險。如表6 所示，9 種牛肝菌綜合目標(biāo)危害商數(shù)（TTHQ）大于1，不同重金屬的THQ 對綜合健康風(fēng)險的貢獻率具有差異?？傮w來說，攝入牛肝菌的重金屬健康風(fēng)險較大，建議消費者適量食用。

表6 不同種類牛肝菌的單種重金屬目標(biāo)危險度（THQQ）和總目標(biāo)危險度（TTHQ）Table 6 Target hazard quotient (THQ) of single heavy metal and totaltarget hazard quotient (TTHQ)of different species of Boletaceae

3 結(jié)論

本試驗采用ICP-MS 法測定云南省9 種牛肝菌重金屬含量，分析元素含量特征、差異性及富集特點，結(jié)合GB2762-2017 與FAO/WHO 相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)對牛肝菌進行重金屬污染評價和膳食暴露風(fēng)險。結(jié)果表明，牛肝菌中As、Cd、Pb 均有不同程度超標(biāo)，Cd 是牛肝菌主要的有毒重金屬來源，牛肝菌菌蓋對Cd 的富集較多，而Pb 更易富集在牛肝菌菌柄中。單因子污染指數(shù)與內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)顯示，處于輕度污染與重度污染的樣品數(shù)較多，Cd 是牛肝菌重金屬污染的主要特征污染元素。健康風(fēng)險評價結(jié)果表明，所測牛肝菌綜合目標(biāo)危害商數(shù)均大于1，且數(shù)值較大，大量食用牛肝菌有攝入重金屬危害人體健康的風(fēng)險。牛肝菌是一種常見的野生食用菌，具有較大的食用價值和經(jīng)濟價值，對云南牛肝菌重金屬進行分析，有利于當(dāng)?shù)刭Y源合理開發(fā)利用，也為消費者提供合理的膳食依據(jù)。本研究在食用菌重金屬污染控制問題方面尚難以解決，對于野生菌類進行人工馴化栽培，減少子實體重金屬富集將是今后研究的重要方向。