許剛 何純青 張飛 克里木 尹東峰 吾木爾 劉劍 賈勇

[摘要]目的：采用低溫3D打印技術(shù)制備復(fù)合萬古霉素的PLGA/TCP多孔骨缺損修復(fù)支架材料，并對其生物相容性和抑菌效果進(jìn)行檢測，旨在使支架材料促進(jìn)骨缺損修復(fù)的同時(shí)，兼具局部抗感染的能力。方法：按15%PLGA+1.5%TCP+1.5%萬古霉素的比例，應(yīng)用低溫快速3D打印技術(shù)制備了40%、60%和80%三種不同孔隙率的骨缺損修復(fù)支架材料，并對該材料進(jìn)行表面形態(tài)觀察和測量、細(xì)胞毒性檢測、萬古霉素緩釋能力實(shí)驗(yàn)和抑菌效果檢測。結(jié)果：掃描電子顯微鏡觀察支架材料見其互連通性好，大孔直徑在550μm左右，孔連通率在90%以上。三種不同孔隙率的支架材料均無細(xì)胞毒性，孔隙率為80%的支架材料在萬古霉素緩釋能力和抑菌效應(yīng)方面要顯著優(yōu)于孔隙率為40%和60%的支架材料。結(jié)論：應(yīng)用低溫3D打印技術(shù)可以直接在生物墨水中加入注射用萬古霉素粉劑，制備出具有良好三維結(jié)構(gòu)的復(fù)萬古霉素/PLGA/TCP的多孔支架材料，該支架孔通率高，互連通性好，而且當(dāng)孔隙率為80%的支架材料在萬古霉素緩釋能力及抑菌效應(yīng)方面有著更優(yōu)的表現(xiàn)，可視為一種具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的支架材料，尤其適用于感染性骨缺損的修復(fù)。

[關(guān)鍵詞]低溫3D打印;骨缺損修復(fù)支架;聚乳酸-羥基乙酸;磷酸三鈣;萬古霉素

[中圖分類號]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）05-0059-04

Preparation and Properties Study on the Low Temperature 3D Printing Composite Vancomycin/PLGA/TCP Scaffold

XU Gang1，HE Chun-qing1，ZHANG Fei1，KE Li-mu1，YIN Dong-feng2，WU Mu-er1，LIU Jian1，JIA Yong1

[1.Department of Traumatic Orthopedics，Orthopedic Center of PLA（Joint group）;2.Department of Pharmacy，General Hospital of Xinjiang Military Region，Urumuqi 830000，Xinjiang，China]

Abstract： Objective? To design via low temperature 3D printing composite scaffold （PLGA/TCP） made of poly （lactic-co-glycolic acid） （PLGA） and tricalcium phosphate （TCP） as a basic carrier， incorporating vancomycin powder. The structural and performance of such composite scaffold is tested， so as to make the scaffolds promote bone defect repair and have anti-infection ability. Methods? According to the ratio of 15%PLGA+1.5%TCP+1.5% vancomycin， such scaffolds were fabricated using a low-temperature rapid-prototyping 3D printing process，and the porosity for 40%， 60% and 80% were designed. The surface morphology of the scaffolds were observed and measured， biocompatibility was evaluated by the cytotoxicity test of the bone marrow mesenchymal cells. The vancomycin release and antibacterial test were also observed in our study. Results? The large pores diameter of the vancomycin incorporated PLGA/TCP scaffold is about 550μm and the pore connectivity is 90%. All scaffolds have good biocompatibility and no cytotoxicity. The results of vancomycin release and antibacterial test for scaffold with 80% porosity were significantly superior to those with porosity of 40% and 60%. Conclusion? A new type of composite vancomycin incorporated PLGA/TCP porous scaffold was fabricated using low temperature rapid prototyping technology， and the scaffold with 80% porosity has better performance in Vancomycin release and antibacterial test， which means that scaffold can be a scaffold material with potential clinical application value， especially suitable for the repair of infectious bone defect.

