王路平，徐建中*，張偉國

(1.江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫214122)

L-賴氨酸是人類和動物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。研究報道,自賴氨酸發(fā)酵開始以來,谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)及其亞種是發(fā)酵賴氨酸的主要選擇,但最近大腸桿菌(Escherichia coli)也在賴氨酸發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用[1-3]。以葡萄糖為原料時,C.glutamicum中有5個途徑參與L-賴氨酸合成：糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑(PPP)、三羧酸(TCA)循環(huán)、補給途徑(CO2固定反應)和L-賴氨酸終端合成途徑(圖1)。20世紀80年代末和90年代,開發(fā)了用于該微生物的各種基因工程工具,并將這些分子技術應用于菌株改良,旨在增強賴氨酸生產(chǎn)能力[4-5]。這使得理論代謝工程不僅可以用于賴氨酸生物合成途徑,而且可用于中樞代謝,從而,增加前體供應和NADPH再生成為研究者用于增強賴氨酸生物合成的著力點。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)是細胞代謝中最重要的氧化還原載體,不僅作為催化底物分解代謝的電子受體,也為能量依賴型的氧化還原反應提供還原力[6],是多種代謝產(chǎn)物合成中的主要驅動力。其影響的代謝產(chǎn)物包括賴氨酸[7]、纈氨酸[8]、精氨酸[9]、鳥氨酸[10]、氯丙酸酯[11]、番茄紅素[11]和萜類化合物[12]。 已有文獻報道,在C.glutamicum中每合成1 mol L-賴氨酸需要消耗4 mol的NADPH[13]。因此,為了增加C.glutamicum生物合成途徑中L-賴氨酸的積累,提高C.glutamicum代謝途徑中NADPH量或降低L-賴氨酸合成途徑中NADPH需求量是輔因子工程育種常用的策略。然而,作者前期研究發(fā)現(xiàn),胞內(nèi)過量的NADPH會阻礙細胞對糖的利用,降低菌體生長量和L-賴氨酸積累量。雖然有文獻指出,控制胞內(nèi)輔因子平衡是維持細胞正常代謝的一項基本需求[14],但輔因子NADPH是如何調(diào)控細胞內(nèi)代謝水平,進而影響產(chǎn)物合成的機制還不清晰。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-賴氨酸和NADPH合成代謝網(wǎng)絡示意圖Fig.1 Metabolic pathways of L-lysine and NADPH in C.glutamicum

本研究的目的是詳細解析谷氨酸棒桿菌中賴氨酸與NADPH水平之間的關聯(lián)及其代謝調(diào)控機制。在這項工作中,以賴氨酸高產(chǎn)菌C.glutamicumXQ-5作為出發(fā)菌株,通過基因工程手段分別構建出一種高NADPH水平菌株C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)和一種低NADPH水平菌株C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi,并比較分析其與出發(fā)菌胞內(nèi)微環(huán)境的差異。通過出發(fā)菌與工程菌之間的轉錄組數(shù)據(jù)分析,重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)中編碼天冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因表達水平提高,且被證實為重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)賴氨酸產(chǎn)量反而降低的原因之一。這些數(shù)據(jù)為通過改變胞內(nèi)NADPH水平來探究其對L-賴氨酸合成的調(diào)節(jié)機制的可行性提供了有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本研究中使用的菌株和質粒列于表1,使用的引物序列列于表2。

表1 本研究中用到的菌種和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中用到的引物序列Table 2 Primers used in this study

1.2 培養(yǎng)基和生長條件

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10；pH 7.0。LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)E.coliJM109細菌,并在旋轉振蕩器上以100 r/min在37℃下進行基因克隆。

LB-葡萄糖(LBG)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5,蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10；pH 7.0。在LBG培養(yǎng)基中,30℃、100 r/min的條件下培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌。

EPO培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5,蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,吐溫-80 1；pH 7.0。在121℃下濕加熱滅菌20 min,過濾除菌后,向培養(yǎng)基中加入4 g異煙肼和30 g甘氨酸。

LB-腦心浸液-山梨糖醇(LBHIS)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,酵母提取物2.5,NaCl 10,腦心浸液18.5,山梨醇91；pH 7.0。

