艾克熱木·吐爾遜

心肌細(xì)胞凋亡屬于心肌細(xì)胞的程序性死亡，在心肌梗死后的心臟重塑中發(fā)揮著重要作用，同時在心力衰竭病理生理過程中也扮演著重要角色。抑制心肌細(xì)胞凋亡能有效減輕心肌缺血再灌注損傷，改善心臟重塑過程，延緩心力衰竭的發(fā)生，因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡逐漸成為治療各種心血管疾病的關(guān)鍵[1-2]。miRNA 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼RNA分子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[3]。研究指出，miRNAs參與動脈粥樣硬化斑塊形成、心肌梗死后血管再生、心肌重構(gòu)等多項心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，某些miRNAs還可幫助減少心血管事件中心肌細(xì)胞的凋亡，抑制組織損傷，促進(jìn)血管再生，控制室壁纖維化程度，從而改善病人預(yù)后[4-5]。miR-766 是近年來被鑒定出具有抑制心肌細(xì)胞凋亡作用的miRNA之一。本研究擬明確miR-766在心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其與相關(guān)靶基因的作用關(guān)系，為探討心肌細(xì)胞凋亡的分子信號通路研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細(xì)胞：H9C2心肌細(xì)胞購于ATCC(American type culture collection)。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(GIBCO公司)，TRIZOL、PBS緩沖液(Sigma公司)，SYBR Premix Ex Taq(TAKARA公司)。miR-766 NC、miR-766 mimics、miR-766 NC inhibitor、miR-766 inhibitor(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H9C2細(xì)胞置于含10%胎牛血清FBS和DMEM/F12培養(yǎng)基中，于5%二氧化碳、37 ℃條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于六孔板中，每孔約105個細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 提前1 d將所需離心管與槍頭高壓滅菌，根據(jù)GenMuteTm reagent (signagen)試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染(六孔板為例)，當(dāng)細(xì)胞生長密度為50%～60%時，取對數(shù)生長期細(xì)胞1.5×105個接種于六孔板，以次日貼壁細(xì)胞量達(dá)50%～60%為宜，次日分別以miR-766 NC、miR-766 mimics、miR-766 NC inhibitor、miR-766 inhibitor轉(zhuǎn)染不同孔中，以50 nmol濃度的轉(zhuǎn)染物轉(zhuǎn)染方案為：按每孔一根離心管的原則進(jìn)行配液，每管先加入100 μL緩沖液(試劑盒中的緩沖液需根據(jù)實際加樣量，先用ddH2O稀釋后方可使用)，然后每管對應(yīng)加入5 μL 10 μmol的miR-766 NC/miR-766 mimics/miR-766 NC inhibitor/miR-766 inhibitor，輕輕吹打混勻，再各加入4 μL轉(zhuǎn)染試劑，吹打混勻，室溫孵育15 min后取離心管中的混合液加入六孔板中對應(yīng)的孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-PCR實驗 H9C2細(xì)胞總RNA提取按照RNAprep Pure Micro Kit說明操作，細(xì)胞總RNA采用Trizol法，用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個樣本逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA需要量為2.0 μL，利用SYBR Green I法[試劑盒 SYBR Premix Ex Taq Kit (Takara)]在熒光定量PCR儀上行qPCR檢測。反應(yīng)條件：Stage 1 預(yù)變性，95 ℃， 30 s；Stage 2擴(kuò)增反應(yīng)(共40個循環(huán))，95 ℃變性， 5 s，55 ℃退火， 30 s，72 ℃延伸， 30 s，經(jīng)過qPCR反應(yīng)后，得到各標(biāo)本目的基因和管家基因GAPDH表達(dá)量的有關(guān)數(shù)據(jù)(Ct值)。Ct值的含義是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值時經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。所有試驗重復(fù)3次，采用相對定量分析，按照2[△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組)]計算Epac-1 mRNA表達(dá)水平。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實驗(流式細(xì)胞術(shù)) 分組干預(yù)72 h后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15 mL的錐形管中并置于冰上。用2 mL PBS 溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，去除PBS 溶液，加0.5 mL 0.25%不含EDTA胰酶孵育，直到顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始從培養(yǎng)板壁脫落，加完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕連續(xù)拍打使細(xì)胞從培養(yǎng)板壁上完全脫落，將細(xì)胞輕輕重懸于預(yù)冷緩沖液中制成1×106/mL細(xì)胞懸液，取0.5 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至干凈離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min后加入100 μL Buffer重懸，加入1.25 μL細(xì)胞凋亡檢測試劑 Annexin V-FITC。室溫避光反應(yīng)1 000 r/min離心15 min后，去除上清，將細(xì)胞用0.5 mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕懸，一管加5 μL Annexin V-FITC，一管加5 μL PI，最后一管加入5 μL Annexin V-FITC+5 μL PI，避光靜置20 min后加400 μL Buffer，將懸液經(jīng)40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，立即使用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)實驗 待H9C2細(xì)胞融合度達(dá)90%以上，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，輕輕吹打后棄去PBS，每孔加入200 μL預(yù)熱的胰蛋白酶(含EDTA)進(jìn)行常規(guī)消化，加入適量混勻的細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，置冰上裂解30 min，收集細(xì)胞置于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，-80 ℃保存。將待檢測蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取20 μL樣品，加入200 μL BCA工作液，混勻后常溫放置30 min，然后以A號孔為對照，測定樣品在562 nm處的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白含量。各組以30～60 μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳完成后，使用半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜移至含有5%脫脂牛奶封閉液大皿中，PVDF膜的蛋白面朝上，室溫下4°搖床上慢搖封閉1～2 h，隨后用1%脫脂牛奶稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。次日使用TBST洗脫一抗，同上方法稀釋二抗并將膜轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中，室溫下孵育1～2 h后，用PBST或TBST在室溫下?lián)u床上清洗3次，每次5 min，最后使用化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影。

