孔磊，余進德，張登云，梅超，陳玉惠，李靖

(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis) 真菌具有產(chǎn)豐富次生代謝產(chǎn)物的巨大潛力，迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者已從擬盤多毛孢屬中分離得到了多種具有豐富活性的化合物，如生物堿類、異香豆素衍生物、香豆素類、萜類、醌類、半醌類等，是產(chǎn)生新的活性化合物的重要來源[1-2]。前期實驗表明重寄生擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)cr013菌株具有產(chǎn)新型聚酮類化合物的巨大潛力[3]，且不同于內(nèi)生擬盤多毛孢產(chǎn)生的化合物[4]。

聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)是催化合成具有抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗真菌等活性的聚酮類化合物的關(guān)鍵酶[5]，與脂肪酸合成有相同的前體——乙酸，兩者的生物合成過程相似，其共同的生物合成途徑稱為乙酸途徑[6]。乙酸單元先被硫代酯化反應(yīng)活化為乙酰輔酶A(起始單元)和丙二酰輔酶A(延長單元)，酰基轉(zhuǎn)移酶(acyltransferase，AT)結(jié)構(gòu)域?qū)⒁阴］o酶A(acetyl Coenzyme A)的?；D(zhuǎn)移到?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)，ACP將起始單元傳遞到酮合酶(ketosynthase，KS)結(jié)構(gòu)域，并可用于接收AT催化的擴鏈單元丙二酰輔酶A，最后通過一系列還原、氧化等反應(yīng)，完成合成[7]。按照結(jié)構(gòu)域的不同，PKS可以分為I型、II型和III型PKS，其中對I型PKS的研究較多。I型PKS分為模塊化PKS(細(xì)菌)和迭代PKS(真菌)，模塊化PKS將它們的域排列在按順序操作的模塊中，而迭代PKS只有一組域，在每次迭代中重復(fù)使用。迭代PKS根據(jù)序列中的β位置是否存在裁剪域分為3類：(1)非還原型PKS(non-reducing PKS，NR-PKS)，無還原裁剪域，其中PT是其特有的結(jié)構(gòu)域[8]；(2)高度還原型PKS(highly-reducing，HR-PKS)均含KR和ER；(3)部分還原型PKS(partial-reducing，PR-PKS)，含酮基還原酶(ketoreductase，KR)，但不含烯酰還原酶(enoylreductase，ER)[9]。

近幾年來，高通量技術(shù)發(fā)展迅速，基因組測序成本降低，利用基因組挖掘更多潛在的新天然化合物，且利用基因組挖掘方法結(jié)合分析工具能夠促進新化合物的發(fā)現(xiàn)，再通過生物信息學(xué)分析可預(yù)測潛在基因編碼的產(chǎn)物[10]。目前，已有很多科研人員利用生物信息學(xué)挖掘基因組，獲得了更多的PKS基因[11-15]。2011年，Bunet等[11]通過基因組挖掘，揭示了Streptomycesambofaciens中有10余個基因簇參與了次級代謝產(chǎn)物的合成，其中alp基因簇參與了II型聚酮類化合物Kinamycin的生物合成；2019年，原曉龍等[12]從蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)的基因組中，通過生物信息學(xué)分析，挖掘到14個PKS基因后，對其蛋白序列進行結(jié)構(gòu)域和聚類分析來推測其功能；2020年該課題組以相同的方法從球孢白僵菌中發(fā)現(xiàn)了13個PKS基因，也對獲得的PKS基因的結(jié)構(gòu)域和功能進行了推測[13]；János等[14]也通過系統(tǒng)發(fā)育方法對PKS蛋白序列中的結(jié)構(gòu)域進行了排列和分析，以此來推測Aspergillus屬中PKS基因的功能；Preetida等[15]對曲霉屬(Aspergillussp.)全基因組測序，從5株曲霉菌中獲得21～34個PKS基因。本研究首次對重生擬盤多毛孢cr013菌株全基因中的PKS基因組進行了挖掘，挖掘了cr013菌株基因組中的PKS基因，對其進行生物信息學(xué)分析，推測其可能的功能，通過實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)的方法，檢測PKS基因在改良Fries培養(yǎng)基上5個不同時間段的表達(dá)情況，以此為重寄生擬盤多毛孢PKS基因的開發(fā)利用及其還原型聚酮類化合物的生物合成機制的闡明奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 微生物材料

cr013菌株分離自感病的華山松(Pinusarmandii)枝干的茶藨生柱銹菌(Cronartiumribicola)銹孢子堆[16]，現(xiàn)保存于西南林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)教研室。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