CGXII培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO436,尿素5,KH2PO4l,K2HPO41,MgSO4·7H2O 0.25,3-(N-嗎啡啉)-丙磺酸42,CaCl20.010,FeSO40.01,MnSO40.01,ZnSO40.01,CuSO40.000 2,NiCl20.000 02,生物素0.000 2,原兒茶酸0.000 03；115℃滅菌10 min,用于L-賴氨酸發(fā)酵。

馮可兒和高潮就頒獎典禮的舉辦地點問題，唇槍舌劍，互不相讓，爭論得臉紅脖子粗。見馮可兒情急之下說出了題外話，田卓忙出來打圓場，說，這個事情，一時難以討論出個結果。至于具體在哪里舉辦，反正還有段時間，我們都考慮考慮，下周一的例會上再討論吧。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40,(NH4)2SO436,MgSO4·7H2O 1.5,FeSO40.02,MnSO40.02,KH2PO4l,K2HPO41,玉米漿35,甜菜糖蜜12,煙酰胺0.008,甜菜堿0.05,硫胺素0.000 45,生物素0.000 85,CaCO340；pH 7.0,115℃滅菌10 min。5 mL種子液轉接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的搖瓶中,30℃、100 r/min發(fā)酵40 h。

續(xù)表2

1.3 質粒和菌株構建

用限制性核酸內(nèi)切酶(Takara公司)和DNA Ligase Kit Ver 2.0(Takara公司)構建質粒pK18mobsacB-Δzwf：：pgi和pK18mobsacB-Δpgi：：(zwf-gnd),然后將質粒轉化到C.glutamicumXQ-5中[21]。制備C.glutamicumXQ-5的感受態(tài)菌株,質粒pK18mobsacB-Δzwf：：pgi和pK18mobsacB-Δpgi：：(zwf-gnd)分別用電穿孔導入C.glutamicumXQ-5中,分別得到C.glutamicumXQ-5/pK18mobsacB-Δzwf：：pgi和C.glutamicumXQ-5/pK18mobsacBΔpgi：：(zwf-gnd)。重組菌株C.glutamicum XQ-5Δzwf：：pgi和C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)通過基因組整合獲得[22]。將敲除質粒pK18mobsacBΔA：：B電穿孔到谷氨酸棒桿菌的感受態(tài)細胞中,并使用谷氨酸棒桿菌的雙交換同源重組策略,通過兩個菌株篩選重組菌株。

1.4 胞內(nèi)輔酶II NADP(H)的測定

收集400萬~500萬細菌,加入0.9 mL酸性(堿性)提取液,超聲破碎1 min(200 W,超聲2 s,停1 s),蓋緊后煮沸5 min,冰浴中冷卻后,10 000g、4℃離心10 min,取上清液200μL至另一新的離心管中,加入等體積的堿性(酸性)提取液使之中和,10 000g、4℃離心10 min,取上清液。隨后,以試劑盒NADP/NADPH Quantification Colorimeteric Kit特異性檢測NADP+和NADPH,并計算NADPH/NADP+[23]。

1.5 胞內(nèi)輔酶I NAD(H)的測定

收集400萬~500萬細菌,加入0.5 mL酸性(堿性)提取液,超聲破碎1 min(200 W,超聲2 s,停1 s),蓋緊后煮沸5 min,冰浴中冷卻后,10 000g、4℃離心10 min,取上清液200μL至另一新的離心管中,加入等體積的堿性(酸性)提取液使之中和,10 000g、4℃離心10 min,取上清液。隨后,以試劑盒NAD/NADH Quantification Colorimeteric Kit特異性檢測NAD+和NADH,并計算NADH/NAD+[23]。

