楊學(xué)英，趙芳娟，鄧百萬*，解修超

（1.陜西理工大學(xué)陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001）

金耳（Tremella aurantialba Bandoni et Zang.），又稱黃金銀耳、腦耳、黃木耳、金木耳、膠耳等，隸屬于銀耳目（Tremellales）銀耳科（Tremellaceae）銀耳屬（Tremella），主要分布在我國(guó)云南、西藏等高海拔地區(qū)，是我國(guó)特有的一種珍稀食藥兼用膠質(zhì)真菌[1]。金耳膠質(zhì)細(xì)膩、清潤(rùn)可口、味香色美，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和廣泛的藥理作用，富有營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)，強(qiáng)身保健之功效，被認(rèn)為是重要的天然保健品，國(guó)際市場(chǎng)稱之為“名山珍”[2-5]。

金耳的生長(zhǎng)發(fā)育循環(huán)系統(tǒng)比較復(fù)雜，單一型的金耳純菌絲沒有分解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的能力，自身幾乎完全沒有獨(dú)立生長(zhǎng)發(fā)育的能力，必須借助有親和性的伴生菌（毛韌革菌）協(xié)同完成其生活史。毛韌革菌是金耳生長(zhǎng)發(fā)育中不可缺少的生物因素[6]，其通過分泌多種胞外酶對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行降解，為金耳的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。胞外酶是指在細(xì)胞內(nèi)合成而在細(xì)胞外起作用的酶，包括位于細(xì)胞外表面或細(xì)胞外質(zhì)空間的酶，也指釋放入培養(yǎng)基的酶[7]。食藥用真菌生長(zhǎng)發(fā)育過程中，一些簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)和化學(xué)元素直接被吸收，另一些木質(zhì)素及其它有機(jī)大分子物質(zhì)則是通過菌絲不斷向胞外分泌各種酶，將復(fù)雜大分子降解成小分子化合物，供菌絲吸收利用，胞外酶直接影響其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物降解能力[8-9]。因此，胞外酶的產(chǎn)生及變化規(guī)律在一定程度上能反映對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)中各種組分的利用規(guī)律[10]。目前，有關(guān)金耳的研究主要集中在金耳多糖提取及其生物學(xué)活性[11-12]、優(yōu)良菌種優(yōu)化篩選[13-14]和栽培技術(shù)[15-16]方面，而有關(guān)其在液體培養(yǎng)過程中胞外酶種類及其活性方面的研究鮮有報(bào)道。本研究通過測(cè)定毛韌革菌和金耳與毛韌革菌混合菌種在液體培養(yǎng)過程中10種胞外酶活性的變化，以期為金耳液體制種過程中金耳菌種質(zhì)量的內(nèi)控指標(biāo)及其營(yíng)養(yǎng)生理研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

金耳（Tremella aurantialba）菌種（混合菌種，其內(nèi)具有金耳和毛韌革菌雙重菌絲）、毛韌革菌（Stereum hirsutum）菌株：陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心。

羧甲基纖維素鈉、木聚糖、可溶性淀粉、果膠、酪蛋白、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、3，5－二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：上海生工生物工程有限公司；ABTS（分析純）：Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀5g，七水合硫酸鎂3g，VB110mg，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH值自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀5 g，七水合硫酸鎂3 g，VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-75KBS）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；生化恒溫培養(yǎng)箱（SPX-25085H-II）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；多振幅軌道搖床（ZWY-100H）：上海智城分析儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV2550）：日本島津公司；恒溫水浴鍋（KQ5200DE）：昆山超聲儀器有限公司；電子分析天平（BSA8201）：北京賽多利科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（ZHJH-C111213）：蘇州凈化儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 活化及液體培養(yǎng)

在無菌條件下，切取約0.5 cm2的菌絲塊接種在固體培養(yǎng)基平板上，24℃活化培養(yǎng)7 d，在500 mL三角瓶?jī)?nèi)裝入250 mL液體培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)中，將金耳菌種、毛韌革菌菌株各取約0.5 cm2分別接入液體培養(yǎng)基中，24℃、150 r/min恒溫振蕩，避光培養(yǎng)。