挑取規(guī)格約為0.5 cm的cr013菌塊接種到改良Fries培養(yǎng)基上(0.13 g CaCl2·2H2O，1.0 g KH2PO4，5.0 g 酒石酸銨，0.5 g MgSO4·7H2O，20.0 g 蔗糖，0.1 g NaCl，1.0 g 酵母浸膏，20.0 g瓊脂，1.0 g NH4NO3， 1 000 mL蒸餾水；自然pH5.7)，放置室溫分別培養(yǎng)4、8、12、16及20 d，并收集5個不同培養(yǎng)時間的菌絲體，迅速放置-80 ℃冰箱保存，以供后續(xù)qPCR實驗使用。

1.2.2 聚酮合酶基因的挖掘

獲得cr013菌株基因組后，利用8個注釋數(shù)據(jù)庫(NR、KEGG、COG、SwissProt、GO、ARDB、PHI、CAZy)對該基因組中基因的功能進行注釋，最后共有94%的蛋白序列注釋到功能。通過生物信息學(xué)分析注釋到的數(shù)據(jù)，獲得cr013菌株基因組中所有完整的mRNA序列及蛋白序列。以結(jié)構(gòu)和功能已知的同屬PestalotiopsisficiW106-1[17](登錄號：W3X7U2.1；A0A067XNI2.1)的PKS蛋白的KS保守結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)序列為模板，對cr013菌株的基因組進行搜索，挖掘cr013菌株基因組中潛在的PKS基因，并利用Conversed Domain Database數(shù)據(jù)庫分析挖掘到的PKS蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 PKS蛋白的聚類分析

從NCBI上下載已知功能的高度還原性PKS、部分還原PKS和非還原PKS的蛋白質(zhì)序列作為參考序列，以此構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。通過Clustal W對挖掘到的28條PKS蛋白序列與所選擇的57條真菌PKS的蛋白序列進行比對，用MEGA 7.0中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自檢舉重復(fù)1 000次，其余參數(shù)默認(rèn)。利用生物信息學(xué)分析對cr013菌株基因組挖掘到的28條PKS基因進行分類和推測其功能。

1.2.4PKS基因的表達(dá)分析

根據(jù)本課題組前期研究，cr013菌株中分離到的4種新聚酮類化合物均從改良Fries培養(yǎng)基分離得到的[3]。所以將cr013菌株在改良Fries培養(yǎng)基上室溫下分別培養(yǎng)4、8、12、16及20 d后，總RNA的提取采用UNIQ-10柱式Trizol 總RNA抽提試劑盒，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)序列比對結(jié)果，分別從非還原型PKS和還原型PKS中分別選擇相似性最高，且結(jié)構(gòu)和功能已知的基因來進行表達(dá)分析。cr013菌株基因組獲得非還原型crPKS3基因和還原型crPKS12基因的全長mRNA序列，利用Primer 5.0軟件分別在兩條PKS基因的保守KS片段設(shè)計特異性引物(crPKS3-F：CAAGGTGCTGTTGATGTTCC，crPKS3-R：CTGCAATGCGTTTCCTGTTC；crPKS12-F：CCGTGATTCGGACACCATT，crPKS12-R：GACTCTGACACGCCAAATGC)，用設(shè)計的特異性引物檢測PKS基因在5個不同時間段的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 cr013菌株基因組中PKS基因的挖掘

以真菌PKS蛋白的KS保守結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)序列為模板，對cr013菌株基因組(基因登錄號：GCA_018092615.1)進行掃描后，結(jié)果表明有28個PKS基因(編號：crPKS1～28，基因登錄號：MW373474～MW373501)。利用BLASTp將獲得的28個PKS基因一一進行比對，利用Conversed Domain Database分析其結(jié)構(gòu)域。按照結(jié)構(gòu)域組成的不同，將28個PKS基因分為3類：NR-PKS、PR-PKS和HR-PKS。其中包括8個NR-PKS(crPKS1～8)；4個PR-PKS(crPKS9～10、crPKS17、crPKS19)；14個HR-PKS(crPKS11～13、crPKS15～16、crPKS18、crPKS20～27)；2個雜合NRPS/PKS(crPKS14、crPKS28)均為PR-PKS與NRPS的雜合，結(jié)果見表1。