1.6 胞內(nèi)ATP、ADP、AMP的測定

利用0.6 mol/L HClO4(PCA)抽提重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd),C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi和出發(fā)菌C.glutamicumXQ-5胞內(nèi)ATP、ADP和AMP。隨后,采用HPLC技術對抽提液進行分析,測定胞內(nèi)ATP、ADP和AMP的濃度。將50 mL細胞樣品從培養(yǎng)物中取出,立即在液氮中冷凍60 s,并儲存在-20℃。通過HPLC檢測細胞內(nèi)ATP的濃度。為了提取ATP,將10 mL的0.6 mol/L HClO4加入到細胞沉淀中并混合,用磁力攪拌器徹底攪拌10 min。將混合物以10 000g離心10 min以收集上清液。將另外10 mL的0.6 mol/L HClO4加入到沉淀中,充分混合10 min,離心后收集上清液。將兩部分上清液在25 mL容量瓶中混合,并用0.6 mol/L HClO4補足至25 mL。取10 mL所制備的溶液,并用0.8 mol/L KOH將pH值調(diào)節(jié)至7.0。在4℃保持30 min后,通過過濾除去晶體KClO4(濾紙孔徑=0.22μm),然后在應用HPLC柱之前,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)稀釋至25 mL。HPLC分析的進樣量為10μL。使用體積分數(shù)80%10 mmol/L KH2PO4(pH 7.0)和體積分數(shù)20%甲醇的混合物作為流動相,流速為1.2 mL/min。紫外檢測器的波長設置為260 nm,柱溫控制在25℃[24]。

1.7 通過RNA-seq進行轉錄組分析

從新劃線的瓊脂平板上挑取單個菌落的谷氨酸棒桿菌原始菌株(C.glutamicumXQ-5)或重組菌株 (C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)和C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi),并接種到LBG培養(yǎng)基中。在30℃過夜培養(yǎng)12~16 h后,分別收獲細胞,洗滌并轉移至標準CGXII基本培養(yǎng)基,初始OD600nm為0.1。在RNA提取之前,將培養(yǎng)物在30℃下再溫育12 h。將10 mL收集的細胞在液氮中快速冷凍,用RNAprep純試劑盒(TIANGEN)處理以提取總細菌RNA,并在干冰環(huán)境遞送至GENEWIZ公司進行轉錄組測序分析(https：//www.genewiz.com/)。對于注釋,使用谷氨酸棒桿菌ATCC13032(NC_003450.3)的基因組作為參考。通過使用錯誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR)≤0.05和倍數(shù)變化log2Ratio標準,測定樣品C.glutamicumXQ-5與重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)和C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi之間的差異表達基因。

1.8 生長曲線測定

將來自新鮮劃線的瓊脂平板上的菌株C.glutamicumXQ-5,C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)和C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi的單個菌落轉移至液體LBG培養(yǎng)基中,并在30℃下溫育16 h。在生長實驗之前以200 r/min搖動。收獲培養(yǎng)物,洗滌并重新懸浮在新鮮的指定培養(yǎng)基中至初始OD600nm為0.1。然后通過在指定的時間點測量600 nm處的光密度來監(jiān)測細胞生長,并顯示為至少3次獨立重復的平均值。

1.9 搖瓶發(fā)酵

將谷氨酸棒桿菌單菌落接種到LBG液體培養(yǎng)基中。將細菌在30℃、100 r/min的搖床中培養(yǎng)約10 h。用不含碳源的CGXII培養(yǎng)基洗滌最終懸浮液3次。將懸浮液接種到60 mL CGXIIG(CGXII培養(yǎng)基中加入40 g/L葡萄糖)液體培養(yǎng)基中。在500 mL三角燒瓶中,于30℃、100 r/min的振蕩器中培養(yǎng)48 h。每4 h測量OD600nm和L-賴氨酸的濃度。

1.10 統(tǒng)計分析

各實驗至少獨立進行3次,數(shù)據(jù)表示為平均值和標準偏差(SD)。為了比較實驗組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計差異,使用了學生t檢驗。

2 結 果

2.1 重組菌和出發(fā)菌胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP和AMP)、吡啶核苷酸(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)的變化

使用賴氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumXQ-5作為出發(fā)菌株,利用基因敲除和替換策略,作者分別用將pgi基因敲除替換為Ptac-pgi-rrnBT1T2表達框以強化磷酸戊糖途徑和將zwf基因敲除替換為Ptac-pgi-rrnBT1T2表達框以阻斷磷酸戊糖途徑的方式成功地構建了重組菌株C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)和C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi。為了確定出發(fā)菌株C.glutamicumXQ-5經(jīng)過改造后是否胞內(nèi)NADPH水平有所改變,對出發(fā)菌株和重組菌株進行搖瓶發(fā)酵48 h,然后對其胞內(nèi)進行吡啶核苷酸含量測定,具體數(shù)據(jù)見表3-4。

