茍 萌，胡 婕，張彤彤，劇 檸

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川750021)

原料乳指的是未經(jīng)加工處理的生鮮牛乳,在富含多種天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí),也為微生物生長(zhǎng)提供了絕佳的環(huán)境[1]。原料乳中微生物種類繁多,導(dǎo)致乳及乳制品在存儲(chǔ)及加工過(guò)程中的變化具有復(fù)雜性。細(xì)菌是導(dǎo)致原料乳品質(zhì)變化的主要微生物[2]。因此,研究原料乳中的細(xì)菌種類及數(shù)量對(duì)乳及乳制品的品質(zhì)控制尤為重要。早期的微生物純培養(yǎng)法、傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增等技術(shù)操作復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度低,已經(jīng)無(wú)法滿足對(duì)乳及乳制品中微生物的深入研究。高通量測(cè)序技術(shù)也叫第二代測(cè)序技術(shù),具有時(shí)效高、精度高、通量高、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),目前已被廣泛應(yīng)用于腸道環(huán)境、土壤、食品等領(lǐng)域的微生物多樣性研究。

近年來(lái)各類測(cè)序平臺(tái)快速發(fā)展,研究表明,不同測(cè)序平臺(tái)因測(cè)序質(zhì)量與深度的不同,對(duì)相同樣本亦可產(chǎn)生不同的微生物多樣性結(jié)果[3-4]。Illumina MiSeq測(cè)序與IonS5 XL測(cè)序是目前常用的高通量測(cè)序平臺(tái)。Illumina MiSeq測(cè)序能夠使多個(gè)樣品在不同區(qū)域內(nèi)同步測(cè)序,其讀長(zhǎng)較短,結(jié)果準(zhǔn)確性高,覆蓋度深,已被廣泛用于研究醋[5]、豆醬[6]和茶葉[7]等食品,也是目前研究原料乳[8-9]、巴氏殺菌乳[10]、發(fā)酵乳[11]以及干酪[12]中微生物群落結(jié)構(gòu)的重要工具。IonS5 XL測(cè)序平臺(tái)的讀長(zhǎng)長(zhǎng)于Illumina MiSeq平臺(tái),最長(zhǎng)可達(dá)600 bp。測(cè)序時(shí)間比Illumina MiSeq更短,且成本更低,多被應(yīng)用于腸道菌群、發(fā)酵肉[13]、冰鮮雞肉[14]的微生物菌相分析,在乳及乳制品微生物研究中的應(yīng)用報(bào)道較少?；贗onS5 XL測(cè)序時(shí)效性高、成本低的優(yōu)點(diǎn),利用它對(duì)原料乳中微生物進(jìn)行測(cè)序,探究其是否適用于乳及乳制品微生物多樣性的研究,能夠?yàn)楂@取更加準(zhǔn)確全面的乳及乳制品微生物信息提供方法依據(jù)。

作者以原料乳為研究對(duì)象,采用16SrDNA擴(kuò)增子技術(shù),利用Illumina MiSeq和IonS5 XL兩種不同的測(cè)序平臺(tái)對(duì)原料乳中微生物多樣性進(jìn)行分析,通過(guò)OTU聚類分析、alpha多樣性分析、物種注釋和豐度分析,探討兩種測(cè)序平臺(tái)結(jié)果一致性,比較兩種測(cè)序平臺(tái)之間的差異,分析各自的優(yōu)缺點(diǎn)及適用性,為今后乳及乳制品微生物測(cè)序平臺(tái)的選擇、群落結(jié)構(gòu)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、設(shè)備及試劑

TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；C200凝膠成像分析系統(tǒng)：北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；核酸純度測(cè)定儀：德國(guó)TITERTEK BERTHOLD公司產(chǎn)品。