Key words： low temperature 3D print; bone defect repair scaffold; poly（lactic-co-glycolic acid）（PLGA）; tricalcium phosphate （TCP）; vancomycin

臨床中由于骨與關(guān)節(jié)感染、結(jié)核或腫瘤侵蝕、嚴(yán)重創(chuàng)傷等導(dǎo)致的骨缺損比較常見，而大段骨缺損的修復(fù)成為骨科領(lǐng)域最為棘手的難題之一[1-3]。雖然骨移植術(shù)是修復(fù)骨缺損的傳統(tǒng)方法，但自體骨在取骨時(shí)會造成供區(qū)新的骨缺損，增加了供區(qū)創(chuàng)傷及相關(guān)并發(fā)癥;而異體骨雖來源廣泛，但組織相容性低，存在排異反應(yīng)，且對供區(qū)血運(yùn)環(huán)境依賴大，均無法在臨床中廣泛推廣，而人工合成骨材料因來源廣泛，種類繁多，制備簡單，不損傷供區(qū)和無免疫排斥性等優(yōu)勢成為骨科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4-5]。諸多研究表明，聚乳酸-羥基乙酸[Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]與磷酸三鈣（Tricalcium phosphate，TCP）復(fù)合的多孔支架材料，具有生物相容性好、孔隙率高以及可體內(nèi)降解吸收的特點(diǎn)，是人工骨移植的理想備選材料之一[6-9]。但是由于目前的復(fù)合材料不具備抗感染效應(yīng)，在治療感染性骨缺損中存在障礙，因此，制備一種復(fù)合抗生素的可降解人工骨移植材料具有十分重要的臨床意義[6-7]。

傳統(tǒng)的增材制造技術(shù)因工作溫度高[8]，不能直接在打印墨水溶液中添加抗生素，多數(shù)研究都選擇通過二次吸附添加的方式加入抗生素緩釋成分，此類方法制備的材料緩釋效率不穩(wěn)定，難以滿足臨床要求，而低溫3D打印技術(shù)的誕生很好地解決了這一難題。該理念結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（Computer aided design，CAD）和計(jì)算機(jī)輔助制造（Computer aided manufacturing，CAM）技術(shù)，利用數(shù)控技術(shù)在低溫（零下30℃～40℃）條件下按照CAD模型將復(fù)合高分子材料層層堆積制備臨床所需要的個(gè)性化三維實(shí)體。低溫技術(shù)的應(yīng)用使得直接在打印墨水中添加抗生素成為可能。萬古霉素是一種糖肽類抗革蘭陽性菌抗生素，在治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的慢性骨髓炎中具有良好的臨床療效[10-11]。本研究結(jié)合上述研究進(jìn)展，設(shè)計(jì)制備了一種復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP的可降解多孔骨修復(fù)材料，并分析其生物相容性及藥物緩釋性能，為后續(xù)的動物實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的理論依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備和材料：主要儀器設(shè)備：低溫沉積生物3D打印機(jī)（北京上普博源生物科技有限公司，SUNP BP11），真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興，LGJ-12），掃描電鏡（日本Hitachi公司，SU8020），高分辨率小動物用微CT（美國GE公司），Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀（Thermo），HP1100高效液相色譜儀（美國惠普）。

主要試劑：聚乳酸-羥基乙酸，PLGA75/25（山東省藥學(xué)科學(xué)院中試廠，特性粘度：1.0±0.1dL/g），β-磷酸三鈣（Sigma），1，4-二氧六環(huán)（Sigma），Percoll分離液（Pharmacia），OriCell人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司），0.25%胰蛋白酶/EDTA（HyClone），CCK-8試劑盒（Dojindo）。

1.2 新型復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP支架的制備：低溫快速成型3D打印PLGA/TCP支架已經(jīng)有可重復(fù)驗(yàn)證的制作方法[12-13]。在此基礎(chǔ)上將萬古霉素粉劑（注射用鹽酸萬古霉素，希臘VIANEX S.A公司）按照一定比例加入打印墨水中，具體步驟及參數(shù)如下：①材料配制比例：PLGA、TCP和萬古霉素粉末按10：1：1的質(zhì)量比混合后，將粉體溶解在有機(jī)溶劑1，4-二氧六環(huán)中形成均質(zhì)化溶液（粉體重量與溶液體積比值系18：100），裝入3D打印機(jī)注射倉中備用;②用Mimics軟件MEDCAD模塊創(chuàng)建CAD模型，設(shè)置支架規(guī)格：長20mm、寬20mm、高15mm;③3D打印機(jī)打印多孔支架材料，打印機(jī)噴頭溫度35℃，口部直徑0.6mm，打印速度9mm/s，平臺溫度-25℃，填充圖案為鋸齒狀，走線距離1.8mm，打印規(guī)格：長20mm、寬20mm、高15mm，孔隙率分別設(shè)置為40%、60%及80%;④固化方式：將低溫3D打印材料于-40℃下靜置24min后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)，設(shè)置真空度為10Pa，冷凍干燥48h，以1℃/h升溫至20℃，此過程使有機(jī)溶劑（1，4-二氧六環(huán)）被完全移除，獲得三種不同孔隙率的萬古霉素/PLGA/TCP多孔支架材料。

