何家國，杜 鑫，周鳳蓉，易珊珊，彭海燕，蔣金芳，覃明麗

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川 南充 637000)

柑橘富含大量維生素、糖分、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、 脂肪、食物纖維及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用和藥用價值[1]。四川省地處長江上游優(yōu)質(zhì)柑橘生產(chǎn)區(qū)，有130多個縣市區(qū)均種植柑橘，形成了各具特色的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)區(qū)域[2-3]。柑橘病蟲害種類繁多，主要病害有紅蜘蛛、潛葉蛾、炭疽病、蚧殼蟲、瘡痂病、樹脂病等，主要蟲害有蚜蟲類、粉虱類、蚧殼蟲類、落葉蛾等，危害日趨嚴(yán)重[4-8]。吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、咪鮮胺、樂果、阿維菌素等6種農(nóng)藥混合使用是防治上述病蟲害常用的有效殺菌劑、殺蟲劑及殺螨劑[8-9]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS /MS) 具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確及抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點，被用于檢測多種復(fù)雜基質(zhì)中吡蟲啉[10-12]、啶蟲脒[11-12 ]、多菌靈[13-15]、咪鮮胺[14-15]、樂果[16]、阿維菌素[17]等農(nóng)藥，已成為農(nóng)藥多殘留分析的主導(dǎo)技術(shù)和未來發(fā)展的趨勢，但尚未有UPLC-MS/MS同時檢測柑橘中吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、咪鮮胺、樂果和阿維菌素等6種農(nóng)藥殘留的分析報道。QuEChERS方法被廣泛應(yīng)用于凈化基質(zhì)提取液，具有操作簡易、溶劑用量少、分析速度快等優(yōu)點[18-19]。本研究將QuEChERS凈化方法與UPLC-MS/MS技術(shù)相結(jié)合，建立了同時快速檢測柑橘中上述6種農(nóng)藥殘留的分析方法，優(yōu)化了測定條件，實現(xiàn)了簡便、快速、準(zhǔn)確檢測大批量柑橘樣品。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，ML802型分析天平，HS501型振蕩搖床，3-18KS型高速冷凍離心機(jī)，Vortex Genius 3型旋渦混合器，N-EVAP112型氮吹儀，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，JB3060食品調(diào)理機(jī)，Milli-Q型超純水儀，15/50mL離心管，PTFE(0.22μm)針筒式微孔濾膜。

吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、咪鮮胺、樂果和阿維菌素等6種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，濃度均為1 000mg/L。甲醇、乙腈、甲苯、甲酸、氨水、甲酸均為色譜純。氯化鈉為分析純。QuEChERS試劑盒、石墨化碳黑氨基復(fù)合柱(ProElut Carbon/NH2， 500mg/500mg/6mL)及氨基固相萃取柱(SPE-NH2，500mg/6mL)。柑橘類水果樣品(橙、柑、橘、柚、檸檬等)。

1.2 樣品制備 取有代表性的柑橘全果樣品帶皮切碎，采用四分法縮分后約1kg，放入料理機(jī)中，高速勻漿均質(zhì)后裝入潔凈的塑料樣品盒中，密封后于-20℃冰箱保存(使用前先解凍至室溫)。

1.3 樣品提取 準(zhǔn)確稱取10g(精確到0.01g)勻漿后的柑橘樣品于50mL離心管中，加入20.00mL乙腈和1顆陶瓷均質(zhì)子，擰緊離心管蓋，搖床高速振蕩20min，加入3g氯化鈉，渦旋1min，5 000r/min離心5min，取上清液待凈化。

1.4 樣品凈化 SPE-NH2固相萃取法：準(zhǔn)確吸取上清液5.00～250mL錐形瓶中，40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入4mL甲醇+二氯甲烷(5+95，V/V)溶解殘余物，加入經(jīng)4mL甲醇+二氯甲烷(5+95，V/V)預(yù)活化后的氨基小柱中，用6mL甲醇+二氯甲烷(5+95，V/V)分2次涮洗錐形瓶后過柱，用雞心瓶收集全部洗脫液于30℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確加入2.50mL甲醇-水甲醇-水( 1:1，V/V)，渦旋混勻，過0.22μm濾膜后裝樣。

SPE- Carbon/NH2固相萃取法：準(zhǔn)確移取5.00mL上清液加入經(jīng)5mL乙腈-甲苯(3:1，V/V)預(yù)淋洗的石墨化碳黑氨基復(fù)合柱(ProElut Carbon/NH2)中，在柱上加50mL貯液器，用25mL乙腈-甲苯(3:1，V/V)洗脫農(nóng)藥，收集所有淋洗液于雞心瓶中，在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，準(zhǔn)確加入2.50mL甲醇-水( 1:1，V/V)溶解殘留物，渦旋混勻后過0.22μm濾膜，待上機(jī)檢測。