DNeasy PowerFood Microbial Kit(100)試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒：美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國(guó)AXYGEN公司產(chǎn)品；GeneJET凝膠回收試劑盒：Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒：Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品收集及預(yù)處理 嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作,采集寧夏銀川市某乳品企業(yè)乳罐中原料乳樣品,經(jīng)無(wú)菌容器密封后放入4℃車載冰箱,2小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,在4℃冰箱中冷藏72 h后進(jìn)行樣品總細(xì)菌DNA的提取。

1.2.2 DNA的提取 在QIAGEN DNeasy PowerFood Microbial Kit(100)試劑盒的改良基礎(chǔ)上提取總DNA,具體操作如下：先將10 mL均質(zhì)原料乳樣在5 000g、4℃下離心10 min,去除多余上清液和脂肪,再加入3 mL無(wú)菌水,使用渦旋混勻器將無(wú)菌水和菌體沉淀混勻后,5 000g、4℃下離心5 min,去除多余的上清液和脂肪,加入2 mL PBS緩沖液,混勻后吸取2 mL菌液,按照QIAGEN DNeasy PowerFood Microbial Kit(100)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作,并在第(4)步(轉(zhuǎn)移重懸的細(xì)胞到PowerBead Tube上)之后進(jìn)行55℃、10 min水浴,在第(19)步(在白色濾膜中加入100μL EB溶液,13 000g離心1 min)改為加入80μL EB溶液。

將提取的DNA用1.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳和核酸純度測(cè)定儀進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。DNA樣品混勻后平分6份,分別編號(hào)為1—6,置于-20℃冰箱凍存,送樣備用。

1.2.3 Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的檢測(cè) 1—3號(hào)核酸樣本采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。選擇細(xì)菌的16S rRNA基因的V4—V5區(qū)作為目的擴(kuò)增段,使用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和引物907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為(25.0μL)：5×reaction buffer 5.0μL,5×GC buffer 5.0μL,dNTP(2.5 mmol/L)2.0μL,正向引物(10μmol/L)1.0μL,反向引物(10μmol/L)1.0μL,DNA模板2.0μL,ddH2O 8.7μL,Q5高保真DNA聚合酶0.3μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,進(jìn)行25次循環(huán)；最后72℃延伸5 min。使用2.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。將擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量,使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒制備測(cè)序文庫(kù),2.0 g/dL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫(kù)最終的片段選擇與純化,在Solex MiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行300 bp雙端測(cè)序。

1.2.4 IonS5 XL測(cè)序平臺(tái)的檢測(cè) 4—6號(hào)核酸樣本采用IonS5 XL平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。選擇細(xì)菌的16S rRNA基因的V4—V5區(qū)作為目的擴(kuò)增段,將DNA樣本使用無(wú)菌水統(tǒng)一稀釋至1 ng/μL。用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和引物806R(CCGT CAATTCMTTTRAGTTT)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為(30.0μL)：Phusion Master Mix(2×)15.0μL,引物(2μmol/L)3.0μL,DNA模板10.0μL,H2O 2.0μL。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。使用2.0 g/dL的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣后采用1×TAE電泳緩沖液,2.0 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物,采用Thermo Scientific公司GeneJET凝膠回收試劑盒切膠回收產(chǎn)物。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后,使用IonS5 XL進(jìn)行400 bp單端測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)優(yōu)化處理與分析 獲得原始數(shù)據(jù)(raw data)后使用FLASH軟件和Trimmomatic軟件對(duì)其分別進(jìn)行拼接和質(zhì)控,設(shè)置50 bp的窗口,去除平均長(zhǎng)度小于20 bp的序列后端的序列,再去除質(zhì)控后長(zhǎng)度小于50 bp及含N堿基的序列；將Overlap長(zhǎng)度小于10 bp及錯(cuò)配比率大于0.2的序列去除,根據(jù)序列首尾兩端的Barcode和引物區(qū)分樣品并調(diào)整序列方向,Barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2,去除存在模糊堿基的序列,最終得到優(yōu)化序列。

