黃 蕙，楊細(xì)蓉，王 芳 ，何一斌，夏洪兵 ，李 婷

(1.成都彩虹電器(集團(tuán))股份有限公司，四川 成都 610045；2.四川省農(nóng)藥檢定所，四川 成都 610041)

白紋伊蚊是我國(guó)一種重要的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲(chóng)，是登革熱和基孔肯雅病的主要傳播媒介，感染實(shí)驗(yàn)表明還能傳播乙腦病毒等多種蟲(chóng)媒病毒病[1]，使用驅(qū)避劑是個(gè)人戶(hù)外防蚊的主要措施之一。目前市場(chǎng)上的驅(qū)避劑主流成分皆為化學(xué)農(nóng)藥，有避蚊胺，驅(qū)蚊酯，羥哌酯等，產(chǎn)品形式多為驅(qū)蚊液或驅(qū)蚊花露水。隨著國(guó)家農(nóng)藥綠色發(fā)展的趨勢(shì)，從植物中尋找驅(qū)蚊活性物質(zhì)受到了人們的重視。我國(guó)植物種類(lèi)豐富，為尋找植物源蚊蟲(chóng)驅(qū)避劑提供了豐富資源[2]。

桉樹(shù)(EucalyptusrobustaSmith)又稱(chēng)尤加利樹(shù)，是桃金娘科、桉屬植物的統(tǒng)稱(chēng)，它是全球擁有最多品種的樹(shù)種之一，有945個(gè)種和變種[3]。桉樹(shù)的樹(shù)根、花及葉都可供藥用且具有獨(dú)特的藥理活性。從藥學(xué)角度來(lái)說(shuō)，桉樹(shù)葉性平，味微辛且苦，可以用于治療流感、流腦以及各種炎癥，同時(shí)還可用于傷口殺菌、治療皮膚瘙癢、廯、紅腫等疾病[4-9]。桉葉素廣泛存在于藍(lán)桉、油樟、迷迭香鼠尾草等植物揮發(fā)油中，是經(jīng)一定工藝提取的桉樹(shù)活性物質(zhì)。

香茅(Cymbopogoncitratus)別名包茅、檸檬草，為禾本科香茅屬草本植物。在我國(guó)香茅屬植物有9種，其中有8種葉片含芳香油[10]，主要分布在云南、廣東、福建、廣西等省，種植面積可達(dá)數(shù)百公頃[11]。常用的爪哇型香茅油主要成分為香茅醛，香茅醇及香葉醇[12]。

經(jīng)過(guò)研究，桉葉油及香茅油因其自然揮發(fā)的氣味能讓蚊蟲(chóng)感到不適，從而逃離，能起到驅(qū)蚊的效果，可以應(yīng)用于植物精油驅(qū)蚊片上。桉葉油和香茅油的代表成分為桉葉素與香茅醛，本文即是通過(guò)生物試驗(yàn)測(cè)試桉葉素與香茅醛具體有效驅(qū)蚊活性配比，并建立檢測(cè)方法進(jìn)行分離和定量分析，旨在為安全有效的防蚊藥劑開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng) 白紋伊蚊[Aedesalbopictus]，四川省疾病預(yù)防控制中心提供，實(shí)驗(yàn)室繁殖10代以上，選取羽化后3～5d未吸血的大小較一致的健康雌蚊進(jìn)行試驗(yàn)。溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度65%±10%，保持室內(nèi)空氣流通。

