李武平 李婕 易南 劉宗義 黃思琪 朱付平

〔摘要〕 目的 觀察桃紅四物湯對大鼠后肢缺血-再灌注損傷骨骼肌鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKⅡ）、蛋白激酶C（PKC）表達的影響，從Wnt/Ca2+信號通路角度探討其作用機制。方法 取2月齡雄性SD大鼠80只，隨機分成正常組、模型組、桃紅四物湯組、阻滯劑組，每組20只。除正常組外，其他各組均阻斷血流復制右后肢缺血-再灌注損傷模型，桃紅四物湯組、阻滯劑組（FZR5、Wnt5a阻滯劑）在造模前分別予以桃紅四物湯灌胃、阻滯劑腹腔注射預處理。DAPI法觀察復灌后各組腓腸肌細胞凋亡變化;RT-qPCR檢測復灌后（0、2、4、8 h）腓腸肌CaMKⅡ、PKC mRNA的表達;免疫組化（IHC）檢測復灌后8 h腓腸肌中CaMKⅡ、PKC蛋白的陽性表達。結(jié)果 DAPI熒光染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、桃紅四物湯組、阻滯劑組大鼠腓腸肌細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組和阻滯劑組大鼠腓腸肌細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。RT-qPCR和IHC結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、桃紅四物湯組、阻滯劑組CaMKⅡ、PKC蛋白和mRNA表達一致性上調(diào)（P<0.05）;與模型組相比，桃紅四物湯組、阻滯劑組CaMKⅡ蛋白和mRNA表達一致性下調(diào)（P<0.05），PKC mRNA表達下調(diào)（P<0.05），但PKC蛋白表達下調(diào)不明顯（P>0.05），不同時間點顯示相同傾向性。結(jié)論 CaMKⅡ、PKC為大鼠肢體缺血-再灌注骨骼肌損傷中的關鍵蛋白，桃紅四物湯可通過調(diào)控Wnt5a/Ca2+信號通路下調(diào)CaMKⅡ表達來減輕肢體缺血-再灌注損傷，PKC不是Wnt5a/Ca2+信號通路中桃紅四物湯的主要作用靶點。

〔關鍵詞〕 肢體缺血-再灌注損傷;Wnt5a/Ca2+信號通路;鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II;蛋白激酶C;桃紅四物湯

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.05.005

Effect of Taohong Siwu Decoction on Expression of CaMKⅡ and PKC in Skeletal Muscle of

Rats with Hindlimb Ischemia-reperfusion Injury

LI Wuping1， LI Jie2， YI Nan1， LIU Zongyi1， HUANG Siqi1， ZHU Fuping1*

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of calmodulin dependent protein kinase II （CaMK II） and protein kinase C （PKC） in skeletal muscle of rats with hindlimb ischemia-reperfusion injury， and to explore its mechanism from the perspective of Wnt/Ca2+ signaling pathway. Methods 80 2-month-old male SD rats were randomly divided into normal group， model group， Taohong Siwu Decoction group and blocker group， with 20 rats in each group. In addition to the normal group， the right hindlimb ischemia-reperfusion injury model was established by blocking the blood flow in other groups. The Taohong Siwu Decoction group and the blocker group （FZR5， Wnt5a blocker） were treated by intragastric administration of Taohong Siwu Decoction and intraperitoneal injection of blocker respectively. DAPI method was used to observe the apoptosis of gastrocnemius muscle cells in each group after reperfusion. RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of CaMKII and PKC in gastrocnemius muscle at 0， 2， 4 and 8 hours after reperfusion. Immunohistochemistry （IHC） was used to detect the protein expression of CaMKII and PKC in gastrocnemius muscle at 8 hours after reperfusion. Results DAPI fluorescence staining results showed that， compared with the normal group， the apoptosis rate of gastrocnemius muscle cells in the model group， Taohong Siwu Decoction group and blocker group was significantly increased （P<0.05）; compared with the model group， the apoptosis rate of gastrocnemius muscle cells in the Taohong Siwu Decoction group and the blocker group was significantly decreased （P<0.05）. The results of RT-qPCR and IHC showed that， compared with the normal group， the protein and mRNA expression levels of CaMKII and PKC in model group， Taohong Siwu Decoction group and blocker group were up-regulated （P<0.05）; compared with the model group， the protein and mRNA expression levels of CaMKII in Taohong Siwu Decoction group and blocker group were down-regulated （P<0.05）， the expression of PKC mRNA was down-regulated （P<0.05）， but the expression of PKC protein was not significantly down-regulated （P>0.05）， and in different time points showed the same tendency. Conclusion CaMKII and PKC are key proteins in limb ischemia-reperfusion injury in rats， Taohong Siwu Decoction can reduce limb ischemia-reperfusion injury by regulating Wnt5a/Ca2+ signaling pathway and down regulating CaMKII expression， but PKC is not the main target of Taohong Siwu Decoction in Wnt5a/Ca2+ signaling pathway.