利用Uparse 7.1(http：//www.drive5.com/uparse/)在97%相似度下進(jìn)行OTU聚類,對(duì)于優(yōu)化序列,去除單序列,并在聚類過(guò)程中去除嵌合體；參考Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.arb-silva.de),采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,以獲取每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息,置信度閾值為0.7。利用Mothur 1.30.2(https：//www.mothur.org/wiki/Download_mothur)進(jìn)行alpha多樣性分析,并利用R語(yǔ)言制作稀釋曲線、豐度等級(jí)曲線、Venn圖、群落柱形圖以及主成分分析(PCA)圖。通過(guò)OTU的物種注釋信息并結(jié)合OTU豐度表對(duì)門和屬兩個(gè)生物學(xué)水平上的物種豐度結(jié)果進(jìn)行物種多樣性和測(cè)序重復(fù)性比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)控結(jié)果比較

測(cè)序得到的最初的序列即為原始序列,其中存在一定比例的干擾數(shù)據(jù),對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,得到有效序列后進(jìn)行OTU聚類和物種分類分析。由兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)及質(zhì)控結(jié)果比較(見表1)可知,Illumina MiSeq測(cè)序得到的原始序列數(shù)低于IonS5 XL測(cè)序,但經(jīng)過(guò)相同的質(zhì)控參數(shù)優(yōu)化處理后,Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的有效序列在原始序列中所占比例為89.61%,高于IonS5 XL測(cè)序的76.13%的結(jié)果,說(shuō)明IonS5 XL測(cè)序得到的原始序列數(shù)據(jù)量雖然大,但低質(zhì)量序列數(shù)目較多。而由兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)所得出的平均讀長(zhǎng)可以看出,IonS5 XL測(cè)序的序列平均讀長(zhǎng)為410 bp,高于Illumina MiSeq測(cè)序得出的平均讀長(zhǎng)372 bp。因此,雖然IonS5 XL測(cè)序平臺(tái)識(shí)別出較多的原始序列數(shù),但可能是由于這些原始序列并非全部為高質(zhì)量序列,經(jīng)質(zhì)控處理后低質(zhì)量序列最終被剔除。

表1 Illumina MiSeq測(cè)序和IonS5 XL測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)比較Table 1 Statistical comparison between Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.2 OTU分類地位鑒定結(jié)果比較

從門、綱、目、科、屬各分類學(xué)水平下注釋物種數(shù)來(lái)看(見表2),IonS5 XL平臺(tái)注釋出的物種數(shù)目均多于Illumina MiSeq平臺(tái),分別是Illumina MiSeq的1.6倍、1.5倍、1.6倍、1.6倍、1.9倍,總OTU數(shù)為Illumina MiSeq測(cè)序的2.5倍。可見IonS5 XL測(cè)序能夠得到更多的物種信息。

表2 Illumina MiSeq測(cè)序和IonS5 XL測(cè)序在各分類水平上注釋物種數(shù)比較Table 2 Comparison of the annotated species numbers at each taxonomic level between Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.3 Alpha多樣性結(jié)果比較