1.2 供試樣品 桉葉素·香茅醛植物精油驅(qū)蚊片。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桉葉素·香茅醛植物精油驅(qū)蚊片對(duì)白紋伊蚊空間驅(qū)避效果試驗(yàn) 采用桉葉油和香茅油配制5個(gè)含量的植物精油驅(qū)蚊片進(jìn)行生物測(cè)試，具體含量為：①7mg桉葉素·9mg香茅醛；②7.5mg桉葉素·9.5mg香茅醛；③8mg桉葉素·10mg香茅醛；④8.5mg桉葉素·10.5mg香茅醛；⑤9mg桉葉素·11mg香茅醛。按照成都彩虹電器(集團(tuán))股份有限公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《空間驅(qū)避產(chǎn)品藥效試驗(yàn)及評(píng)價(jià)(Y型管法)》[13]的實(shí)驗(yàn)方法篩選最佳含量。每種樣品做3次重復(fù)試驗(yàn)，以觀(guān)察試驗(yàn)的重現(xiàn)性。驅(qū)避率=(對(duì)照端臂管中的試蟲(chóng)數(shù)-實(shí)驗(yàn)端臂管中的試蟲(chóng)數(shù))/Y型管的投蟲(chóng)總數(shù)×100%。驅(qū)避結(jié)果按照(表1)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。

表1 驅(qū)避物質(zhì)驅(qū)避效果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 桉葉素·香茅醛氣相色譜分析試驗(yàn)

1.3.2.1 試劑和溶液 桉葉油；香茅油；丙酮：分析純；桉葉素標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%；香茅醛標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96%；氯苯(內(nèi)標(biāo))：分析純。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：稱(chēng)取氯苯約0.1g至50mL容量瓶中，用丙酮稀釋后定容，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2.2 儀器 氣相色譜儀(Aglient 7890B)；色譜柱：30m×0.25mm×0.25μm DB-1毛細(xì)管色譜柱。

1.3.2.3 氣相色譜分析條件 柱溫60℃保持3min，然后以20℃/min升溫至250℃，進(jìn)樣器300℃，檢測(cè)器320℃；氣體流量：載氣(氮?dú)?：1.0mL/min；氫氣：30mL/min；空氣：300mL/min；進(jìn)樣量：1.0ul。內(nèi)標(biāo)氯苯保留時(shí)間約為4.6min，桉葉素保留時(shí)間約為7.9min，香茅醛保留時(shí)間約為9.6min。典型的桉葉素/香茅醛標(biāo)樣及其植物精油驅(qū)蚊片樣品的氣相色譜圖(圖1～2)。

1-氯苯(4.635min) 2-桉葉素(7.936min) 3-香茅醛(9.613min)圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1-氯苯(4.634min) 2-桉葉素(7.935min) 3-香茅醛(9.609min)圖2 樣品色譜圖

1.3.2.4 測(cè)定步驟 標(biāo)樣溶液的配制:稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品桉葉素約0.04g(精確至0.000 2g)和標(biāo)準(zhǔn)品香茅醛0.05g(精確至0.000 2g)于25mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別移取5mL上述配制好的內(nèi)標(biāo)溶液、標(biāo)準(zhǔn)品母液于25mL容量瓶中，以丙酮溶解并定容，作為標(biāo)樣溶液。

配制系列濃度(濃度范圍覆蓋樣品中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%～120%)的標(biāo)樣溶液，作為有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和線(xiàn)性范圍測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液。

試樣溶液的配制: 取一片驅(qū)蚊片樣品置于100mL錐形瓶中，再準(zhǔn)確移取上述內(nèi)標(biāo)溶液5mL，加入丙酮(分析純)約20mL，蓋住橡膠塞浸泡1h后，搖勻，作為樣品溶液，取上層清液進(jìn)行色譜分析。對(duì)上述樣品作為方法精密度和有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定溶液進(jìn)行5次平行測(cè)定。

稱(chēng)取5份空白樣品約0.5g，加入內(nèi)標(biāo)及已知含量的桉葉素/香茅醛標(biāo)樣，用丙酮溶解，作為測(cè)定桉葉素/香茅醛回收率的溶液。

1.3.2.5 測(cè)定 在上述操作條件下，待基線(xiàn)穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，計(jì)算各針相對(duì)響應(yīng)值的重復(fù)性，待相鄰2針的相對(duì)響應(yīng)值變化<1.5%后，按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.6 計(jì)算 桉葉素/香茅醛的質(zhì)量X(mg)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A1—標(biāo)準(zhǔn)溶液中桉葉素(香茅醛)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比；

