陳詣佳，胡笑宇，劉 希，楊文生，康政宇，何升東，張 林

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是胃腸道最常見(jiàn)的間質(zhì)腫瘤，其表達(dá)的Ano1與GIST的生長(zhǎng)增殖密切相關(guān)，可通過(guò)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5的表達(dá)，從而促進(jìn)GIST生長(zhǎng)增殖，同時(shí)也是GIST表達(dá)的一個(gè)敏感特異性標(biāo)記物[1-2]。以往觀念認(rèn)為，GIST屬于軟組織肉瘤，對(duì)放射治療不敏感[3]，但其實(shí)在某些情況下放療已被納入GIST的多學(xué)科治療策略。放療作為手術(shù)的輔助手段，可能會(huì)抑制GIST對(duì)伊馬替尼耐藥性的發(fā)生，而且術(shù)前放療有助于減少切除范圍保留更多正常組織和更安全的劑量遞增[4-5]。此外，在局部進(jìn)行性或轉(zhuǎn)移性GIST中，與放療造成的毒性損傷相比，進(jìn)行短期放射治療對(duì)減輕具的局部癥狀更為有效[6-7]。最近十幾年來(lái)，國(guó)外已有不少放療在胃腸道間質(zhì)瘤治療中取得了明顯效果的報(bào)道，但是目前尚未見(jiàn)對(duì)GIST放療機(jī)制的基礎(chǔ)研究報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)研究GSIT對(duì)電離輻射的敏感性，從而臨床上GIST的放療提供科學(xué)依據(jù)，為GIST放療機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST-T1，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供。細(xì)胞培養(yǎng)基為CM5-1，成分為89%McCoy’s 5A培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗。細(xì)胞于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞樣，梭形，成塊生長(zhǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 醫(yī)用電子直線加速器（美國(guó)VARIAN公司），McCoy’s 5A培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)Sciencell公司），兔源Anti-TMEM16A多克隆一抗、山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（英國(guó)Abcam公司），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），蛋白預(yù)染marker、GAPDH抗體（Thermo Fisher公司），Total RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱、高速低溫冷凍離心機(jī)、超聲波細(xì)胞破碎儀（美國(guó)ThermoFisher公司），超凈工作臺(tái)（蘇州華新空調(diào)凈化有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GIST細(xì)胞分組與電離輻射 參考RYOO S B等[8]和鐘軍等[9]的文獻(xiàn)，電離輻射采用醫(yī)用直線加速器，輻射線源為1.25 MeV的γ射線，照射總劑量分別為2 Gy、5 Gy、7 Gy。照射劑量率為1.0 Gy/min。實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分別為照射后1天，2天，3天，4天，5天。

1.2.2 細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GIST-T1細(xì)胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，250 g離心5 min，吸除上清液，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度3×104個(gè)/mL，100μL/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置0 Gy、2 Gy、5 Gy、7 Gy組，每組6重復(fù)，按實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行電離輻射，同一塊板為相同輻射劑量。電離輻射后放入孵箱，培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，吸棄上清，無(wú)血清培養(yǎng)基1:10稀釋CCK8試劑，避光加入已稀釋CCK8工作液110μL/孔，并輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次，37℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。將孔板中的待檢測(cè)液體每孔吸取90μL移入干凈的96孔板中，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GIST-T1細(xì)胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化收集，250 g離心5 min，吸除上清液，制備單細(xì)胞懸液。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度5×104個(gè)/孔，500μL/孔接種于24孔板中。待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置未照射、2 Gy、5 Gy、7 Gy組，每組3重復(fù)，同板為相同輻射劑量。電離輻射后細(xì)胞分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，收集上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用不含EDTA胰酶消化，收集細(xì)胞與備用上清混勻，將細(xì)胞液移入1.5 mL管中。350 g離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌1次，棄上清。用500μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL AnnexinV APC混勻后，加入5μL的PI混勻。室溫避光，反應(yīng)10 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印記 按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，NanoDrop2000核酸蛋白儀測(cè)定蛋白濃度。使用10%SDS-PAGE凝膠電泳，260 A，120 min轉(zhuǎn)入PVDF膜中，脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜10 min×3遍，分別加入TMEM16A抗體、GAPDH抗體（1:1000），4℃搖床過(guò)夜。TBST洗膜10 min×3遍，二抗（1:50000）室溫孵育90 min，TBST洗膜10 min×3遍。ECL發(fā)光液覆蓋，顯影曝光處理。