1.2.6 靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因 使用TargetScan(http：//www.targetscan.org)和microRNA.org-Targets and Expression(http：//www.microrna.org) 數(shù)據(jù)庫預(yù)測 miR-766 與 Epac-1的結(jié)合區(qū)域。將Epac-1的miR-766預(yù)測靶點序列或突變序列3′-UTR構(gòu)建于pmirGLO載體。突變序列以正常Epac-1Epac-1的 3′-UTR序列為模板，在與 miR-766 相結(jié)合的預(yù)測位點進(jìn)行點突變。將 miR-766 NC、miR-766 mimic、miR-766 NC inhibitor、miR-766 inhibitor 分別與所構(gòu)建的載體同時利用 DharmFECT Duo 試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染待測細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用 Dual-Glo Luciferase分析系統(tǒng)分析實驗結(jié)果。具體按雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞H9C2中miR-766表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，與miR-766 NC組細(xì)胞相比，miR-766 mimics組細(xì)胞中miR-766高表達(dá)(P<0.001)；與miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，miR-766 inhibitor組細(xì)胞中miR-766則呈低表達(dá)(P<0.001)。詳見圖1。

與miR-766 NC組細(xì)胞相比，＊P<0.001；與miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，#P<0.001。

2.2 轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞H9C2中Epac-1表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，與miR-766 NC組細(xì)胞相比，miR-766 mimics組細(xì)胞中Epac-1表達(dá)降低(P<0.001)；與 miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，miR-766 inhibitor組細(xì)胞中Epac-1表達(dá)則升高(P<0.001)。

與miR-766 NC組細(xì)胞相比，＊P<0.001；與miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，#P<0.001。

詳見圖2。

2.3 不同組別心肌細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，與miR-766 NC組細(xì)胞相比，miR-766 mimics組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.05)，與miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，miR-766 inhibitor組細(xì)胞凋亡率則降低，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 流式細(xì)胞凋亡檢測不同組別心肌細(xì)胞凋亡情況

與miR-766 NC組細(xì)胞相比，＊P<0.05；與miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，#P<0.05。

2.4 不同組別心肌細(xì)胞中Epac-1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 Western Blot實驗結(jié)果顯示，與miR-766 NC組細(xì)胞相比，miR-766 mimics組細(xì)胞中Epac-1蛋白呈低表達(dá)(P<0.05)，Bcl-2、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白則呈高表達(dá)(P<0.05)；相反，與 miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞相比，miR-766 inhibitor組細(xì)胞中Epac-1蛋白呈高表達(dá)(P<0.05)，Bcl-2、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白則呈低表達(dá)(P<0.05)。詳見圖5。