A2—試樣中桉葉素(香茅醛)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比；

m1—標(biāo)準(zhǔn)溶液中桉葉素(香茅醛)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，mg；

P—標(biāo)準(zhǔn)品中桉葉素(香茅醛)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

f—稀釋因子，f=8。

2 結(jié)果

2.1 5個(gè)含量植物精油驅(qū)蚊片對(duì)白紋伊蚊空間驅(qū)避效果 5個(gè)含量植物精油驅(qū)蚊片對(duì)白紋伊蚊空間驅(qū)避率(表2)。

表2 5個(gè)含量植物精油驅(qū)蚊片對(duì)白紋伊蚊空間驅(qū)避率

續(xù)表

2.2 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法的可靠性驗(yàn)證 采用上述氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)標(biāo)樣和樣品中桉葉素/香茅醛的氣相色譜圖(圖1～2)。

2.2.1 分析方法的線(xiàn)性相關(guān)性試驗(yàn) 稱(chēng)取不同量桉葉素/香茅醛標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入氯苯內(nèi)標(biāo)溶液5mL配制成桉葉素/香茅醛與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量比為五個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述操作條件分別測(cè)定，以桉葉素/香茅醛與內(nèi)標(biāo)物氯苯質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，以桉葉素/香茅醛與內(nèi)標(biāo)物氯苯峰面積比為縱坐標(biāo)，得工作曲線(xiàn)。桉葉素線(xiàn)性關(guān)系測(cè)定結(jié)果(表3)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)(圖3)；香茅醛線(xiàn)性關(guān)系測(cè)定結(jié)果(表4)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)(圖4)。

表3 桉葉素線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖3 桉葉素分析方法的線(xiàn)性相關(guān)性圖

表4 香茅醛線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖4 香茅醛分析方法的線(xiàn)性相關(guān)性圖

2.2.2 分析方法的精密度試驗(yàn) 對(duì)同一試驗(yàn)樣品中的桉葉素/香茅醛含量進(jìn)行5次平行測(cè)定，測(cè)得桉葉素平均含量為8.079 6mg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.062，變異系數(shù)為0.77%；香茅醛平均含量為10.147 2mg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.074，變異系數(shù)為0.73%。經(jīng)由Horwitz公式檢驗(yàn)，方法的精密度結(jié)果符合要求，數(shù)據(jù)(表5)。

表5 分析方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 在空白樣品中加入已知含量桉葉素/香茅醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述方法測(cè)定桉葉素/香茅醛的回收率。桉葉素的添加回收率在98.95%～100.36%之間，平均回收率99.74%；香茅醛的添加回收率在98.61%～100.37%之間，平均回收率99.61%，結(jié)果(表6)。

表6 分析方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)首先采用Y型管法測(cè)試此5個(gè)含量的植物精油驅(qū)蚊片對(duì)白紋伊蚊的空間驅(qū)避率及驅(qū)避等級(jí)，實(shí)驗(yàn)表明配方8mg桉葉素10mg香茅醛對(duì)白紋伊蚊的驅(qū)避效果三次重復(fù)試驗(yàn)中驅(qū)避等級(jí)均達(dá)到IV級(jí)水平，優(yōu)于其他4個(gè)含量，并達(dá)到顯著水平。其次，為了能對(duì)有效成分含量進(jìn)行定量定性分析，建立了氣相色譜法檢測(cè)植物精油驅(qū)蚊片中桉葉素和香茅醛成分的分析方法。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該分析方法具有良好的線(xiàn)性、精密度和準(zhǔn)確度，符合農(nóng)藥產(chǎn)品的質(zhì)量分析要求。本文的研究?jī)?nèi)容基本能確定桉葉油和香茅油能應(yīng)用于驅(qū)蚊領(lǐng)域，并且可以對(duì)其有效成分進(jìn)行定量分析，為該產(chǎn)品能投入應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。