2.3.1 多樣性指數(shù)結(jié)果比較 微生物群落alpha多樣性可由多種指數(shù)反映。不同的指數(shù)對(duì)于衡量群落多樣性的側(cè)重點(diǎn)各不相同,常用的度量指數(shù)主要包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度的Chao1指數(shù)和ace指數(shù),兼顧群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),以及反映群落覆蓋度的Coverage指數(shù)。一般而言,Chao1或ace指數(shù)越大,表明群落的豐富度越高；Shannon值越大,說(shuō)明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)值越大,說(shuō)明群落多樣性越低。通常Shannon指數(shù)對(duì)群落的豐富度以及稀有OTU更敏感,而Simpson指數(shù)對(duì)均勻度和群落中的優(yōu)勢(shì)OTU更敏感。Coverage是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率,其數(shù)值越高,則樣本中序列被測(cè)出的概率越高。該指數(shù)反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況[5]。Alpha多樣性指數(shù)表(見表3)顯示,兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)所得出的Coverage值均高于99.00%,說(shuō)明樣品文庫(kù)覆蓋率足夠大,兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)的結(jié)果足夠反應(yīng)樣本的真實(shí)情況；就Chao1指數(shù)和ace指數(shù)而言,IonS5 XL平臺(tái)檢測(cè)到的結(jié)果分別為Illumina MiSeq平臺(tái)檢測(cè)到的2.2倍和2.09倍,且差異性顯著(P﹤0.05),表明IonS5 XL測(cè)序檢測(cè)到的物種豐富度要高于Illumina MiSeq測(cè)序；IonS5 XL測(cè)序的Shannon指數(shù)是Illumina MiSeq測(cè)序的1.32倍,Illumina MiSeq測(cè)序樣本的Simpson指數(shù)是IonS5 XL測(cè)序的1.58倍,這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中IonS5 XL測(cè)序所得到的微生物結(jié)構(gòu)可能會(huì)更加豐富。

表3 Illumina MiSeq測(cè)序和IonS5 XL測(cè)序的alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.3.2 稀釋曲線結(jié)果比較 稀釋曲線可直接反映當(dāng)前測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性,并間接反映樣本物種的豐富程度,當(dāng)曲線趨向平坦時(shí),說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理,增加數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種。兩測(cè)序平臺(tái)的稀釋曲線見圖1,橫坐標(biāo)代表隨機(jī)抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量,縱坐標(biāo)代表觀測(cè)到的物種數(shù)量。對(duì)Illumina MiSeq和IonS5 XL測(cè)序所得序列進(jìn)行抽樣分析,隨著測(cè)序深度的增加,曲線逐漸變得平坦,表明原料乳樣品中絕大部分微生物已經(jīng)被檢測(cè)出,此測(cè)序水平可以表示出樣品微生物的多樣性,兩個(gè)平臺(tái)的測(cè)序量均可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 Illumina MiSeq測(cè)序和IonS5 XL測(cè)序的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction Curve of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.4 豐度等級(jí)曲線結(jié)果比較

豐度等級(jí)曲線的橫坐標(biāo)代表某分類學(xué)水平下的OTU數(shù)目排序等級(jí),縱坐標(biāo)表示該分類水平下物種數(shù)目的相對(duì)百分含量,樣本曲線延伸終點(diǎn)的橫坐標(biāo)位置為該樣本的物種數(shù)量,若曲線下降平緩則表明樣本的物種多樣性越高,而曲線下降快速陡峭則表明樣本中的優(yōu)勢(shì)菌群所占比例很高,物種多樣性較低。隨著物種等級(jí)的增加,兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)得出的相對(duì)豐度均降低并逐漸趨于平緩(見圖2),表明此測(cè)序水平下,二者均已檢測(cè)出原料乳中絕大部分微生物。而Illumina MiSeq測(cè)序得到的豐度等級(jí)曲線下降比較陡峭,IonS5 XL測(cè)序得到的曲線下降較為平緩,說(shuō)明IonS5 XL測(cè)序比Illumina MiSeq測(cè)序所得的物種數(shù)量多。

圖2 Illumina MiSeq測(cè)序和IonS5XL測(cè)序的豐度等級(jí)曲線圖Fig.2 Rank abundance of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.5 細(xì)菌的物種分類注釋結(jié)果比較