從表3可知,重組菌株C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)胞內(nèi)NADPH水平從起始菌株的每1萬個細胞含3.57×10-8μmol提高到1.80×10-7μmol,胞內(nèi)NADPH/NADP+提高了109.9%；胞內(nèi)NADH略低于出發(fā)菌株,這是由于糖酵解途徑的阻斷,碳流量經(jīng)過磷酸戊糖途徑,導致NADH的合成量減少。重組菌株C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi胞內(nèi)NADPH水平從起始菌株的每1萬個細胞含3.57×10-8μmol下降到1.12×10-8μmol,胞內(nèi)NADPH/NADP+降低了28.8%。谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)存在多種NADPH合成代謝途徑,而其胞內(nèi)的NADPH主要是通過PPP途徑合成[13,19-20],阻斷該途徑大大降低了NADPH的合成量。同時胞內(nèi)NADH略高于出發(fā)菌株,這是糖酵解途徑加強的結果。與此同時,由于胞內(nèi)NADPH水平的降低,NAD(H)/NADP(H)的氧化平衡被打破,部分NADH在NAD激酶的作用下合成NADPH[13,25-26]。

從表4可知,重組菌株C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)胞內(nèi)ATP比出發(fā)菌株提高了29.7%,而重組菌株C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi胞內(nèi)ATP含量提高了111.2%。這是由于NADH、NADPH與ATP合成具有密不可分的聯(lián)系,但NADPH幾乎僅用于還原性生物合成,用作氫和電子的供體,而NADH則主要用于產(chǎn)生ATP,為氧化形成ATP的電子傳遞鏈提供電子,從而使胞內(nèi)的ADP和AMP轉換成ATP[27]。因此,NADH和NADPH含量的變化直接影響ATP的合成,從而關系著胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸的平衡。

表3 重組菌和出發(fā)菌胞內(nèi)每1萬個細胞的吡啶核苷酸(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)含量Table 3 Contents of intracellular pyridine nucleotides(NAD+,NADH,NADP+and NADPH)in each 104 cells of recombinant and original bacteria 單位：μmol

表4 重組菌和出發(fā)菌胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP和AMP)含量Table 4 Contents of intracellular adenine nucleotides(ATP,ADP and AMP)in recombinant and original bacteria單位：mmol/L

2.2 重組菌與出發(fā)菌的生長參數(shù)比較

盡管重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwfgnd)的細胞內(nèi)NADPH水平增加,但由于糖酵解途徑的阻斷,在以葡萄糖為單一碳源的CGXIIG發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖的初始質量濃度為40 g/L)中,重組菌的生長被延緩,但最終菌體量與出發(fā)菌相似,見圖2(a),并且發(fā)酵結束的賴氨酸產(chǎn)量15 g/L低于發(fā)酵結束后出發(fā)菌株的賴氨酸產(chǎn)量17 g/L,見圖4(a)。當發(fā)酵培養(yǎng)基富含營養(yǎng)(葡萄糖的初始質量濃度為100 g/L)時,重組菌的生長與起始菌株的生長相似,見圖2(b),但發(fā)酵結束后重組菌株的賴氨酸產(chǎn)量41 g/L仍然低于發(fā)酵后起始菌株的賴氨酸產(chǎn)量49 g/L,見圖4(b)。

重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi的細胞內(nèi)是阻斷了PPP途徑,強化了糖酵解途徑。其在CGXIIG發(fā)酵培養(yǎng)基中時,發(fā)酵16 h之前生長速率高于出發(fā)菌株,發(fā)酵16 h之后生長速率開始下降并低于出發(fā)菌株,最終在發(fā)酵32 h后進入平緩期,最終OD600nm為17,遠遠低于出發(fā)菌株,見圖2(a)。并且其葡萄糖消耗有10 g/L的剩余,見圖3(a)。其發(fā)酵結束后的賴氨酸產(chǎn)量3 g/L遠低于出發(fā)菌株的17 g/L,見圖4(a)。發(fā)酵16 h,其生長速率高于出發(fā)菌株可能是糖酵解途徑的加強引起的,生長前期NADPH的匱乏暫時由NADH轉化的NADPH彌補[13],維持細胞生長。NADPH是細胞生長與代謝的重要輔因子之一,由于NADPH主要合成途徑PPP的阻斷和NADPH的不斷消耗,發(fā)酵16 h以后細胞生長速率逐漸降低。這一現(xiàn)象進一步表明了NADPH影響菌體生長速率和菌體量。發(fā)酵結束后,葡萄糖的剩余和賴氨酸產(chǎn)量的減少說明了NADPH對于細胞的糖代謝和賴氨酸合成至關重要。在富含營養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中時,重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi與出發(fā)菌株的生長情況相似,見圖2(b),發(fā)酵結束后仍有3 g/L的殘?zhí)?見圖3(b),且賴氨酸產(chǎn)量為28 g/L,見圖4(b)。