〔Keywords〕 limb ischemia reperfusion injury; Wnt5a/Ca2+ signaling pathway; calmodulin dependent protein kinase II; protein kinase C; Taohong Siwu Decoction

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia reperfusion injury， LIRI）是指肢體缺血一段時間后重新恢復血流灌注，組織器官的損傷程度不但沒有減輕反而較缺血時不斷加重，肢體功能進一步惡化的綜合征，是一種臨床上多發(fā)生于嚴重創(chuàng)傷后的復雜病理過程[1];目前，醫(yī)學界多認為其與脂質(zhì)過氧化及氧自由基損傷、鈣離子代謝紊亂、細胞凋亡、炎癥反應損害等有關，在其分子病理機制研究層面，信號分子靶向調(diào)控逐漸成為研究熱點[2-3];不同于Wnt/Ca2+信號通路在心、腦、肝、腎等臟器缺血-再灌注損傷方面的廣泛深入研究，Wnt/Ca2+信號通路在LIRI的機制研究則鮮見報道，甚至于骨骼肌型鈣調(diào)蛋白的研究也未見明顯成果出現(xiàn)[4]，LIRI骨骼肌損傷的具體分子機制目前也不完全清楚，中、西醫(yī)均沒有療效穩(wěn)定的防治方法[5]。本課題組前期通過對不同劑量桃紅四物湯預處理大鼠LIRI炎癥反應和骨骼肌細胞凋亡的影響的研究發(fā)現(xiàn)：中劑量組（0.15 g/mL）為最佳劑量，可顯著降低TNF-α和IL-1β炎癥因子水平，降低炎癥反應和細胞凋亡，從而減輕LIRI[6-7]。此外，本課題組體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)缺氧再給氧誘導損傷的大鼠骨骼肌細胞中，鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependent protein kinaseⅡ， CaMKⅡ）、蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）的表達顯著上調(diào)[8]。作為同屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶家族的CaMK Ⅱ、PKC，均是將上游病理應激信號與下游調(diào)節(jié)程序聯(lián)系起來的重要信號轉(zhuǎn)導介質(zhì)，是細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)換等過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子[9-10]，CaMKⅡ、PKC在大鼠體內(nèi)實驗中的表達變化情況值得進一步深入研究，因此，本研究設計動物實驗，制備大鼠LIRI骨骼肌損傷模型，以Wnt/Ca2+信號通路中上游信號分子Wnt5a的阻滯劑為陽性對照，通過桃紅四物湯干預來觀察CaMKⅡ、PKC表達，從Wnt/Ca2+信號通路角度進一步探討大鼠LIRI骨骼肌損傷機制及桃紅四物湯的干預作用，為豐富LIRI的病理機制和防治方法提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1? 動物

取80只2月齡SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量（230±10） g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0002。大鼠在湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心的無病原體設施中常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20～25 ℃、相對濕度50%～70%、光照12 h。本實驗已通過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查通過[倫理審查編號：HN-LL-GZR-201609]，動物福利按照國際相關實驗動物法規(guī)實施。

1.2? 主要藥物及試劑

桃紅四物湯方藥：桃仁15 g，紅花15 g，熟地黃10 g，赤芍10 g，當歸10 g，川芎10 g，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科結(jié)合現(xiàn)代工藝加工制成藥液（規(guī)格為250 mL/瓶，濃度為0.15 g/mL原料藥，批號：20160408）。FZR5（20 μg/mL，批號：20160206，美國Sigma公司）。