表1 cr013菌株中的28個PKS基因Tab.1 28 PKS genes in the cr013 strain

通過將cr013菌株中的PKS蛋白序列的相似性和結(jié)構(gòu)域組成與其他真菌的PKS蛋白序列相比，發(fā)現(xiàn)crPKS1與Xylariasp.BCC 1067(登錄號：AAM93545.1)中編碼黑色素生物合成的PKS蛋白序列有77.89%的一致性；crPKS3與PestalotiopsisficiW106-1(登錄號：A0A067XNI2.1)中參與pestheic acid生物合成的PKS蛋白序列有87.20%的一致性；crPKS4和crPKS8分別與Daldiniachildiae(登錄號：XP_033440273.1)和Aspergillusudagawae(登錄號：GFG26526.1)中編碼分生孢子黃色素生物合成的PKS蛋白序列有69.62%和56.50%的一致性；crPKS10和crPKS25分別與Fusariumproliferatum(登錄號：RKL45057.1)和Fusariumoxysporum(登錄號：RKK90944.1)中編碼美伐他汀生物合成的PKS蛋白序列有53.01%和44.80%的一致性；crPKS11與Aspergilluslentulus(登錄號：GFF99174.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的LovF基因的蛋白質(zhì)序列有47.51%的一致性；crPKS12與Daldiniachildiae(登錄號：XP_033438860.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的LovF基因的蛋白質(zhì)序列有71.61%的一致性；crPKS13與Talaromycespinophilus(登錄號：KAF3392115.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的mokB基因的蛋白質(zhì)序列有47.02%的一致性；crPKS16與Fusariumproliferatum(登錄號：RKL38412.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的mokB基因的蛋白質(zhì)序列有60.44%的一致性；crPKS19與Valsamali(登錄號：KUI66310.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的LovF基因的蛋白質(zhì)序列有50.00%的一致性；crPKS22與Alternariatenuissima(登錄號：RYN89545.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶生物合成的的蛋白質(zhì)序列有53.13%的一致性；crPKS23與Trichodermalentiforme(登錄號：KAF3074072.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的mokB基因的蛋白質(zhì)序列有64.40%的一致性；crPKS26與Madurellamycetomatis(登錄號：KXX82669.1)中編碼洛伐他汀二酮合酶的LovF基因的蛋白質(zhì)序列有56.08%的一致性；crPKS20與Lachnellulaarida(登錄號：TVY19100.1)中編碼富馬霉素生物合成的蛋白質(zhì)序列有65.22%的一致性；crPKS28與Trichodermaarundinaceum(登錄號：RFU77043.1)中編碼洛伐他汀九酮合酶生物合成的蛋白質(zhì)序列有54.48%的一致性；crPKS2、crPKS5、 crPKS6、 crPKS7、crPKS9、crPKS14、crPKS15、crPKS17和crPKS18這9個PKS的終產(chǎn)物尚未知。

2.2 PKS蛋白序列聚類分析

將cr013菌株基因組中的PKS蛋白序列與NCBI中相似性較高、功能或化合物已知的PKS蛋白序列進行聚類分析，由系統(tǒng)進化樹(圖1)推測crPKS10、crPKS25 、crPKS27蛋白序列可能參與美伐他汀(compactin)的生物合成；crPKS19、crPKS12、crPKS26、crPKS13、crPKS11、crPKS23、crPKS28蛋白序列可能催化洛伐他汀(lovastatin)的生物合成；crPKS3蛋白序列可能參與pestheic acid的生物合成；crPKS1蛋白序列可能參與黑色素(melanin)的生物合成；crPKS4、crPKS8蛋白序列可能參與黃色分生孢子色素(conidial yellow pigment)的生物合成；crPKS20蛋白序列可能參與富馬霉素(fumagillin)的生物合成；而crPKS24、crPKS15、crPKS18、crPKS22、crPKS21、crPKS16、crPKS9、crPKS14、crPKS17、crPKS6、crPKS7、crPKS5、crPKS2蛋白序列均與未知功能的聚酮類化合物聚在一起，其催化的化合物未知。