1.3 支架形態(tài)觀察：①肉眼及光學(xué)顯微鏡觀察大體形態(tài);②Micro-CT掃描支架并用Microview軟件進(jìn)行圖像處理，三維重建并測量;③掃描電子顯微鏡觀察新型萬古霉素/PLGA/TCP支架：將打印好的支架切成5mm×5mm×5mm大小，2.5%戊二醛-PBS固定，并梯度脫水后噴金。將固定有支架樣品的金屬底座移至掃描電鏡內(nèi)，調(diào)整坐標(biāo)參數(shù)及焦距，真空條件下觀察支架表面微觀結(jié)構(gòu)并記錄照片。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取與傳代培養(yǎng)：從Sprague-Dawley大鼠的骨髓中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)3d后首次換液，以后每2～3d更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞長滿單層，使用0.25%胰酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。

1.5 支架的體外細(xì)胞相容性測試：將3種不同孔隙率的支架材料的浸提液和正常培養(yǎng)基分別制作細(xì)胞懸液，濃度為1×108/L。將4種懸液加入96孔板中，每孔100μl，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、5、7d，每2d更換一次培養(yǎng)液。各時(shí)間點(diǎn)每孔加入10μl CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測450nm波長下各孔的吸光度值，記錄并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 支架的藥物緩釋能力：將3種不同孔隙率的支架材料分別放入6個(gè)試管中，每管加入10ml的PBS（pH值7.4），每24h換液1次，收集第1、5、10、15、20、25、30天的24h洗提液，用高效液相色譜儀檢測洗提液中萬古霉素的濃度。

1.7 支架的抑菌實(shí)驗(yàn)測試：將3種不同孔隙率的支架材料分別放入6個(gè)均勻涂有1.5×108金黃色葡萄球菌的MH瓊脂培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h后測量并記錄抑菌圈大小。以后每3d更換一次培養(yǎng)皿，測量并記錄第10、15、20、25、30天的抑菌圈大小。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及制圖運(yùn)用Graph Pad Prism version 5（GraphPad software， San Diego，CA）軟件，不同組間比較采用方差分析（ANOVA），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 支架形態(tài)觀察：復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP支架材料在肉眼和光鏡下可見均勻分布的大孔。CT掃描見支架內(nèi)部每個(gè)層面孔隙分布均勻，每層之間相互連通，沒有內(nèi)部孔隙堵塞。支架大孔直徑在550μm左右，孔連通率在90%以上，3種支架材料的孔隙率（40%、60%、80%）基本達(dá)標(biāo)。掃描電子顯微鏡觀察復(fù)合支架材料可見孔壁上分布大量的微孔，2.5～90μm不等，互連通性良好?？妆谟休^大的比表面積和粗糙度，與正常松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)較為接近。

2.2 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：三種不同孔隙率的復(fù)合支架材料的浸提液與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，在第1天、第3天、第5天、第7天對細(xì)胞增殖的作用與正常培養(yǎng)基組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），即復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP的多孔骨修復(fù)材料對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。

2.3 萬古霉素的緩釋結(jié)果：三種不同孔隙率的復(fù)合支架材料在前10d的萬古霉素緩釋能力相當(dāng)，均維持在50g/L標(biāo)準(zhǔn)以上。但在第15天后，40%孔隙率組和60%孔隙率組的萬古霉素緩釋效率顯著低于80%孔隙率組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且無法維持在50g/L之上。證明孔隙率為80%的復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP的多孔骨修復(fù)材料具有較好的緩釋效應(yīng)。

2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三種不同孔隙率的復(fù)合支架材料在前15d的抑菌能力相當(dāng)，無明顯差異。但在第20天時(shí)，40%孔隙率組和60%孔隙率組的抑菌圈開始縮小，與80%孔隙率組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。證明孔隙率為80%的復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP的多孔骨修復(fù)材料具有更長的抑菌效果。