1.3.2 樣品制備

在液體培養(yǎng)期間，每2 d定時(shí)取1次樣品，雙層濾紙過濾，發(fā)酵液經(jīng)4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，連續(xù)測(cè)定8次，以在沸水中水浴10 min滅活的粗酶液作為空白對(duì)照。

1.3.3 葡萄糖、木糖、D-半乳糖醛酸和L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按參考文獻(xiàn)[17-18]的方法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.311 91x＋0.010 4（R2=0.995 3）；木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=2.387 1x－0.019 3（R2=0.998 3）；D-乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=2.791 4x－0.039 2，R2=0.997 6；L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.008 4x＋0.013 9，R2=0.997 7，線性關(guān)系良好。

1.3.4 胞外酶活性測(cè)定

羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）酶、濾紙纖維素（filter paper cellulose，F(xiàn)P）酶、半纖維素（hemicellulases，HC）酶、果膠酶和淀粉酶活性測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[19]的方法。酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘底物水解生成1 μmol還原糖的酶量，為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

蛋白酶活性測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[20]的方法。酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量，為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

漆酶、鄰苯二酚氧化酶和愈創(chuàng)木酚氧化酶活性測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[21]的方法。酶活力單位定義：在一定條件下，以反應(yīng)前后吸光度值的改變值表示酶活性大小，改變0.01為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

過氧化物酶活性測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[22]的方法。酶活力單位定義：在一定條件下，以每分鐘吸光度值改變值表示酶活性大小，改變0.01為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每次測(cè)定重復(fù)3次，取其平均值。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC酶、FP酶活性變化分析

液體培養(yǎng)過程中CMC酶、FP酶活性變化情況見圖1。

圖1 液體培養(yǎng)過程中CMC酶和FP酶活性的變化Fig.1 Activity changes of extracellular carboxymethyl cellulose and filter paper cellulose in liquid cultivation

由圖1可知，在整個(gè)發(fā)酵試驗(yàn)期內(nèi)，毛韌革菌和混合菌絲的胞外CMC酶及FP酶活性變化規(guī)律有一定的相似性，整體上呈下降趨勢(shì)。毛韌革菌和混合菌絲CMC酶活性高峰均出現(xiàn)在培養(yǎng)第2天，酶活力分別為10.051 U/mL和14.674 U/mL，隨后酶活性稍有下降，在培養(yǎng)第6天又都出現(xiàn)1個(gè)小高峰，之后酶活性迅速下降，在液體培養(yǎng)后期始終保持在很低的水平。兩者FP酶活性高峰也出現(xiàn)在第2天，酶活力分別為3.188 U/mL和3.633 U/mL，之后酶活性下降，而在培養(yǎng)第6天和第10天均分別出現(xiàn)1個(gè)小高峰，第10天以后兩者FP酶活性同CMC酶一樣，保持在很低的水平。FP酶活性峰值不止出現(xiàn)1次的原因可能與毛韌革菌和混合菌絲在液體培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生多種纖維素酶有關(guān)。從整體上看，混合菌絲相對(duì)于毛韌革菌純培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出更高的CMC酶和FP酶活性，結(jié)果表明混合培養(yǎng)時(shí)有相對(duì)較強(qiáng)的降解纖維素的能力。

2.2 HC酶活性變化分析

液體培養(yǎng)過程中HC酶活性變化情況見圖2。

圖2 液體培養(yǎng)過程中HC酶活性的變化Fig.2 Activity changes of extracellular hemicellulose in liquid cultivation

由圖2可知，毛韌革菌和混合菌絲HC酶活性均在液體培養(yǎng)前期相對(duì)較高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，酶活性都有比較明顯的下降趨勢(shì)。毛韌革菌HC酶活性高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)第2天，酶活力為20.971 U/mL，而混和菌絲酶活性高峰出現(xiàn)在第4天，酶活力為26.067 U/mL，兩者酶活性高峰出現(xiàn)后，酶活性均迅速下降，在8 d～16 d內(nèi)酶活性都相對(duì)較低。在整個(gè)液體培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)，混合菌絲HC酶活性都在一定程度上高于毛韌革菌，結(jié)果表明混合培養(yǎng)時(shí)提高了對(duì)半纖維素的降解利用能力。