索來寶培養(yǎng)基（DMEM，批號：12100-500，北京索來寶科技有限公司）;GIBCO胎牛血清（FBS，批號：16000-044，北京智杰方遠科技有限公司）;0.25%胰蛋白酶-EDTA，（批號：T1350，北京索來寶科技有限公司）;1%青霉素+鏈霉素（批號：P1400，北京索來寶科技有限公司）;抗CaMKⅡ、抗PKC抗體（批號：BS4773、ab19031，北京博奧森生物技術有限公司）;Trizol[批號：15596-026，愛普拜斯應用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司];ReverTra Ace qPCR RT試劑盒（批號：FSQ101，東洋紡上海生物科技有限公司）;SYBRPremix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒（批號：DRR420A，大連寶生物工程公司）。

1.3? 主要儀器

酶標儀（上海培奧分析儀器有限公司）;7500實時PCR擴增儀（美國ABI公司）;GL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業(yè)有限公司）;BD-180S雙門冷凍柜（青島海爾冰箱通用有限公司）;GL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業(yè)有限公司）;BD-180S雙門冷凍柜（青島海爾冰箱通用有限公司）;NIS Elements F3.0軟件（日本東京尼康）;image pro plus version 6.0（美國Media Cybernetics公司）。

1.4? 分組與模型制備

將80只SD大鼠按隨機數(shù)字表分為正常組、模型組、桃紅四物湯組、阻滯劑組，每組20只。除正常組外，其他3組均采用課題組前期造模方法[6]用塑料套管和市售橡皮筋阻斷SD大鼠右后肢血流4 h，制造大鼠LIRI模型，正常組大鼠不阻斷血流。

1.5? 給藥方法

桃紅四物湯組于造模前3 d開始給予桃紅四物湯灌胃，2次/d，造模前2 h再給藥1次，共計7次，具體給藥劑量根據(jù)所測質(zhì)量通過體表面積-劑量換算法計算得出，藥物劑量濃度的選擇依據(jù)課題組前期臨床實驗顯示中劑量（0.15 g/mL原料藥）桃紅四物湯為最佳藥效濃度[7]，即每只大鼠每日給藥劑量為1 mL桃紅四物湯+3 mL蒸餾水;阻滯劑組造模前2 h予以腹腔注射1 mL FZR5;正常組和模型組動物在處死前不服用藥物，同樣的時間點給相同體積蒸餾水灌胃。

1.6? 標本采集與指標檢測

1.6.1? 取材? 在缺血再灌注0、2、4、8 h 4個時間點，各組隨機選取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定在自制大鼠手術臺上，右側(cè)后肢相應的區(qū)域剪發(fā)，復合碘消毒，沿右側(cè)后肢長軸方向依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜，充分顯露腓腸肌肌腹組織，切取腓腸肌100 mg，迅速用冰鹽水洗凈血液，濾紙吸干水份，剪刀切割剪碎后裝入保存管，置于在低溫冰箱（-70 ℃）保存。根據(jù)前期實驗結(jié)果[6-7]，細胞凋亡情況和蛋白的表達選擇缺血再灌注損傷后腓腸肌損傷最嚴重的時間點（8 h）進行檢測。

1.6.2? DAPI熒光染色觀察各組細胞凋亡情況? 取復灌后8 h大鼠部分腓腸肌組織，利用DAPI熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察骨骼肌細胞凋亡并使用Image-Pro Plus version 6.0圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，每張圖片取5個視野，凋亡指數(shù)=細胞核濃縮的細胞數(shù)/計算細胞總數(shù)×100%。

1.6.3? 免疫組化（IHC）檢測腓腸肌CaMKⅡ、PKC蛋白的表達? 提取復灌后8 h大鼠腓腸肌組織，多聚甲醛固定并切片，3%過氧化氫（H2O2）處理，并與10%山羊血清預孵育，然后與抗CaMK Ⅱ、抗PKC（1∶100） 抗體在4 ℃孵育后，用HRP標記的IgG孵育樣品，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進行顯色反應，在顯微鏡下觀察顯色過程。使用NIS Elements F3.0軟件在200倍放大的光學顯微鏡下采集圖像。用image pro plus versionv 6.0單盲法測量IHC圖像的積分光密度（IA）值以反映CaMKⅡ、PKC蛋白相對表達水平。

