黃小川，涂 強(qiáng)，帥青云，付 杰，謝華強(qiáng)，張 琰， 曹 政

糖尿病是重要的心血管病危險(xiǎn)因素，糖尿病引起的血管病變已經(jīng)成為嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的重大慢性疾病。研究證實(shí)，血管內(nèi)皮損傷修復(fù)及血管新生能力障礙是糖尿病缺血性血管病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和始動(dòng)機(jī)制[1]。骨髓和外周血中存在內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是修復(fù)血管損傷的重要細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，在參與血管損傷修復(fù)和血管新生中起著重要作用[2]。胰高血糖素樣肽-1是經(jīng)腸道L細(xì)胞分泌的多肽類物質(zhì)，其通過與胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)結(jié)合促進(jìn)胰島素分泌從而發(fā)揮降糖作用[3]。近年來，GLP-1R激動(dòng)劑在2型糖尿病治療方面已獲肯定，與傳統(tǒng)降糖藥物相比，除可以穩(wěn)定降糖外，還具有減重、調(diào)脂、降壓、護(hù)腎和降低心血管不良事件風(fēng)險(xiǎn)等益處[4-5]。然而，GLP-1R能否調(diào)控EPCs功能活性，促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬研究下調(diào)GLP-1R 表達(dá)對(duì)小鼠EPCs功能活性的影響，并初步探討其可能機(jī)制，以期為EPCs介導(dǎo)的細(xì)胞療法提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 8周齡雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK-京-2016-0006)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(C-10831)及人纖維連接蛋白(F0895)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；EGM-2培養(yǎng)基(C-22121)購(gòu)自美國(guó)PromoCell公司；人重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(100-20)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；攜帶靶向GLP-1R的shRNA并表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重組腺病毒及攜帶無義序列shRNA并表達(dá)GFP的重組腺病毒均購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(KR123)購(gòu)自TIANGEN公司；RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)及β-actin抗體(AF5001)均為碧云天公司生產(chǎn)；GLP-1R抗體(sc-390773)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗AKT抗體(YT0185)、抗磷酸化AKT 抗體(YP0006)、抗eNOS 抗體(YM3164)、抗磷酸化eNOS 抗體(YP1238)購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞處理 從8周齡健康的C57BL/6J小鼠中分離提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞并誘導(dǎo)分化成EPCs，用培養(yǎng)5 d的EPCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合時(shí)，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為200進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染。確定所需病毒顆粒量，用不含血清及抗生素的EGM-2培養(yǎng)液稀釋腺病毒后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別于腺病毒轉(zhuǎn)染12 h、24 h、48 h和72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)GLP-1R的mRNA表達(dá) 腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)各組EPCs中GLP-1R mRNA表達(dá)。使用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，測(cè)定總RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。GLP-1R正向引物5′-ACGGTGTCCCTCTCAGAGAC-3′，反向引物5′-ATCAAAGGTCCGGTTGCAGAA-3′；內(nèi)參β-actin正向引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，反向引物5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法計(jì)算GLP-1R mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后將EPCs消化重懸，按照5×104個(gè)/孔接種于Boyden小室上室，置24孔板中，在下室中加入700 μL含或不含50 ng/mL血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的EGM-2培養(yǎng)基，然后將其置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)； 24 h后取出Boyden小室，小心棄去上層液體，用棉簽小心擦掉小室濾膜孔上表面上未遷移的細(xì)胞； 將Boyden小室置于4%多聚甲醛溶液中，固定10 min； 滴加適量4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，熒光顯微鏡下拍照，選擇5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞黏附能力檢測(cè) 腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后將EPCs消化重懸，按照3×105個(gè)/孔接種于12孔板，培養(yǎng)5 h后小心棄去上層培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛溶液中固定10 min； 滴加適量0.1%結(jié)晶紫染液染色，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗2次后于倒置顯微鏡下拍照，選擇5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞衰老檢測(cè) 腺病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后小心棄去上層培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛溶液中固定10 min，用PBS溶液小心將細(xì)胞清洗2次，之后按照碧云天公司生產(chǎn)的β-半乳糖苷酶染色試劑盒添加染色液，放置37 ℃不含二氧化碳的溫箱中孵育24 h之后于普通顯微鏡下觀察拍照，被染成藍(lán)色的即為衰老細(xì)胞，選擇5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)。

1.7 EPCs中GLP-1R，p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS蛋白表達(dá)量檢測(cè) 采用免疫印跡法(Western Blot)。腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，細(xì)胞充分裂解后于4 ℃離心(12 000 r/min)15 min，并取上清采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，并轉(zhuǎn)印GLP-1R、p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS蛋白至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用相應(yīng)的特異性一抗4 ℃孵育過夜，再經(jīng)洗膜，然后孵育相應(yīng)二抗室溫1.5 h后再次洗膜，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行吸光度測(cè)定 ，并與內(nèi)參β-actin吸光度相比較得到各組蛋白條帶相對(duì)值。

2 結(jié) 果

2.1 各組腺病毒轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)情況 腺病毒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率>80%，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h與72 h GFP陽性表達(dá)的EPCs數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但轉(zhuǎn)染72 h時(shí)細(xì)胞脫落現(xiàn)象更明顯，因此，后續(xù)采用腺病毒轉(zhuǎn)染48 h的EPCs進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。詳見圖1。

圖1 腺病毒轉(zhuǎn)染48 h熒光表達(dá)情況(MOI=200)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