2.3 淀粉酶、果膠酶活性變化分析

液體培養(yǎng)過程中淀粉酶、果膠酶活性變化情況見圖3。

圖3 液體培養(yǎng)過程中淀粉酶和果膠酶活性的變化Fig.3 Activity changes of extracellular amylase and pectinase in liquid cultivation

由圖3可知，毛韌革菌和混合菌絲淀粉酶活性變化趨勢(shì)基本一致，兩者淀粉酶活性高峰都出現(xiàn)在培養(yǎng)第2天，酶活力分別為14.781 U/mL和15.270 U/mL，隨后酶活性均逐漸降低，在第6天和第14天又都出現(xiàn)1個(gè)小高峰，兩者酶活性在發(fā)酵培養(yǎng)8 d～16 d內(nèi)都保持在較低水平。毛韌革菌和混合菌絲果膠酶活性變化趨勢(shì)存在一定的差異，兩者果膠酶活性在培養(yǎng)2 d～4 d都處于較低水平，酶活性高峰均出現(xiàn)在培養(yǎng)第6天，酶活力分別為3.254 U/mL和5.756 U/mL，毛韌革菌酶活性達(dá)到峰值后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸下降，而混合菌絲酶活性達(dá)到峰值后迅速下降，而后又緩慢上升，在培養(yǎng)第14天又出現(xiàn)1個(gè)小高峰，隨后酶活性逐漸下降。果膠酶活性變化相對(duì)于淀粉酶存在一定的滯后性，分析其原因可能是由于菌絲體生長(zhǎng)過程中優(yōu)先利用纖維素、半纖維素和淀粉等物質(zhì)，而果膠則是在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下才會(huì)被利用?；旌暇z淀粉酶活性在整體上高于毛韌革菌，果膠酶活性在培養(yǎng)第6天前低于毛韌革菌，但在第6天及以后，酶活性明顯高于毛韌革菌，從整個(gè)變化過程看，混合菌絲同毛韌革菌相比，果膠酶活性是高于毛韌革菌的，結(jié)果表明混合培養(yǎng)時(shí)提高了對(duì)淀粉和果膠的降解利用能力。

2.4 蛋白酶活性變化分析

液體培養(yǎng)過程中蛋白酶活性變化情況見圖4。

圖4 液體培養(yǎng)過程中蛋白酶活性的變化Fig.4 Activity changes of extracellular protease in liquid cultivation

蛋白酶的主要作用是斷裂蛋白質(zhì)的肽鍵，將蛋白質(zhì)分解成氨基酸、尿素、氨等小分子化合物，為菌絲的生長(zhǎng)提供原料[23]。由圖4可知，毛韌革菌和混和菌絲在液體培養(yǎng)過程中，蛋白酶活性變化均大致呈現(xiàn)“波浪”型。毛韌革菌在培養(yǎng)第6天及以后，混合菌絲在第4天及以后才能檢測(cè)到蛋白酶活性，兩者蛋白酶活性高峰均出現(xiàn)在培養(yǎng)第6天，酶活力分別為7.619 U/mL和8.650 U/mL，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活力均時(shí)升時(shí)降，但總體來說，兩者蛋白酶活性仍呈下降趨勢(shì)，且在液體培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，蛋白酶活性均保持在相對(duì)于培養(yǎng)初期來說較高的酶活性水平?；旌暇z蛋白酶活性在培養(yǎng)第8天及以前高于毛韌革菌，第8天以后酶活性低于毛韌革菌，從整體上看，混合菌絲同毛韌革菌相比,蛋白酶活性沒有明顯提高。

2.5 漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶、鄰苯二酚氧化酶和過氧化物酶活性變化分析

液體培養(yǎng)過程中漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性變化情況見圖5、圖6。

圖5 金耳液體培養(yǎng)過程木質(zhì)素降解酶活性的變化Fig.5 Activity changes of lignin degradation enzymes in in liquid cultivation of Tremella aurantialba