1.6.4? RT-qPCR檢測腓腸肌CaMKⅡ、PKC mRNA表達? 采用Trizol法提取腓腸肌總RNA，取約100 mg腓腸肌組織加入Trizol溶液，加Oligo dT 181 μL，5x M-MLV buffer 4 μL，總RNA 2 μL，M-MLV 1 μL，補水到20 μL體系，按照逆轉(zhuǎn)錄酶的說明書進行逆轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA。PCR反應體系：SYBR[R][○]Premix Ex

TaqTM（perfect real-time）試劑盒的mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（引物序列見表1），補水到20 μL體系。PCR反應條件：按照SYBR[R][○]Premix Ex

TaqTM（perfect real-time）試劑盒說明進行。以GAPDH的相對表達為對照，測定靶基因的相對表達量，并使用2-ΔΔCT計算目標mRNA的相對表達變化。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt對照組-ΔCt樣品組。

1.7? 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本t檢驗對建模前后數(shù)據(jù)進行比較，單因素方差分析（ANOVA）用于多重比較，然后進行Fisher最小顯著性差異檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組DAPI熒光染色結(jié)果比較

熒光顯微鏡下可見正常組細胞核呈圓形或橢圓形狀，核形完整，染色均勻;除正常組外，其余各組均可見凋亡小體，即核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包繞，細胞核邊緣不規(guī)則，細胞凋亡率明顯高于正常組（P<0.05）;桃紅四物湯組、阻滯劑組細胞著色較重，核出現(xiàn)濃縮、呈新月形聚集于核膜一邊，但細胞凋亡率明顯低于模型組（P<0.05）。結(jié)果見圖1、圖2。

2.2? 各組大鼠腓腸肌CaMKⅡ、PKC mRNA表達比較

與同一時間點正常組比較，模型組、桃紅四物湯組、阻滯劑組中CaMKⅡ、PKC mRNA表達上調(diào)（P<0.05）;與同一時間點模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組CaMKⅡ、PKC mRNA表達下調(diào)（P<0.05）。結(jié)果見圖3-4。

2.3? 各組間大鼠腓腸肌CaMKⅡ、PKC蛋白表達比較

與正常組比較，模型組、桃紅四物湯組、阻滯劑組中CaMKⅡ、PKC蛋白表達顯著上調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組CaMKⅡ表達下調(diào)（P<0.05）、PKC表達無顯著差異（P>0.05）。見圖5-7。

3 討論

對于缺血-再灌注損傷的前沿研究，目前主要集中在心、肝、腦、腎等重要內(nèi)臟器官方面，研究的熱點大多集中在Wnt/Ca2+通路中關鍵蛋白介導的細胞內(nèi)鈣超載以及炎癥因子釋放兩個方面[11-12]，團隊前期研究[13]也發(fā)現(xiàn)Wnt/Ca2+信號通路在LIRI鈣離子代謝及炎癥反應中起著至關重要的作用;CaMK Ⅱ、PKC是Wnt/Ca2+信號通路里起重要作用的兩個關鍵蛋白，是一組可依賴于Ca2+和肌醇磷脂信號激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在體內(nèi)廣泛存在，是細胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)換等過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子[9-10]，多項研究[14-17]發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ、PKC通過介導細胞內(nèi)鈣超載參與神經(jīng)、心肌、血管平滑肌等細胞的凋亡，而且證實降低CaMKⅡ、PKC的活性，抑制鈣超載發(fā)生機制可起到對受損細胞的保護作用，降低細胞凋亡的發(fā)生率。