2.2 下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)小鼠EPCs GLP-1R mRNA及蛋白表達(dá)的影響 RT-qPCR及Western Blot結(jié)果顯示：EPCs在轉(zhuǎn)染48 h后，以β-actin作為對(duì)照，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組GLP-1R mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。詳見圖2、圖3。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖2 各組EPCs中GLP-1R mRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖3 各組EPCs中GLP-1R蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

2.3 下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)小鼠EPCs遷移能力的影響 采用Transwell小室法觀察下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)EPCs體外遷移能力的影響。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組EPCs體外的遷移能力明顯降低(P<0.01)。詳見圖4、圖5。

圖4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖5 各組EPCs中遷移細(xì)胞相對(duì)數(shù)量(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

2.4 下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)小鼠EPCs黏附能力的影響 采用黏附實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)EPCs體外黏附能力的影響，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組EPCs體外黏附能力明顯下降(P<0.01)。詳見圖6、圖7。

圖6 各組細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖7 各組EPCs中黏附細(xì)胞相對(duì)數(shù)量(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

2.5 下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)小鼠EPCs衰老的影響 采用β-半乳糖苷酶染色法探討下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)EPCs衰老的影響，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組EPCs衰老明顯增加(P<0.01)。詳見圖8、圖9。

圖8 各組細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖9 各組EPCs中衰老細(xì)胞相對(duì)數(shù)量(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

2.6 下調(diào)GLP-1R表達(dá)對(duì)小鼠EPCs AKT/eNOS信號(hào)通路的影響 各組EPCs在轉(zhuǎn)染48 h后，用Western Blot方法檢測(cè)AKT/eNOS信號(hào)通路的變化情況。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞AKT磷酸化水平明顯降低(P<0.01)。eNOS是AKT的重要下游基因之一，其磷酸化后參與調(diào)控EPCs功能[6-7]。進(jìn)一步觀察p-eNOS蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示下調(diào)GLP-1R表達(dá)可明顯降低eNOS磷酸化水平(P<0.01)。詳見圖10～圖12。

圖10 各組EPCs中AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS蛋白表達(dá)電泳圖(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖11 各組EPCs中AKT/p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

與對(duì)照組比較，＊P<0.01。圖12 各組EPCs中eNOS/p-eNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n=4)(A為正常組；B為對(duì)照組；C為轉(zhuǎn)染組)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病人存在著EPCs數(shù)量和功能下降，可能是導(dǎo)致糖尿病病人血管內(nèi)皮修復(fù)能力下降、血管內(nèi)皮損傷的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制之一[8-9]。因此，積極尋找EPCs功能下降的相關(guān)機(jī)制是糖尿病血管損傷修復(fù)的重要策略，對(duì)于減少遠(yuǎn)期心血管疾病及其相關(guān)并發(fā)癥有重要意義。

越來越多的研究表明，EPCs功能障礙在糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。然而，其相關(guān)的分子機(jī)制和綜合治療仍有待闡明。GLP-1R為7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，由7α螺旋跨膜域，3個(gè)胞外環(huán)，3個(gè)胞內(nèi)環(huán)，一個(gè)胞外N末端和一個(gè)胞內(nèi)C末端構(gòu)成[10]。現(xiàn)有研究表明：除胰島外，在小鼠心內(nèi)膜、血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均有GLP-1R分布，其中心內(nèi)膜分布最多，說明GLP-1R存在于心血管系統(tǒng)的多個(gè)部位，也是GLP-1可以作用于心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[11-12]。既往研究顯示，GLP-1R具有心血管保護(hù)作用，并有可能改善2型糖尿病病人的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[13-14]。本研究觀察到下調(diào)健康小鼠骨髓EPCs中GLP-1R的表達(dá)，可降低EPCs遷移、黏附能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。這些結(jié)果表明，GLP-1R可能參與EPCs功能活性調(diào)控，并參與EPCs介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷修復(fù)。已有報(bào)道顯示，AKT/eNOS信號(hào)通路參與EPCs的分化和缺血損傷[15-16]。研究證實(shí)，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中，通過改變NO通路可影響EPCs增殖、遷移和管腔形成能力[17]。eNOS是調(diào)節(jié)內(nèi)源性NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，受PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控[18]。 因此，推測(cè)eNOS/NO可能是促進(jìn)EPCs增殖、黏附、遷移和血管生成的重要途徑。為進(jìn)一步探討調(diào)控機(jī)制，通過檢測(cè)GLP-1R與AKT/eNOS通路之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GLP-1R下調(diào)組小鼠EPCs AKT/eNOS磷酸化水平明顯降低。這些結(jié)果表明GLP-1R很有可能通過調(diào)控AKT/eNOS途徑從而影響EPCs功能活性。

本研究存在一定的局限性，首先僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察了GLP-1R下調(diào)對(duì)健康小鼠EPCs功能的影響，今后有待進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)探討GLP-1R對(duì)EPCs功能活性的調(diào)控作用；其次，對(duì)于GLP-1R調(diào)控EPCs功能活性的機(jī)制，僅檢測(cè)了GLP-1R下調(diào)對(duì)AKT/eNOS信號(hào)通路的影響，未進(jìn)行進(jìn)一步深入的探討。

綜上所述，本研究顯示GLP-1R可調(diào)控健康小鼠骨髓來源的EPCs功能活性，AKT/eNOS信號(hào)通路可能參與了GLP-1R對(duì)EPCs功能活性的調(diào)控。本研究為進(jìn)一步發(fā)揮GLP-1R及其激動(dòng)劑在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的防治方面提供了新的理論依據(jù)。