1.2.5 RT-PCR 按照RNAiso Plus試劑盒的說(shuō)明，用RNAiso Plus從新鮮培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。通過(guò)NanoDrop2000測(cè)定RNA濃度和純度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Master Mix轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。根據(jù)Prime Script RT Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃，30 s和60℃，45秒，共40個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參。引物由擎科生物有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：Ano1上游引物：5’-CATCACACCAAGCCGACCTC-3’；Ano1下游引物：5’-CCCTGGAAGCCCTAAGACT-3’；GAPDH上游引物：5’‐CAATGACCCCTTCATTGACC-3’；GAPDH下游引物：5’‐GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，SPSS20.0軟件分析，結(jié)果以（±s）表示。組間計(jì)量資料對(duì)比作方差齊性和正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足方差齊性，以one-wayANOVA法進(jìn)行方差分析，不滿足方差齊性，則以非參數(shù)法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞在CM5-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如圖1，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞樣，梭形，成塊生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

GIST細(xì)胞接受電離輻射后第1天，如圖2，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，照射組與未照射組相比差別不大，照射后第1天電離輻射對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)不明顯。

圖2 電離輻射后1天細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

GIST細(xì)胞接受電離輻射后第2天，如圖3，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，2 Gy照射組與未照射組相比差異不大，而5 Gy、7 Gy照射組與未照射組相比可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量略少。

圖3 電離輻射后2天細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

GIST細(xì)胞接受電離輻射后第3天，如圖4，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，2 Gy照射組不如未照射組密集，5 Gy照射組少于未照射組，7 Gy照射組更少，可見(jiàn)微量細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基上，可能是凋亡細(xì)胞。

圖4 電離輻射后3天細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

GIST細(xì)胞電離輻射后第4天，如圖5，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，2 Gy照射組不如未照射組密集，5 Gy照射組明顯少于未照射組，可見(jiàn)微量漂浮細(xì)胞，7 Gy照射組細(xì)胞數(shù)量更少，可見(jiàn)少量漂浮細(xì)胞，可能是凋亡細(xì)胞。

圖5 電離輻射后4天細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

GIST細(xì)胞接受電離輻射后第5天，如圖6，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，未照射組極度密集，多于2 Gy照射組，2 Gy照射組可見(jiàn)微量漂浮細(xì)胞，5 Gy照射組細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)不如未照射組，可見(jiàn)少量漂浮細(xì)胞，7 Gy照射組細(xì)胞數(shù)量更少，可見(jiàn)多量漂浮細(xì)胞，可能是凋亡細(xì)胞。

圖1胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

圖6 電離輻射后5天細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)

2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果 GIST細(xì)胞在接受電離輻射后，其增殖受到抑制。相同照射劑量下，隨著照射后時(shí)間延長(zhǎng)，抑制增殖的作用越來(lái)越明顯；相同時(shí)間點(diǎn)下，提高照射劑量能增加電離輻射對(duì)GIST細(xì)胞增殖的抑制作用。通過(guò)公式抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%，計(jì)算不同電離輻射劑量處理后細(xì)胞的抑制率。見(jiàn)表1。

表1 不同電離輻射劑量處理細(xì)胞后的抑制率（%）

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明，胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞在接受電離輻射后，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。在相同照射劑量下，隨著照射后時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸升高；在相同時(shí)間點(diǎn)下，照射劑量越大，細(xì)胞凋亡率越高。見(jiàn)表2。

表2 電離輻射對(duì)細(xì)胞的凋亡影響（±s）

表2 電離輻射對(duì)細(xì)胞的凋亡影響（±s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)0 Gy組相比，*為P＜0.05，**為P＜0.01

組 別0 Gy組2 Gy組5 Gy組7 Gy組5 d 8.27±0.86 18.57±1.04**25.79±2.56*31.92±0.74**1 d 4.34±0.85 6.53±1.25 5.59±0.80 6.20±2.23 2 d 5.75±1.91 6.72±2.20 11.08±1.43**12.76±1.76**3 d 8.99±1.76 19.63±1.56**18.09±2.26**21.24±1.14**4 d 7.52±0.80 12.40±0.74**22.63±2.06**24.87±1.60**

2.4 RT-PCR結(jié)果 電離輻射后，胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的Ano1表達(dá)隨時(shí)間呈現(xiàn)先下降然后逐漸回升的趨勢(shì)。隨著照射總劑量增加，對(duì)Ano1的表達(dá)抑制越來(lái)越明顯。照射劑量越大，Ano1的表達(dá)抑制作用越早達(dá)到最大值，同時(shí)Ano1的表達(dá)恢復(fù)越來(lái)越慢。見(jiàn)表3、圖7。