2.5.1 門水平上的物種相對(duì)豐度 在門水平上,Illumina MiSeq平臺(tái)檢測(cè)到了8個(gè)細(xì)菌門,IonS5 XL平臺(tái)檢測(cè)到13個(gè)細(xì)菌門(見表2),說(shuō)明原料乳的微生物多樣性組成豐富,并且IonS5 XL測(cè)序覆蓋的細(xì)菌菌群比Illumina MiSeq測(cè)序更加廣泛。進(jìn)一步分析比較門分類水平下Illumina MiSeq與IonS5 XL測(cè)序的物種相對(duì)豐度可知(見圖3),兩個(gè)平臺(tái)檢測(cè)到原料乳中的優(yōu)勢(shì)菌門組成差別不大,且優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門(Proteobacteria),這與前人報(bào)道一致[1,8,11]。Illumina MiSeq測(cè)序與IonS5 XL測(cè)序所檢出的變形菌門平均相對(duì)豐度分別為72.4%和58.8%,但差異性并不顯著(P>0.05)。擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)也是原料乳中常見的菌門[15-17],且兩測(cè)序平臺(tái)相對(duì)豐度的差異性也并不顯著(P>0.05)。Mareike等[18]采用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)法對(duì)冷藏72 h原料乳中的微生物進(jìn)行研究,所分離鑒定出的菌株歸屬于擬桿菌門、厚壁菌門與變形菌門,與作者所選用的兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)菌門結(jié)果一致,說(shuō)明兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)在分析乳中微生物方面結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖3 門分類水平下Illumina MiSeq與IonS5 XL測(cè)序的物種相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of predominant bacteria in phylum classification level of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.5.2 屬水平上的物種相對(duì)豐度及差異 Illumina MiSeq測(cè)序檢測(cè)到123個(gè)細(xì)菌屬,IonS5 XL測(cè)序檢測(cè)到178個(gè)細(xì)菌屬(見表2)。對(duì)兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)屬水平上的物種豐度進(jìn)行進(jìn)一步研究分析(見圖4),Illumina MiSeq與IonS5 XL平臺(tái)所檢測(cè)到原料乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬均為假單胞桿菌屬(Pseudomonas),在已檢測(cè)出的細(xì)菌屬中平均占比分別為56.6%和48.1%,見圖5,差異性不顯著(P>0.05)。兩測(cè)序平臺(tái)也都在原料乳中檢出了金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),以及少量沙雷氏菌屬(Serratia)和另支菌屬(Alistipes),相對(duì)豐度的差異均不顯著(P>0.05)。先前的研究顯示,盡管環(huán)境、泌乳期、冷藏溫度等因素會(huì)造成原料乳中微生物存在差異,但其中主要菌屬結(jié)構(gòu)相同。李玲等[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)原料乳冷藏過(guò)程中微生物多樣性進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,冷藏72 h后原料乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞桿菌屬,相對(duì)豐度高達(dá)51.0%；Nuwan[19]利用MALDI-TOF MS和16S rRNA技術(shù)對(duì)原料乳中嗜冷微生物進(jìn)行分離鑒定,得到的604株分離菌株有19.9%屬于假單胞桿菌屬；于國(guó)萍等[20]研究原料乳時(shí),不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度也位于前列。Mareike[18]利用選擇性培養(yǎng)法獲得了乳中的黃桿菌屬菌種。因此,在原料乳優(yōu)勢(shì)菌屬的檢測(cè)上,兩個(gè)平臺(tái)的結(jié)果均可滿足準(zhǔn)確性的要求。

圖4 屬分類水平下Illumina MiSeq與IonS5 XL測(cè)序的物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of predominant bacteria in genus classification level of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

圖5 Illumina MiSeq測(cè)序與IonS5 XL測(cè)序?qū)偎蕉辔锓N差異檢驗(yàn)柱形圖Fig.5 Wilcoxon rank-sum test bar plot on Genus level of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

