苯酰菌胺原藥和水分散粒劑的高效液相色譜分析方法研究

陳慧萍，孟 璨，馬杜康，趙鵬躍，黃啟良

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

苯酰菌胺是一種苯甲酰胺類殺菌劑，由羅門哈斯公司（現(xiàn)為陶氏農(nóng)業(yè)科學(xué)公司）研發(fā)，兼具保護(hù)和治療作用。原藥為白色精細(xì)粉末，具有類似甘草的氣味。熔點(diǎn)為159.5～161℃；蒸氣壓小于1×10-2mPa（小于或等于45℃）；分配系數(shù)：KowlgP值為3.76（20℃）；相對(duì)密度為1.38（20℃）。溶解度：在水中溶解度為0.681 mg/L（20℃）；在丙酮中溶解度為55.7 g/L（25℃）。水溶液中水解DT50約為15 d（pH為4和7）、8 d（pH為9）[1]。苯酰菌胺可有效防治由卵菌綱真菌引起的病害，對(duì)葡萄霜霉病有特效，對(duì)部分子囊菌和擔(dān)子菌病害也有較好的生物活性[2]。

目前，關(guān)于苯酰菌胺分析方法的報(bào)道較少。有文獻(xiàn)報(bào)道用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)葡萄中苯酰菌胺含量的方法[3]。張春榮等[4]報(bào)道了用氣相色譜分析黃瓜及土壤中苯酰菌胺含量的方法。李皓[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)了香椿等芽菜類蔬菜中苯酰菌胺的含量。遲夢(mèng)宇等[6]建立了一種液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定梨中苯酰菌胺含量的分析方法。然而，苯酰菌胺農(nóng)藥產(chǎn)品的檢測(cè)方法尚無(wú)報(bào)道，其原藥及制劑中有效成分含量的測(cè)定尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方法。筆者建立了在同一液相條件下測(cè)定苯酰菌胺原藥和水分散粒劑的方法，為苯酰菌胺農(nóng)藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-DAD高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司公司；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；有機(jī)過(guò)濾器（微膜孔徑為0.45 μm）。

乙腈（色譜純）、二次蒸餾水、苯酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%），F(xiàn)irst Standard公司；96%苯酰菌胺原藥、75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑，市場(chǎng)購(gòu)買獲得。

1.2 液相色譜操作條件

流動(dòng)相：乙腈＋水（體積比為65∶35）；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm進(jìn)樣體積：5 μL；保留時(shí)間：苯酰菌胺約10.4 min。

上述液相色譜操作條件是典型的操作參數(shù)，可以根據(jù)不同儀器特點(diǎn)和溫度條件，對(duì)給定的操作參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以獲得最佳效果。典型的苯酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品、96%苯酰菌胺原藥、75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑樣品高效液相色譜圖見(jiàn)圖1、2、3。

圖1 苯酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖2 96%苯酰菌胺原藥高效液相色譜圖

圖3 75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑高效液相色譜圖

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

稱取含0.10 g（精確至0.000 01 g）苯酰菌胺標(biāo)樣于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲波振蕩10 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用移液管移取10 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

1.3.2 試樣溶液的配制

稱取含0.10 g（精確至0.000 01 g）苯酰菌胺的試樣于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲波振蕩15 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用移液管取10 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

1.3.3 測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針苯酰菌胺峰面積相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中苯酰菌胺的峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中苯酰菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式（1）計(jì)算。

式中：w為試樣中苯酰菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A2為試樣溶液中苯酰菌胺峰面積的平均值，mAU·s；m1為苯酰菌胺標(biāo)樣的質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中苯酰菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A1為標(biāo)樣溶液中苯酰菌胺峰面積的平均值，mAU·s；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)苯酰菌胺物化性質(zhì)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動(dòng)相。將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，隨著乙腈比例的增加，保留時(shí)間減小，當(dāng)乙腈與水比例達(dá)到70∶30時(shí)，有雜質(zhì)峰干擾苯酰菌胺，峰純度達(dá)不到試驗(yàn)要求，最終選擇乙腈＋水體積比為65∶35作為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min。該條件下，苯酰菌胺色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器對(duì)苯酰菌胺溶液在210～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。苯酰菌胺的紫外光譜圖如圖4所示，從圖中可以看到苯酰菌胺的最大吸收波長(zhǎng)約210 nm，但在該波長(zhǎng)處有干擾，而吸收波長(zhǎng)在約240 nm處為次高峰，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為240 nm。

圖4 苯酰菌胺紫外吸收譜圖

2.3 分析方法的特異性

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別苯酰菌胺。苯酰菌胺標(biāo)樣、96%苯酰菌胺原藥、75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中的苯酰菌胺HPLC-DAD峰純度均大于990，有效成分處無(wú)其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的線性關(guān)系

按1.3.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制方法配制標(biāo)樣溶液，用甲醇以1∶1的比例梯度稀釋4次，獲得5個(gè)濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照分別進(jìn)同樣體積的標(biāo)樣，進(jìn)行測(cè)定，取2次測(cè)定的平均結(jié)果。以苯酰菌胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖5可以看出，當(dāng)苯酰菌胺質(zhì)量濃度在100.07 mg/L～1 601.18 mg/L（進(jìn)樣體積5 μL），與相應(yīng)的苯酰菌胺峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y=8.296 8 x＋51.66，相關(guān)系R2=1.000 0，完全可以滿足定量分析要求。

圖5 苯酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 分析方法的精密度

從同一樣品中稱取5個(gè)試樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)得96%苯酰菌胺原藥和75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.15%和0.03%（表1）。

表1 苯酰菌胺水分散粒劑分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

96%苯酰菌胺原藥中苯酰菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)為0.16，小于修改的Horwitz公式的計(jì)算值（2（1-0.51ogC）×0.67=1.35，其中C為樣品中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值），表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中苯酰菌胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)為0.34，小于修改的Horwitz公式的計(jì)算值（2（1-0.51ogC）×0.67=1.96），表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

2.6 水分散粒劑分析方法的準(zhǔn)確度

分別稱取5個(gè)已知含量的75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑試樣于50 mL容量瓶中，加入2.4中配制的1 601.18 mg/L苯酰菌胺標(biāo)樣溶液5 mL，用甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，再用甲醇定容至刻度，搖勻。苯酰菌胺的回收率按式（2）計(jì)算。

式中：R為回收率，%；a為測(cè)定量，mg；b為所稱樣品中待測(cè)組分量，mg；c為理論加入量，mg。

經(jīng)測(cè)定，75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中有效成分苯酰菌胺的回收率為101.50%，結(jié)果見(jiàn)表2，表明有效成分分析方法準(zhǔn)確度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

表2 苯酰菌胺水分散粒劑分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

利用高效液相色譜對(duì)96%苯酰菌胺原藥和75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中的苯酰菌胺進(jìn)行了定性定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法分離效果好、準(zhǔn)確度和精密度高、線性關(guān)系良好，并且操作簡(jiǎn)便、快速，可以進(jìn)行苯酰菌胺原藥及制劑產(chǎn)品的有效成分分析。