2.3 不同NADPH水平的菌株內(nèi)胞內(nèi)副產(chǎn)物合成的比較

NADPH是代謝網(wǎng)絡中的關鍵輔助因子之一,在氨基酸生產(chǎn)菌株的生化反應和生理功能中起重要作用。為了進一步研究胞內(nèi)不同NADPH水平對發(fā)酵副產(chǎn)物(如有機酸和其他氨基酸)的影響,在發(fā)酵結束后測定發(fā)酵液中有機酸和副產(chǎn)物氨基酸含量。

圖2 重組菌與出發(fā)菌在CGXIIG培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的生長情況Fig.2 Growth of recombinant strain and original strain in CGXIIG medium and fermentation medium

圖3 重組菌與出發(fā)菌在CGXIIG培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖消耗情況Fig.3 Glucose consumption of recombinant strain and original strain in CGXIIG medium and fermentation medium

圖4 重組菌與出發(fā)菌在CGXIIG培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的賴氨酸合成情況Fig.4 Lysine synthesis of recombinant strain and original strain in CGXIIG medium and fermentation medium

由表5可知,阻斷糖酵解途徑、強化PPP途徑后,與出發(fā)菌株C.glutamicumXQ-5相比,重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)發(fā)酵液中副產(chǎn)物氨基酸明顯增加：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸分別增加了27.6%、55.3%、27.5%、19.5%、26.2%。而發(fā)酵液中的丙酮酸和乳酸含量與出發(fā)菌相比,分別減少了24.5%和65.7%。重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi發(fā)酵液中的副產(chǎn)物氨基酸含量明顯降低：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸分別降低了37.1%、55.3%、73.5%、50.3%、52.7%。而發(fā)酵液中的丙酮酸和乳酸含量與出發(fā)菌相比,分別增加了51.1%和5.1%。NADPH是多種代謝產(chǎn)物合成的驅動力,尤其是氨基酸。多項研究表明,提高胞內(nèi)NADPH水平可以增強多種氨基酸的合成,如賴氨酸[7]、谷氨酸[28]、蘇氨酸[28]、亮氨酸[28]、異亮氨酸[28]、纈氨酸[8]、精氨酸[10]和鳥氨酸[9]等。所以胞內(nèi)NADPH水平的變化也會引起胞內(nèi)相應副產(chǎn)物氨基酸發(fā)生相應改變。同樣,胞內(nèi)NADPH的變化對胞內(nèi)丙酮酸和乳酸也會產(chǎn)生相應影響。且由于胞內(nèi)NADPH水平改變,胞內(nèi)以NADPH為輔酶的氨基酸,如以丙酮酸為前體合成的丙氨酸族氨基酸,和經(jīng)過丙酮酸流向三羧酸循環(huán)后以草酰乙酸為前體合成的天冬氨酸族氨基酸,其合成會發(fā)生相應變化,使得丙酮酸等代謝途徑上游的中間產(chǎn)物得以累積或減少。

表5 重組菌和出發(fā)菌發(fā)酵液中副產(chǎn)物氨基酸和有機酸含量Table 5 Concentration of amino acid and organic acid in fermentation of recombinant and original bacteria