QuEChERS方法：吸取6mL上清液加到內(nèi)含900mg MgSO4+150mg PSA或885mg MgSO4+150mg PSA+15mg GCB的15mL塑料離心管中，渦旋混勻2min，5 000r/min離心5min，準(zhǔn)確吸取2.00mL上清液于5mL試管中，40℃水浴中氮氣吹至近干，加入1.00mL甲醇-水( 1:1，V/V)，混勻后過0.22μm濾膜，待上機(jī)測定。

1.5 儀器檢測條件

1.5.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(100mm×3.0mm， 3.5μm)，柱溫40℃，樣品室溫度16℃，進(jìn)樣體積1.00μL；流動相為含有體積分?jǐn)?shù)為0.05%甲酸的甲醇(A)、體積分?jǐn)?shù)為0.08%氨水和0.10%甲酸的水溶液(B)及乙腈(C)組成的混合溶液，按(表1)中的梯度洗脫程序分離目標(biāo)物。

表1 UPLC流動相組成和梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源的毛細(xì)管電壓為3.0kV，錐孔氣和脫溶劑氣都用高純氮氣，錐孔氣流量為150L/h，脫溶劑氣溫度為550℃，其流量為1 000L/h，碰撞氣用高純氬氣，其流量為0.12mL/min。采用電噴霧正離子模式(ESI+)和選擇多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜儀信號采集時間段為3.5～8.5min，并利用在線切換閥將其他時間段的液相色譜流動相切換到廢液，從而減少儀器污染。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確移取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇逐級稀釋成濃度為10mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃儲存(使用前放至室溫)。先將篩選出的臍橙空白樣品按前處理方法制成基質(zhì)溶液，按比例準(zhǔn)確加入一定體積的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化 先用甲醇-水(1:1，V:V)分別將6種農(nóng)藥儲備液逐級稀釋至0.5mg/L的單標(biāo)。選取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)為流動相。在ESI+電離模式下，為提高6種農(nóng)藥的電噴霧離子化效率，采取向甲醇中加入少量甲酸，水相中加入少量氨水和甲酸。

采取質(zhì)譜直接進(jìn)樣的方式來優(yōu)化質(zhì)譜條件，結(jié)合不同流動相體系對6種農(nóng)藥進(jìn)行了全掃描，分析其響應(yīng)信號強(qiáng)度，結(jié)合儀器“Intellistart”功能快速優(yōu)化出的質(zhì)譜參數(shù)(表2)。試驗發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，阿維菌素的加合離子峰主要以[M+Na]+形式出現(xiàn)，可能是因為阿維菌素分子結(jié)構(gòu)中的醚鍵及羰基上的氧更易與Na+結(jié)合的作用位點，整個流路體系中極少的Na+都會與之結(jié)合形成加鈉峰，而其余5種農(nóng)藥的[M+H]+加和離子峰響應(yīng)信號較強(qiáng)。

表2 6種農(nóng)藥在MRM模式下UPLC-MS/MS分析的質(zhì)譜參數(shù)

采用色譜進(jìn)樣，觀察目標(biāo)物的保留時間、峰形、響應(yīng)信號強(qiáng)度，優(yōu)化后的流速及流動相梯度體系等條件(表1)，6種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖1)。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜檢測條件下，6種農(nóng)藥在10min內(nèi)全部出峰，峰形及分離度很好，且都可獲得較強(qiáng)的分子離子峰強(qiáng)度。采用甲醇-乙腈-水體系并加入少量氨水和甲酸后，確實有利于提高目標(biāo)物的離子化效率，有效改善目標(biāo)物峰形，增強(qiáng)目標(biāo)物響應(yīng)信號，提高方法選擇性和靈敏度。

圖1 6種農(nóng)藥的試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

2.2 前處理方法的選擇 在農(nóng)藥多殘留分析中，常以乙腈、乙酸乙酯、丙酮及二氯甲烷等有機(jī)溶劑為提取劑，其中乙腈對農(nóng)藥的溶解性最強(qiáng)，對試樣中油脂和色素類雜質(zhì)的溶解度較小。利用鹽析法還可以除掉柑橘樣品乙腈提取液中的糖類、色素、維生素、有機(jī)酸物及脂肪等大部分雜質(zhì)，有利于下一步凈化提取液中仍殘留的各種干擾物質(zhì)，減弱樣品基質(zhì)干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)影響。試驗以臍橙為基質(zhì)，添加的農(nóng)藥含量為100.0μg/kg，分別考察了SPE-NH2、SPE-Carbon/NH2及以900mg MgSO4+150mg PSA或885mg MgSO4+150mg PSA+15mg GCB為分散劑的QuEChERS方法，分析加標(biāo)樣品中6種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率來考察凈化效果(圖2)。