2.6 測(cè)序平臺(tái)穩(wěn)定性比較

分別對(duì)兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)的平行樣本中共有和獨(dú)有的OTU進(jìn)行Venn圖繪制(見圖6),Illumina MiSeq測(cè)序檢測(cè)到平行樣本中共有的OTU個(gè)數(shù)為85,占所有OTU的57.4%；IonS5 XL測(cè)序檢測(cè)到原料乳中共有的OTU個(gè)數(shù)為154,占所有OTU的40.5%。Illumina MiSeq測(cè)序得到的各平行樣本的獨(dú)有OTU數(shù)目差距較小,而IonS5 XL測(cè)序的各平行樣本的獨(dú)有OTU數(shù)目差距較大?？沙醪秸J(rèn)為針對(duì)原料乳菌群多樣性的研究,Illumina MiSeq平臺(tái)的重復(fù)性優(yōu)于IonS5 XL平臺(tái)。此外,從稀釋曲線(見圖1)以及DNA樣品豐度等級(jí)曲線(見圖2)來(lái)看,Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)得的3個(gè)平行樣本的物種數(shù)量以及豐度等級(jí)的重合度均高于IonS5 XL平臺(tái)。

圖6 Illumina MiSeq測(cè)序和IonS5 XL測(cè)序基于OTU的Venn分析比較Fig.6 Venn analysis comparison based on OTU between Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

主成分分析(PCA)是通過(guò)分析不同樣本群落組成,反映樣本間的差異和距離。樣本物種組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近[21]。圖7可以看到Illumina MiSeq測(cè)序的3個(gè)樣本點(diǎn)距離較近,其中兩個(gè)樣本點(diǎn)有重疊現(xiàn)象,說(shuō)明平行樣本之間差異較小。而IonS5 XL測(cè)序的3個(gè)樣本點(diǎn)距離較遠(yuǎn),分布離散,群落結(jié)構(gòu)差異較大。再次證明了本實(shí)驗(yàn)中,Illumina MiSeq平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性與生物學(xué)重復(fù)性。

圖7 Illumina MiSeq與IonS5 XL測(cè)序?qū)颖緦偎降腜CA分析Fig.7 PCA analysis on genus level of Illumina MiSeq sequencing and IonS5 XL sequencing

通過(guò)門水平和屬水平上細(xì)菌相對(duì)豐度的分析,可以看出隨著分類水平的降低,兩個(gè)平臺(tái)所檢出的物種豐富度差異增大,在屬水平上,IonS5 XL測(cè)序檢測(cè)得到的菌屬種類要多于Illumina MiSeq測(cè)序。然而兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)所檢出的優(yōu)勢(shì)菌屬相同,對(duì)兩個(gè)平臺(tái)所得到的各優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間并不存在顯著性差異。Anna等[22]采用Illumina MiSeq與IonS5用于草藥茶的微生物組成分析,最終兩個(gè)平臺(tái)在定性和定量上都產(chǎn)生了一致的結(jié)果。本研究中,可初步認(rèn)為兩個(gè)平臺(tái)對(duì)原料乳中優(yōu)勢(shì)菌群的檢測(cè)結(jié)果具有一致性,且對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的檢測(cè)均具有準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)群落組成差異雖然不顯著,但依然可以看出優(yōu)勢(shì)菌群在Illumina MiSeq測(cè)序結(jié)果中的占比與IonS5 XL測(cè)序結(jié)果相比較高,IonS5 XL測(cè)序所檢出的菌屬尤其稀有菌屬多于Illumina MiSeq測(cè)序。何世耀等[3]的研究表明測(cè)序深度會(huì)影響微生物群落的豐富度。測(cè)序深度較低時(shí),環(huán)境中的群落大多由高豐度微生物組成,從而掩蓋了低豐度微生物信息,低估了環(huán)境微生物的多樣性。

此實(shí)驗(yàn)中,IonS5 XL測(cè)序結(jié)果表現(xiàn)出來(lái)的穩(wěn)定性和重復(fù)性不高,平行樣本間離散程度較大,這可能與數(shù)據(jù)量不足有關(guān),尚需大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繼續(xù)驗(yàn)證。另外,前人的研究中發(fā)現(xiàn),測(cè)序的錯(cuò)誤率會(huì)隨著讀長(zhǎng)增加而提升,需要在質(zhì)控環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制,降低錯(cuò)誤干擾[3]。即也可能是因?yàn)镮onS5 XL較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)引起的測(cè)序錯(cuò)誤,進(jìn)而影響了平行樣本間結(jié)果穩(wěn)定性。這也是后續(xù)比較測(cè)序平臺(tái)時(shí)可供參考的方向。