3? 討論

慢性骨髓炎造成的節(jié)段性骨缺損的治療一直是骨科領(lǐng)域的一大難題[3-4]。雖然自體骨移植是治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其來源的局限性及對供區(qū)的損傷，目前使用人工骨移植材料進(jìn)行治療是臨床上最常見的選擇之一。臨床上的實(shí)際需求不斷推動著人工骨材料的演變發(fā)展，現(xiàn)在要求內(nèi)植物不僅能填補(bǔ)骨缺損空間，提供有效的力學(xué)支撐，還要具有抗感染和促進(jìn)成骨的作用。本研究制備的新型復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP支架材料制備價(jià)格低廉，初期能提供力學(xué)支撐，具有穩(wěn)定的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)新骨形成，允許新生血管早期長入，并且材料可逐漸生物降解[12-15]。PLGA和β-TCP都是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)使用的生物材料，PLGA適用于低溫快速沉積工藝，β-TCP粉末不僅能改善材料的理化性質(zhì)，而且在體內(nèi)應(yīng)用有很好的骨誘導(dǎo)性，兩種材料組合打印出的支架材料的力學(xué)強(qiáng)度較單純PLGA支架高[15-16]。

但萬古霉素在骨組織中的滲透能力較差，對于慢性骨髓炎的患者很難通過靜脈用藥控制感染，而復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP支架材料的制備將有效解決這一問題。通過調(diào)整PLGA、β-TCP、萬古霉素三種成分在多孔支架內(nèi)的配比，設(shè)置3D低溫快速成型技術(shù)中的關(guān)鍵參數(shù)，可實(shí)現(xiàn)β-TCP、萬古霉素在多孔支架中的均質(zhì)化分布，制備出具有合適孔徑和孔連通率、高孔隙率、不同微觀結(jié)構(gòu)的復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP支架材料，實(shí)現(xiàn)控制局部感染及重建骨缺損的作用[17-19]。

從光鏡、顯微CT和掃描電鏡的觀察結(jié)果可知，多孔支架最大可達(dá)到80%的孔隙率和90%的孔連接率。從仿生學(xué)的角度來看，多孔支架的結(jié)構(gòu)與天然松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)類似，三維蜂窩狀結(jié)構(gòu)的表面孔和內(nèi)部孔互有連通，有利于骨細(xì)胞直接粘著、分泌及構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，逐漸完成骨基質(zhì)的礦鹽沉積，有利于向血管分化的干細(xì)胞的直接粘附、增殖和分化[20-21]?？讖皆?00～300μm的支架材料有利于體內(nèi)活性骨細(xì)胞及新生微血管的長入;孔隙率大于75%能保證多孔支架與周圍組織最大限度地接觸并逐漸結(jié)合，使支架具有較好的骨傳導(dǎo)性;孔連通率大于85%能保證多孔支架表面粘附不同來源的干細(xì)胞，促進(jìn)干細(xì)胞遷移進(jìn)入支架內(nèi)部，有利于不同分化階段的成體細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝。體外生物相容性測試證實(shí)，復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP的支架材料對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性。萬古霉素緩釋能力測試發(fā)現(xiàn)，三種不同孔隙率的支架材料均有著良好的藥物緩釋能力，而80%孔隙率的材料緩釋能力更優(yōu)，20d內(nèi)可維持在50mg/L以上。而且體外抑菌實(shí)驗(yàn)更加證實(shí)孔隙率為80%的支架材料相比其余兩組有更好的長期抑菌效果。將萬古霉素加入骨修復(fù)材料中，并使其在支架材料中有序釋放，不僅可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，還可以使藥物在感染部位達(dá)到有效濃度，降低藥物全身應(yīng)用的毒副作用。

這種新型復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP的多孔支架材料將三類性質(zhì)不同的生物材料（萬古霉素、PLGA、β-TCP）有機(jī)地整合成一種支架材料，通過控制多孔支架的各項(xiàng)理化屬性，可以靈活地制備不同微觀結(jié)構(gòu)的多孔支架，臨床上也可以視具體情況選擇合適的支架形狀，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效地制備具有原生抗感染作用的人工骨缺損修復(fù)材料的目地。

應(yīng)用低溫3D打印技術(shù)可以直接在墨水溶液中加入注射用萬古霉素粉劑，成功制備出新型復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP多孔支架。該支架材料孔隙率高，具有良好的生物相容性、藥物緩釋能力和抗菌作用，同時(shí)有利于組織液滲透和細(xì)胞附著，對于治療感染性節(jié)段性骨缺損具有重要的臨床意義。

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[收稿日期]2021-03-03

本文引用格式：許剛，何純青，張飛，等.低溫3D打印復(fù)合萬古霉素/PLGA/TCP骨修復(fù)材料的制備與性能評估[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（5）：59-62.