表3 電離輻射對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤Ano1、mRNA的表達(dá)影響

圖7 電離輻射后Ano1的mRNA表達(dá)（a、b、c）

2.5 蛋白免疫印記結(jié)果 如圖8，Ano1蛋白是一條114 KD的條帶，符合Ano1蛋白分子量的大小。胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞接受照射后Ano1的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)基本能符合照射后Ano1的mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)。隨著照射劑量增大，Ano1表達(dá)下降幅度越來(lái)越大，下降的速度越來(lái)越快，恢復(fù)越來(lái)越慢。見(jiàn)表4、圖8。

表4 電離輻射對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤Ano1蛋白的表達(dá)影響

圖8 Ano1蛋白表達(dá)量

3 討論

放射治療是治療腫瘤的重要手段之一。影響療效的因素是多方面的，如腫瘤的位置，腫瘤的大小、乏氧細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤細(xì)胞的放射敏感性、治療計(jì)劃的合理性等。其中腫瘤細(xì)胞的放射敏感性是最重要的內(nèi)在因素[10]。影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療敏感性的因素有很多，其中腫瘤細(xì)胞的增殖活性與腫瘤細(xì)胞的放療敏感性密切相關(guān)[11]。因此，我們采用CCK8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同劑量照射后，各個(gè)時(shí)間段GIST細(xì)胞的增殖活性。本研究表明，電離輻射對(duì)GIST細(xì)胞的活性影響具有劑量和時(shí)間效應(yīng)。GIST細(xì)胞在接受電離輻射后，其增殖受到抑制。在同一時(shí)間點(diǎn)，照射劑量越大，抑制細(xì)胞增殖的作用越大。在同一劑量照射，隨著照射后時(shí)間延長(zhǎng)，電離輻射對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用越來(lái)越明顯。因此，電離輻射對(duì)GIST細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，需要一定的劑量并且通過(guò)一定的時(shí)間積累才能達(dá)到抑制腫瘤增殖的效果。所以我們下一步實(shí)驗(yàn)可通過(guò)增加不同劑量照射組，適當(dāng)延長(zhǎng)照射后的時(shí)間，計(jì)算抑制作用達(dá)到峰值時(shí)的天數(shù)，進(jìn)而尋找適合的照射劑量和照射周期，為未來(lái)臨床上GIST放療方案的制定提供參考。

細(xì)胞凋亡率是衡量腫瘤細(xì)胞放射敏感性的另一項(xiàng)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明，電離輻射可以誘導(dǎo)GIST細(xì)胞發(fā)生凋亡。相同照射劑量，隨著照射后時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸升高；相同時(shí)間點(diǎn)，照射劑量越大，細(xì)胞凋亡率越大。證明了放射誘導(dǎo)的GIST細(xì)胞凋亡具有時(shí)間和劑量的依賴性。

我們的研究表明，GIST細(xì)胞在接受電離輻射后，在mRNA水平上，Ano1的表達(dá)呈現(xiàn)出先降低，隨著時(shí)間緩慢恢復(fù)的趨勢(shì)，且隨著照射劑量增加，Ano1表達(dá)下降的程度越大、下降速度越快而且Ano1的表達(dá)恢復(fù)速度越慢。在蛋白質(zhì)水平上與mRNA趨勢(shì)一致。已有研究表明，Ano1與GIST細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，有著調(diào)節(jié)促進(jìn)GIST細(xì)胞生長(zhǎng)的功能[2]。除了GIST外，在胃癌中，Ano1的轉(zhuǎn)錄激活可以促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，Ano1在胃癌組織中過(guò)表達(dá)，并且與胃癌腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段相關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中，敲低Ano1顯著抑制了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而Ano1的缺失導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制[12]。而在MCF7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中，用T16Ainh-A01或siRNA抑制Ano1可以顯著抑制細(xì)胞增殖。siRNA敲低Ano1誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期停滯，并顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲性[13]。因此，Ano1在各種不同類型的腫瘤中，無(wú)論是在調(diào)控腫瘤增殖方面還是在控制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲等方面都起著不可或缺的作用，我們研究電離輻射對(duì)GIST細(xì)胞Ano1的表達(dá)變化，除了為GIST的放療機(jī)制奠定基礎(chǔ)，還能為其他類型腫瘤放療機(jī)制的研究提供新的思路。綜上所述，電離輻射對(duì)GIST細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用，這也提示GIST細(xì)胞對(duì)電離輻射有一定敏感性，這為未來(lái)制定GIST的放療方案提供了參考，為放療在GIST治療中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，更是為進(jìn)一步研究GIST放療機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究表明，GIST細(xì)胞接受照射后，Ano1的表達(dá)出現(xiàn)先降低、后回升的變化趨勢(shì)，為以后深入研究GIST的放療機(jī)制，進(jìn)一步繼續(xù)以Ano1為靶點(diǎn)研究GIST放療敏感機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。