圖2 不同凈化方法對目標(biāo)物回收率的影響

研究表明：采用SPE-NH2和PSA凈化時，6種農(nóng)藥的回收率相近，均在80%～105%，回收率良好。但使用Carbon/NH2和GCB凈化后，6種農(nóng)藥的回收率均有所降低，且發(fā)現(xiàn)多菌靈回收率僅約為35%，明顯低于其它兩種方法，這是因為GCB對具有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥具有很強(qiáng)的親和力[18]，導(dǎo)致具有類似結(jié)構(gòu)的多菌靈農(nóng)藥大部分被吸附在填料上，測定濃度減小，回收率降低。此外，通過比較SPE-NH2和PSA凈化后的空白基質(zhì)的色譜峰響應(yīng)信號，發(fā)現(xiàn)PSA凈化后的空白基質(zhì)溶液的色譜圖干擾峰更少，背景響應(yīng)信號更低，可見用PSA凈化樣品更干凈，于是選用900mg MgSO4+150mg PSA來凈化樣品，使得試樣前處理效率更高，溶劑用量極少，橙基質(zhì)空白及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(圖3～4)，表明凈化后的臍橙空白基質(zhì)不干擾樣品中目標(biāo)物的測定。

圖3 橙基質(zhì)空白MRM色譜圖

圖4 6種農(nóng)藥的橙空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響 基質(zhì)效應(yīng)是液質(zhì)聯(lián)用方法檢測中普遍存在的現(xiàn)象，可能是因為電噴霧離子化效率易受樣品基質(zhì)的影響或色譜分離中的共流出物影響了待測成分的離子化效率，從而導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)信號的改變[15-19]。用甲醇-水(1:1，V/V)試劑溶液和不同柑橘基質(zhì)溶液配制相同濃度的農(nóng)藥溶液，采用色譜進(jìn)樣來獲得目標(biāo)物的定量離子色譜峰面積，計算6種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)的相對強(qiáng)度(ME)，ME=農(nóng)藥在基質(zhì)中的定量離子對峰面積/農(nóng)藥在試劑中的定量離子對峰面積[20]，以ME對6種農(nóng)藥作圖，考察不同柑橘樣品基質(zhì)的影響，結(jié)果(圖5)。6種農(nóng)藥的ME值在1.01～1.27，說明6種農(nóng)藥在UPLC-MS/MS檢測中有略微的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

圖5 6種農(nóng)藥在4種柑橘基質(zhì)中的ME

為提高準(zhǔn)確性，實驗采用反相高效液相色譜法分離目標(biāo)化合物，減少共流出，減小基質(zhì)干擾，同時采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正方法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償。但是在批量檢測過程中，由于柑橘樣品種類眾多，很難做到每一種樣品均用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為此，對農(nóng)藥在春見、柚、橘和檸檬基質(zhì)中的ME與臍橙基質(zhì)的ME做了對比，(圖6)可以看出，6種農(nóng)藥的ME值均在0.91～1.07，說明不同品種柑橘的基質(zhì)效應(yīng)差異較小，為使定量結(jié)果更準(zhǔn)確，樣品應(yīng)統(tǒng)一采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算結(jié)果。

圖6 春見、柚、橘和檸檬的ME/臍橙的ME

2.4 方法的線性范圍和檢出限 用空白臍橙基質(zhì)溶液配制6種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以每種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子對的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)r均>0.997 9。用Masslynx V4.1軟件計算信噪比(S/N)，以S/N=3計算得到方法的檢出限為0.12～1.56μg/kg(表3)。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測模式下6種農(nóng)藥的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 方法的回收率與精密度 為模擬實樣檢測過程，準(zhǔn)確稱取10g均質(zhì)好的空白春見、柚、臍橙和檸檬4種樣品于50mL離心管中，每種農(nóng)藥分別添加5.00、10.0、100μg/kg 3個濃度水平，渦旋2min，密封過夜，待樣品充分吸收農(nóng)藥后，次日按照1.2～1.6節(jié)條件進(jìn)行樣品前處理及上機(jī)檢測，每個濃度水平做6個平行質(zhì)控樣品。以回收率(實際測定含量的平均值與參照值的百分比)表示準(zhǔn)確度，以回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示精密度，結(jié)果(表4)，6種農(nóng)藥在4種不同柑橘類水果中的加標(biāo)回收率為76.3%～112.4%，RSD為2.1%～9.4%，均滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求[21]。

表4 方法添加回收率和精密度(n=6)

2.6 實樣檢測 按本方法對30個柑橘樣品進(jìn)行檢測分析，每個樣品做平行雙樣，結(jié)果(表5)。6種農(nóng)藥在所有柑橘樣品中均有檢出，咪鮮胺檢出率最高，樂果檢出率最低；在有檢出的樣品中，咪鮮胺的平均含量最高，達(dá)到75.4μg/kg，其次是多菌靈64.8μg/kg、吡蟲啉52.5μg/kg，啶蟲脒37.1μg/kg，阿維菌素17.3μg/kg，樂果16.8μg/kg，檢測結(jié)果與前期調(diào)查的部分柑橘基地使用農(nóng)藥的情況也相符合。

表4 柑橘樣品6種農(nóng)藥的檢測結(jié)果濃度

3 結(jié)論

采用以PSA為基質(zhì)分散劑的QuEChERS方法凈化樣品，UPLC-MS/MS檢測柑橘類水果中吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、咪鮮胺、樂果和阿維菌素6種農(nóng)藥殘留量。該方法前處理過程簡便快速，方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測的要求，適用于大批量柑橘類水果樣品的日常檢測。