中醫(yī)對于LIRI病機的認識多集中在瘀血內(nèi)阻，氣血運行不暢等方面，證屬“氣滯血瘀”，而治療則以“通行血脈”“化瘀消腫”為法，團隊前期研究[18]發(fā)現(xiàn)活血化瘀類中藥可以改變鈣調(diào)蛋白表達的強弱從而達到減輕LIRI骨骼肌細胞凋亡;桃紅四物湯是中醫(yī)傳統(tǒng)活血化瘀經(jīng)典方劑之一，近期研究[19-20]表明： 桃紅四物湯及其組成中藥（桃仁、紅花、當歸、川芍、地黃、赤芍）在臨床應用以及動物實驗中，均表現(xiàn)出對缺血-再灌注損傷性疾病有明顯干預效果。有學者[21-22]從基因傳導通路方面證實桃紅四物湯對腦缺血-再灌注損傷具有保護作用。本課題組體外細胞實驗研究[8]也發(fā)現(xiàn)：經(jīng)缺氧再給氧誘導損傷的大鼠骨骼肌細胞中，Wnt/Ca2+信號通路中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、蛋白激酶C（PKC）的表達顯著上調(diào)，而桃紅四物湯預處理后可通過調(diào)控Wnt/Ca2+信號通路中Wnt5a/IP3R/CaMKⅡ途徑來減輕LIRI。

本研究顯示：桃紅四物湯組、阻滯劑組細胞凋亡率低于模型組，說明阻滯劑、桃紅四物湯預處理可減少細胞凋亡，從而達到減輕LIRI作用。RT-qPCR和IHC結(jié)果顯示，與正常組相比，各組大鼠CaMKⅡ、PKC蛋白和其mRNA表達一致性上調(diào)（P<0.05），這說明CaMKⅡ、PKC是LIRI中的關鍵蛋白;與模型組相比，桃紅四物湯組、阻滯劑組CaMKⅡ蛋白及其mRNA表達一致性下調(diào)（P<0.05），提示CaMKⅡ是Wnt5a/Ca2+信號途徑的關鍵蛋白，通過桃紅四物湯干預可起到類似Wnt5a/Ca2+信號通路阻滯劑效應下調(diào)CaMKⅡ的表達從而減輕肢體缺血-再灌注損傷。與模型組比較，桃紅四物湯組、阻滯劑組PKC mRNA表達下調(diào)（P<0.05），但缺血再灌注損傷8 h后，桃紅四物湯組、阻滯劑組PKC蛋白表達和模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，PKC蛋白和其mRNA表達變化不一致，這提示PKC不是LIRI過程Wnt5a/Ca2+信號通路中的主要作用靶點。這一方面可能跟PKC調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域有關，研究[23]發(fā)現(xiàn)PKC包含12種以上的亞型，按照調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的不同將PKC分為3類：依賴于磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl serine， PS）、Ca2+和單酰甘油的傳統(tǒng)型PKC（conventional PKC， cPKC），由 α、βⅠ、βⅡ、γ等亞型組成;僅受DAG調(diào)控的新型PKC（noval PKC， nPKC），包括δ、ε、θ、η等亞型;無需Ca2+和DAG僅能被PS激活的非典型PKC（atypical PKC， aPKC），共有ι、λ、ζ、μ等亞型;另一方面，鑒于缺血-再灌注損傷復雜的病理生理機制、G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的復雜性以及Wnt/Ca2+通路與炎癥信號途徑組成了繁雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)等原因，因此，PKC可能不是LIRI過程中Wnt5a/Ca2+信號途徑桃紅四物湯的主要靶點，與課題組前期研究的體外實驗研究結(jié)果一致[8]。此外，本課題組主要探討研究“基于Wnt/Ca2+信號通路研究LIRI骨骼肌細胞凋亡機制及桃紅四物湯的干預作用”，因此，本研究從Wnt/Ca2+信號通路角度來探討LIRI的分子病理機制，在CaMKⅡ、PKC基因表達水平方面設計了0、2、4、8 h 4個時間點進行檢測，研究顯示，各組CaMKⅡ、PKC mRNA在不同再灌注時間（0、2、4、8 h）的表達顯示相同的傾向性，而本研究在設計檢測分析CaMK Ⅱ、PKC蛋白表達時，主要以復灌后8 h為主要研究時間點，同時也與本課題體外細胞實驗設計保持一致。

綜上所述，CaMKⅡ、PKC為大鼠肢體缺血-再灌注骨骼肌損傷中的關鍵蛋白，桃紅四物湯可通過調(diào)控Wnt5a/Ca2+信號通路下調(diào)CaMKⅡ表達來減輕肢體缺血-再灌注損傷，PKC不是Wnt5a/Ca2+信號通路中桃紅四物湯的主要作用靶點，這為LIRI骨骼肌細胞損傷的分子機制和桃紅四物湯的防治作用提供實驗證據(jù)。

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