圖5 不同組別心肌細(xì)胞Epac-1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5 miR-766-3p與Epac-1的靶向關(guān)系 結(jié)合生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測成熟miR-766-3p序列的靶基因，結(jié)果提示miR-766-3p與Epac-1 3′UTR存在結(jié)合位點。為了進(jìn)一步證實 miR-766-3p與Epac-1的直接結(jié)合作用，構(gòu)建了Epac-1野生型和突變型熒光報告載體，并對H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型Epac-1熒光報告載體的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-766 mimic組細(xì)胞熒光活性明顯低于miR-766 NC組細(xì)胞(P<0.05)，miR-766 inhibitor組細(xì)胞熒光活性則明顯高于miR-766 NC inhibitor組細(xì)胞(P<0.05)。miR-766-3p與Epac-1存在直接靶向作用關(guān)系。詳見圖6。

圖6 miR-766與Epac-1預(yù)測結(jié)合位點

3 討 論

急性心肌梗死是死亡率較高的心血管事件之一，研究指出，心肌梗死的發(fā)生主要與相關(guān)動脈血管阻塞、心肌細(xì)胞缺血缺氧繼發(fā)的心肌細(xì)胞壞死和凋亡有關(guān)[6]。心肌梗死病灶中央通常以壞死心肌細(xì)胞為主，梗死灶周邊部分則以凋亡心肌細(xì)胞為主。研究指出，心肌細(xì)胞的壞死和凋亡造成心肌細(xì)胞數(shù)量減少，是引起心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要原因之一[7-9]。如何減少心肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)已成為心肌梗死研究的熱點及難點。

miRNAs是一類小分子非編碼單鏈RNA，長18～24個堿基，主要通過與靶基因 3′UTR區(qū)域的結(jié)合，發(fā)揮降解靶基因mRNA或抑制靶基因翻譯的作用。miRNAs可通過調(diào)控其靶基因作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理病理過程，在機(jī)體生長發(fā)育的各個階段發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，有證據(jù)顯示， miRNAs參與調(diào)控心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞黏附力改變、血小板的生長和破裂、心肌細(xì)胞的增殖凋亡等，都離不開miRNAs的調(diào)控[10]。miRNAs在心血管疾病診斷、治療及預(yù)后評估中的價值也越來越受到人們的關(guān)注，miRNA也逐漸成為臨床治療和預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)疾病的靶標(biāo)分子。李瑞萍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧預(yù)處理條件下，心肌細(xì)胞中miRNA-30c-2-3p呈低表達(dá)，低表達(dá)miRNA-30c-2-3p可通過促進(jìn)XBP1s表達(dá)水平增加，減輕心肌細(xì)胞缺氧再灌注損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)。miRNA-223可通過靶向作用PARP-1，通過(Akt/mTOR)信號通路途徑保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞，減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。miR-142-3p可通過直接抑制(HMGB1)表達(dá)，影響轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGFβ1)/Smad3信號通路作用，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡和纖維化的發(fā)生，起到心肌細(xì)胞保護(hù)作用[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1和 miRNA-133a在大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激中調(diào)控凋亡信號途徑，在氧化應(yīng)激時miRNA-1 表達(dá)明顯升高，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提示miRNA廣泛參與心肌細(xì)胞的凋亡調(diào)控[14]。作為miRNA家族成員之一，miR-766也可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有體外實驗發(fā)現(xiàn)，miR-766在高糖環(huán)境呈明顯高表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞中miR-766表達(dá)可明顯降低細(xì)胞凋亡率，進(jìn)一步的凋亡實驗結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中高表達(dá)的miR-766可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，提示在心肌細(xì)胞凋亡過程中，miR-766發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用[15]。為了進(jìn)一步探究miR-766調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的靶基因及信號通路作用，本研究結(jié)合蛋白實驗、細(xì)胞凋亡實驗及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)行進(jìn)一步探究。結(jié)果顯示，外源性上調(diào)miR-766表達(dá)，可明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，靶向抑制miR-766的表達(dá)，則可抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且其對心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與Bcl-2、Caspase-3等相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)相關(guān)。靶基因預(yù)測結(jié)果提示，miR-766在心肌細(xì)胞中可直接靶向Epac-1。Epac-1 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個環(huán)腺苷酸感應(yīng)蛋白家族，是調(diào)節(jié)心臟活動的主要受體，與心肌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，在高糖處理的H9C2細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，沉默 Epac-1可顯著逆轉(zhuǎn)腸促胰素exendin-4的抗凋亡作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-766靶向Epac-1調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡主要與Bcl-2、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，但具體作用機(jī)制及相關(guān)信號通路尚未明確。有待后續(xù)研究進(jìn)一步反向分析miR-766與Epac-1的靶向作用關(guān)系。

綜上所述，miR-766 可通過負(fù)向調(diào)控 Epac-1 促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，miR-766與Epac-1有望成為干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡的臨床治療新靶點。