圖1 cr013菌株中的PKS與其他相關(guān)真菌PKS蛋白的聚類比較Fig.1 The cluster comparison of the PKS in cr013 strain and other PKS proteins of related fungus

2.3 PKS基因的表達(dá)分析

本課題組前期研究表明，cr013菌株中分離到的4種新還原型聚酮類化合物均從改良Fries培養(yǎng)基分離得到[3]。所以將cr013菌株在改良Fries培養(yǎng)基上室溫下分別培養(yǎng)4、8、12、16及20 d后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并檢測特異性引物的有效性。圖2結(jié)果顯示，非還原型crPKS3和高度還原型crPKS12基因的溶解曲線都是單峰，證明這兩條目的基因的引物均為特異性擴增。

圖2 檢測crPKS3和crPKS12基因特異性引物的有效性

由圖3結(jié)果可知，非還原型聚酮crPKS3和還原型聚酮crPKS12基因在5個不同時間段均可表達(dá)，且基因表達(dá)量差異較大。兩條PKS基因均在改良Fries培養(yǎng)基培養(yǎng)第16 d時，基因表達(dá)量最高，但crPKS12的表達(dá)量為21.72，crPKS3的表達(dá)量為12.19，crPKS12的表達(dá)量遠(yuǎn)高于crPKS3。

圖3 crPKS3 (左)和crPKS12(右)基因在5個不同培養(yǎng)時間的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of crPKS3 (left)and crPKS12 (right)genes in five different culture time

3 結(jié)論與討論

重寄生擬盤多毛孢產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物區(qū)別于內(nèi)生擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)真菌。本課題組前期從該重寄生擬盤多毛孢真菌中分離鑒定了4個還原型聚酮類化合物，具有較強的抗腫瘤活性，該聚酮類化合物為擬盤多毛孢屬真菌中首次被發(fā)現(xiàn)[3]。

為獲得更多新穎的聚酮合酶基因，本研究通過基因組挖掘[20]和生物信息學(xué)分析，挖掘到28個PKS基因，包括14個HR-PKS、4個PR-PKS、8個NR-PKS和2個雜合NRPS/PKS，說明重寄生擬盤多毛孢cr013菌株中PKS基因多樣高，也證明了該菌株具有產(chǎn)PKS的巨大潛力?；诨蜻M化過程，根據(jù)蛋白質(zhì)序列相似性來推測未知功能與已知功能蛋白質(zhì)序列的同源關(guān)系，以此推測未知PKS基因的功能。研究結(jié)果顯示，重寄生擬盤多毛孢cr013菌株中有14條PKS蛋白序列聚類到了已知功能的分支，產(chǎn)生了6種可能的聚酮類化合物，其中他汀類物質(zhì)最為豐富，3條PKS蛋白質(zhì)序列可能參與美伐他汀或其類似物的生物合成，7條PKS蛋白質(zhì)序列可能參與洛伐他汀或其類似物的生物合成。

目前，他汀類藥物是重要的降脂藥物，主要包括洛伐他汀、美伐他汀等藥物[21]。1976年，Brown等[22]從Penicilliumbrevicompactum中首次分離到了美伐他汀，這也是第一個他汀類物質(zhì)，同時也是普伐他汀和辛伐他汀的直接轉(zhuǎn)化底物，其遵循聚酮生物合成途徑，屬于聚酮類化合物，具有十分重要的市場地位，能夠為他汀類的藥物發(fā)展提供原料和底物[23]。洛伐他汀是一類天然且具有重要價值的聚酮類化合物，目前，還未見通過合成方法獲得大量洛伐他汀的研究報道，探討利用發(fā)酵方式來獲得大量他汀類物質(zhì)具有重要的意義。關(guān)于洛伐他汀的生物合成的主要來源是土曲霉(Aspergillusterreus)和紅曲霉(Monascuspurpureus)，尚未發(fā)現(xiàn)從重寄生擬盤多毛孢真菌中分離獲得他汀類物質(zhì)。優(yōu)化發(fā)酵工藝、優(yōu)化培養(yǎng)基成分等均有助于提高洛伐他汀的產(chǎn)量[24]。在后續(xù)研究中，將進一步篩選和優(yōu)化其培養(yǎng)條件，為新活性化合物的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。