圖5 差異表達基因的火山圖Fig 5 Volcano plot of differentially expressed genes

2.4 重組菌株和原始菌株的轉錄組分析比較

為了進一步揭示不同NADPH水平的出發(fā)菌C.glutamicumXQ-5和重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)以及出發(fā)菌C.glutamicumXQ-5和重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi在轉錄組水平上的差異,收集在搖瓶發(fā)酵了12小時的樣品,并進行RNA-Seq分析以評估重組菌與原始菌株C.glutamicumXQ-5之間的基因表達差異。發(fā)現(xiàn)重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)中103個基因的表達水平與原始菌相比有明顯差異,包括53個上調(diào)基因和50個下調(diào)基因,見圖5(a)。其中重組菌株構建的相關基因顯示出相應的表達差異,包括基因zwf(log2FC=5.386,FDR=0.000 01),gnd(log2FC=2.432,FDR=0.000 41)和panD(log2FC=2.808,FDR=0.000 01),表達水平分別上調(diào)了41.5倍,5.5倍和7.1倍,而基因pgi(log2FC=-2.96,FDR=0.002 3)表達水平下降了87.2%?；贙EGG途徑富集分析,這些基因被歸類至7個主要細胞過程(見表6),即ATP結合盒(ABC家族蛋白)轉運系統(tǒng)、磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、谷胱甘肽代謝、碳代謝、氨基酸代謝和β-丙氨酸代謝。同時發(fā)現(xiàn)重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi中69個基因的表達水平與原始菌相比有明顯差異,包括36個上調(diào)基因和33個下調(diào)基因,見圖5(b)。其中重組菌株構建的相關基因顯示出相應的表達差異,包括基因pgi(log2FC=3.96,FDR=0.000 013)表達水平上調(diào)了15.7倍,而基因zwf(log2FC=-2.556,FDR=0.000 23)表達水平下調(diào)了83.1%?；贙EGG途徑富集分析,這些基因被歸類至6個主要細胞過程(見表6),即ATP結合盒(ABC家族蛋白)轉運系統(tǒng)、磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、谷胱甘肽代謝、碳代謝和肌醇磷酸代謝。

表6 重組菌和出發(fā)菌株之間RNA-seq數(shù)據(jù)的差異基因表達分析Table 6 Differential gene expression analysis of RNA-seq data between the recombinant and original strain

續(xù)表6

2.5 敲 除 工 程 菌C.glutamicum XQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)中panD基因提高其賴氨酸產(chǎn)量

基于轉錄組數(shù)據(jù)和KEGG分析中差異表達的基因信息,發(fā)現(xiàn)由于胞內(nèi)NADPH水平的提高,重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)中編碼天冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因的表達水平也提高了,見表6,表明基因panD可能受到NADPH的調(diào)控。而panD基因表達水平的提高使更多的天冬氨酸流向合成β-丙氨酸的途徑,天冬氨酸是賴氨酸合成的重要前體,panD基因的表達水平提高對于目標產(chǎn)物賴氨酸的合成是非常不利的,這也可能是重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)中賴氨酸產(chǎn)量減少的潛在原因。因此,通過基因敲除策略,敲除重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)基因組中的panD基因以構建菌株C.glutamicumXQ-5ΔpanDΔpgi：：(zwf-gnd),來實現(xiàn)阻斷該途徑的目的。以C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)和C.glutamicumXQ-5ΔpanDΔpgi：：(zwf-gnd)基因組為模板進行PCR驗證,結果表明panD基因已被成功敲除。與菌株C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwfgnd)相比,panD幾乎不在菌株C.glutamicumXQ-5ΔpanDΔpgi：：(zwf-gnd)中表達。在相同條件下,將兩個菌株進行搖瓶發(fā)酵。菌株C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd) 和 菌 株C.glutamicumXQ-5ΔpanDΔpgi：：(zwf-gnd)之間的細胞生長和葡萄糖消耗幾乎相同,見圖6(a)、(b),但賴氨酸的產(chǎn)量從最初的41 g/L提高到55 g/L,見圖6(c),比出發(fā)菌株C.glutamicumXQ-5的賴氨酸產(chǎn)量48 g/L提高了14.3%。這些結果表明,基因panD的表達水平上調(diào)是重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)與出發(fā)菌C.glutamicumXQ-5相比賴氨酸合成減少的原因之一。

圖6 重組菌C.glutamicum XQ-5ΔpanDΔpgi：(zwf-gnd)的發(fā)酵參數(shù)Fig.6 Fermentation parameters of recombinant strain C.glutamicum XQ-5ΔpanDΔpgi：：(zwf-gnd)