一個(gè)好的測(cè)序平臺(tái)應(yīng)當(dāng)具備測(cè)序時(shí)間短、生物學(xué)重復(fù)性良好、穩(wěn)定性高等特點(diǎn),并且能展示出全面準(zhǔn)確的物種多樣性信息。Illumina MiSeq測(cè)序是最常見的二代雙端測(cè)序平臺(tái)之一,測(cè)序時(shí)間大約為28~56 h,是常被用于乳品微生物研究領(lǐng)域的測(cè)序平臺(tái)之一[23]。IonS5 XL測(cè)序是Thermo公司近年來(lái)推出的較新的二代單端測(cè)序平臺(tái),能夠在較短的時(shí)間(約2~11 h)內(nèi)完成測(cè)序,且測(cè)序費(fèi)用低于Illumina Miseq平臺(tái),常被用于臨床試驗(yàn)及真菌多樣性的檢測(cè)[24],尚未見應(yīng)用于乳品研究領(lǐng)域的報(bào)道。作者比較了兩測(cè)序平臺(tái)在原料乳微生物多樣性中的應(yīng)用,結(jié)果顯示二者均能檢出相同的優(yōu)勢(shì)菌相,且相對(duì)豐度差異性不顯著,測(cè)序結(jié)果具有一致性。從物種豐富度來(lái)看,IonS5 XL測(cè)序可檢出乳中更多的低豐度微生物,獲得更全面的生物信息。但在各平臺(tái)3個(gè)平行樣本的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn),IonS5 XL測(cè)序的重現(xiàn)性不如Illumina MiSeq測(cè)序。后期需加大樣本量進(jìn)一步分析。相信經(jīng)過(guò)針對(duì)性改進(jìn)后,IonS5 XL測(cè)序?qū)⒃谌槠肺⑸镅芯款I(lǐng)域擁有更大的應(yīng)用空間。

3 結(jié)語(yǔ)

作者利用Illumina MiSeq與IonS5 XL兩種高通量測(cè)序?qū)υ先橹械奈⑸锒鄻有赃M(jìn)行研究。IonS5 XL與Illumina MiSeq兩種測(cè)序所得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)相同的預(yù)處理及質(zhì)控后,結(jié)果均可滿足實(shí)驗(yàn)需求。IonS5 XL高通量測(cè)序相較于Illumina MiSeq能夠獲得更多的OTU,鑒定出更多的微生物群落,且對(duì)低豐度菌群較為敏感。而Illumina MiSeq測(cè)序的廣泛度不夠,忽略了某些稀有物種,低估了樣本的微生物多樣性。在優(yōu)勢(shì)菌相上,兩測(cè)序平臺(tái)獲得的信息相同,差異性并不顯著,說(shuō)明IonS5 XL測(cè)序同樣適用于乳品微生物檢測(cè)。值得注意的是,無(wú)論是平行樣本之間稀釋曲線、豐度等級(jí)曲線以及物種豐度的結(jié)果,都顯示Illumina MiSeq測(cè)序結(jié)果的重現(xiàn)性優(yōu)于IonS5 XL測(cè)序。因此,Illumina MiSeq測(cè)序目前依然能夠?yàn)樵先槲⑸锒鄻有缘难芯刻峁┓€(wěn)定且較為全面準(zhǔn)確的測(cè)序信息,而IonS5 XL測(cè)序在針對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行改進(jìn)后,能夠替代Illumina MiSeq測(cè)序,更為全面、快捷地研究乳品微生物多樣性。