圖6 毛韌革菌液體培養(yǎng)過程中木質(zhì)素降解酶活性的變化Fig.6 Activity changes of lignin degradation enzymes in in liquid cultivation of Stereum hirsutum

漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶都屬于木質(zhì)素降解酶類，在木質(zhì)素代謝過程中起著重要的作用，其活性大小可以反映出對(duì)木質(zhì)素降解能力[24]。由圖5、圖6可知，毛韌革菌和混和菌絲漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性在液體培養(yǎng)初期酶活性均較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，基本呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)?；旌途z漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性高峰分別出現(xiàn)在培養(yǎng)第8、8、12天，酶活力分別為32、22 U/mL和14 U/mL（圖5），漆酶在培養(yǎng)第14天又出現(xiàn)了1個(gè)小高峰，而愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶在第1個(gè)活性高峰出現(xiàn)后酶活性逐漸下降。毛韌革菌漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性高峰分別出現(xiàn)在培養(yǎng)第10、10、12天，酶活力分別為26、11 U/mL和9 U/mL（圖6），毛韌革菌漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性變化趨勢(shì)與混和菌絲類似。綜合比較分析，混合菌絲木質(zhì)素降解酶活性均在一定程度上高于毛韌革菌，結(jié)果表明混合培養(yǎng)時(shí)可以提高對(duì)木質(zhì)素的降解利用能力。毛韌革菌和混合菌絲液體培養(yǎng)過程中均未檢測(cè)到過氧化物酶活性。

3 結(jié)論與討論

毛韌革菌和混合菌絲在液體培養(yǎng)過程中胞外酶活性變化規(guī)律基本一致，具有明顯的階段性。兩者CMC酶、FP酶、HC酶、淀粉酶活性峰值均出現(xiàn)在培養(yǎng)第2天～4天，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),酶活性有明顯的下降趨勢(shì)，而果膠酶活性峰值均出現(xiàn)在培養(yǎng)第6天，整體呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)。毛韌革菌在培養(yǎng)第6天及以后，混合菌絲在第4天及以后才能檢測(cè)到蛋白酶活性，兩者酶活性都在培養(yǎng)第6天達(dá)到峰值，為菌絲的快速生長(zhǎng)提供充足的氮源，在液體培養(yǎng)后期蛋白酶活性隨著菌絲體生長(zhǎng)速度的減緩又都逐步降低。毛韌革菌和混合菌絲漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性在液體培養(yǎng)前期酶活性處于較低水平，酶活性高峰均出現(xiàn)在培養(yǎng)第8天及以后，酶活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間次序表明在液體培養(yǎng)過程中菌絲利用木質(zhì)素類物質(zhì)的時(shí)間較晚。

此外，研究結(jié)果顯示金耳菌的存在也可能對(duì)毛韌革菌胞外酶酶活性有一定的影響，毛韌革菌液體發(fā)酵過程中，胞外CMC、FP酶、HC酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、漆酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶和鄰苯二酚氧化酶活性峰 值 分 別 為 10.051、3.188、20.971、14.781、3.254、7.619、26、11 U/mL 和 9 U/mL，而混合培養(yǎng)時(shí)，上述胞外酶活性峰值依次為 14.674、3.633、26.067、15.270、5.756、8.650、32、22 U/mL 和 14 U/mL。從整體上看，除蛋白酶外，混合菌絲胞外酶活性都在一定程度上高于毛韌革菌純培養(yǎng)情況下的酶活性，表明金耳菌和毛韌革菌之間可能存在一定的互作關(guān)系，金耳的這種特性與和其同屬的銀耳相似。綜合上述結(jié)果分析可知，金耳的伴生菌—毛韌革菌擁有極其豐富的胞外酶系，在培養(yǎng)基質(zhì)降解方面起著極其重要作用，是其具有為金耳提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要生理基礎(chǔ)，而金耳菌絲則會(huì)促進(jìn)其伴生菌從基質(zhì)中吸收營(yíng)養(yǎng)，二者之間的相互作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。