3 結語

該研究中對一賴氨酸產(chǎn)生菌C.glutamicumXQ-5進行基因工程改造,構建了自殺型質粒pKl8mobsacB-Δpgi：：(zwf-gnd)和pKl8mobsacBΔzwf：：pgi。其中pKl8mobsacB-Δpgi：：(zwf-gnd)用于將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因gnd替換6-磷酸葡萄糖異構酶編碼基因pgi,來過表達PPP途徑,阻斷糖酵解途徑,從而構建了提高胞內(nèi)NADPH水平的重組菌C.glutamicumXQ -5Δpgi：： (zwf-gnd)。pKl8mobsacB-Δzwf：：pgi用于將6-磷酸葡萄糖異構酶編碼基因pgi替換葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf,來阻斷PPP途徑,過表達糖酵解途徑,從而構建了降低胞內(nèi)NADPH水平的重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi。對出發(fā)菌和重組菌進行搖瓶發(fā)酵實驗,在3種不同的輔因子NADPH水平下,對胞內(nèi)氧化還原輔因子(NAD+、NADH、NADP+和NADPH)和能量輔因子(ATP、ADP和AMP)進行分析和比較。由于強化了糖酵解途徑,重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi胞內(nèi)NADPH水平較出發(fā)菌降低了68.6%,NADPH/NADP+降低了28.8%,NADH含量提高了44.8%,NADH/NAD+提高了88.5%,ATP含量提高了111.2%。在以葡萄糖為單一碳源的CGXIIG培養(yǎng)基中,重組菌C.glutamicumXQ-5Δzwf：：pgi的葡萄糖代謝能力在對數(shù)生長前期強于出發(fā)菌株,發(fā)酵12 h以后生長速率下降并很快進入穩(wěn)定期,最終菌體量與出發(fā)菌相比降低了32.1%。其L-賴氨酸產(chǎn)量降低了82.4%,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸合成量也都明顯降低,而在胞內(nèi)積累了大量副產(chǎn)物,如丙酮酸、乳酸等。由于阻斷了糖酵解途徑,重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)胞內(nèi)NADPH水平較出發(fā)菌提高了404.2%,NADPH/NADP+提高了109.9%,NADH含量降低了22.1%,NADH/NAD+降低了34.6%,ATP含量提高了29.7%。在以葡萄糖為唯一碳源的CGXIIG培養(yǎng)基中,重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)通過PPP途徑代謝碳源,葡萄糖代謝能力明顯弱于出發(fā)菌株,菌體生長緩慢,進入穩(wěn)定期的時間延長,并且最終菌體量與出發(fā)菌相比降低了11.4%。雖然NADPH有所提高,但是L-賴氨酸產(chǎn)量卻降低了11.8%,纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸合成量也都明顯降低,而在胞內(nèi)積累了大量副產(chǎn)物,如丙酮酸、乳酸等。

通過出發(fā)菌和重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)之間的轉錄數(shù)據(jù)分析,經(jīng)過改造的重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)基因組中天冬氨酸-α-脫羧酶基因panD表達水平比出發(fā)菌株提高了7.1倍。通過基因敲除技術將重組菌C.glutamicumXQ-5Δpgi：：(zwf-gnd)中的panD基因進行剔除,獲得重組菌C.glutamicumXQ-5ΔpanDΔpgi：：(zwf-gnd),通過搖瓶發(fā)酵,賴氨酸產(chǎn)量為55 g/L,比出發(fā)菌C.glutamicumXQ-5提高了14.3%。實驗結果證實,單純通過阻斷糖酵解途徑、過表達PPP途徑來提高NADPH水平,會使重組菌賴氨酸合成途徑中某些關鍵基因表達水平發(fā)生變化,這也是其賴氨酸產(chǎn)量有所下降的原因之一。并且,改變胞內(nèi)NADPH的水平,胞內(nèi)微環(huán)境,如氧化還原平衡等,會受到擾動,此時菌體生長和代謝也會受到影響,而對L-賴氨酸產(chǎn)量的影響尤為明顯。因此,細菌可能會將代謝產(chǎn)物的合成轉換為電子吸收體,以避免高還原環(huán)境的有害作用。該研究為進一步解析輔因子NADPH調(diào)控L-賴氨酸產(chǎn)生菌的胞內(nèi)微環(huán)境的生理機制奠定了基礎。