陳 國，韓鵬黎，陳柯茹，李明闖，張青松，陳 征，董漢華，錢躍軍，呂 晶

1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院甲狀腺外科，河南 鄭州 450007；2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，河南 鄭州 450007

甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）是一種起源于甲狀腺濾泡旁細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率占全部甲狀腺惡性腫瘤的3%～5%，病死率高達13.4%［1-2］，易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差，因此MTC的早期診斷和早期治療尤為重要，尋找潛在的治療靶點具有重要意義。

miR-19b在非小細胞肺癌組織中高表達，并可參與其發(fā)生、發(fā)展過程［3］。miR-19b在黑色素瘤細胞中表達升高，可能是黑色素瘤治療的潛在靶點［4］。miR-19b-3p在結(jié)腸癌組織及細胞系中表達上調(diào)，并可促進結(jié)腸癌細胞增殖［5］。但miR-19b-3p在MTC組織及細胞中的表達情況及其對MTC細胞凋亡的影響尚未可知。微管相關(guān)腫瘤抑制基因1（microtubule-associated tumor suppressor gene 1，MTUS1）在腎癌、膽囊癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和頭頸部腫瘤中低表達，提示其可能有抑癌作用［6-8］。MTUS1在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）組織中低表達，MTUS1基因的表達異常在PTC的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要作用［9］。Ou等［10］研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）PTENP1可以通過miR-19b/MTUS1抑制宮頸癌患者的腫瘤細胞增殖和侵襲。通過靶基因預(yù)測，miR-19b-3p的靶基因可能是MTUS1，但miR-19b-3p是否通過調(diào)控MTUS1的表達影響MTC細胞的凋亡目前仍不清楚。因此，本研究通過體外觀察miR-19b-3p表達對MTC細胞凋亡的影響，分析其是否靶向調(diào)控MTUS1從而發(fā)揮作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與主要試劑

MTC-TT細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，F(xiàn)12k培養(yǎng)基胰酶溶液購自美國HyClone公司，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購自羅氏公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MTUS1、Bcl-2、Bax、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的IgG二抗購自美國Santa Cruz公司；anti-miR-19b-3p、miR-19b-3p mimics、si-MTUS1及其各自陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；增強化學發(fā)光試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 研究對象

以2017年3月—2018年5月鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院收治的36例MTC患者為研究對象，所有患者均經(jīng)臨床病理學檢查證實為MTC，男性12例，女性24例，平均年齡（56.75±4.93）歲；所有患者均接受手術(shù)治療并于術(shù)中切除MTC組織及癌旁組織，迅速將組織放入液氮中，術(shù)后將其轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療，本研究經(jīng)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染與分組

MTC-TT細胞復蘇后用培養(yǎng)基（F12k培養(yǎng)基+20%胎牛血清+1%雙抗）培養(yǎng)細胞，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)融合度達到80%時轉(zhuǎn)染。將MTC-TT細胞分為anti-miR-19b-3p組、anti-miR-NC組、pcDNAMTUS1組、pcDNA組、anti-miR-19b-3p+si-MTUS1組、anti-miR-19b-3p+si-NC組、miR-19b-3p組、miR-NC組，轉(zhuǎn)染后6 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測MTC組織及MTC-TT細胞中miR-19b-3p、MTUS1 mRNA的表達

收集MTC組織及MTC-TT細胞各組對數(shù)生長期細胞，采用TRIzol一步法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，擴增條件為：95℃預(yù)變性1min，95℃15s，47℃20s，72℃45s，35個循環(huán)。熔解曲線：47℃→95℃，每20s升溫1℃。目的基因擴增用ΔΔCt法計算，A=Ct（目的基因，實驗樣本）-Ct（內(nèi)標基因，實驗樣本），B＝Ct（目的基因，對照樣本）-Ct（內(nèi)標基因，對照樣本），K＝A-B，表達倍數(shù)＝2-K。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab.1 RTFQ-PCR primer sequence

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測MTC組織及MTC-TT細胞中MTUS1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表達

收集MTC組織及MTC-TT各組對數(shù)生長期細胞，細胞裂解提取蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，加入已稀釋好的一抗4 ℃下過夜，回收已稀釋的一抗，用洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）洗3次，每次5 min，加入稀釋好的二抗，室溫溫育30 min，用TBST在室溫下的搖床上洗4次，每次5 min，化學發(fā)光檢測，凝膠成像系統(tǒng)測定目的條帶的吸光度（D）值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

利用TargetScans靶基因預(yù)測軟件篩選出的MTUS1可能為miR-19b-3p的靶基因，MTUS1的3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）可能是miR-19b-3p的結(jié)合位點。將含有miR-19b-3p結(jié)合位點的MTUS1 3’-UTR序列及其突變體插入熒光素酶報告基因載體中得到WT-MTUS1、MUT-MTUS1，另將MTC-TT細胞接種于24孔板中，miR-19b-3p mimic組或miR-NC組分別與WT-MTUS1、MUT-MTUS1共轉(zhuǎn)染人MTC-TT細胞，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，裂解后置于室溫下振蕩20 min，采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 miR-19b-3p和MTUS1在MTC組織中的表達

RTFQ-PCR檢測MTC組織及癌旁組織中miR-19b-3p和MTUS1 mRNA的表達，結(jié)果顯示，MTC組織中miR-19b-3p的表達水平（2.741±0.049）較癌旁組織（0.894±0.037）顯著升高（P＜0.05），而MTC組織中MTUS1 mRNA的表達水平（0.475±0.031）較癌旁組織（1.128±0.026）顯著降低（P＜0.05），MTC組織中MTUS1蛋白的表達水平（0.329±0.020）較癌旁組織（0.872±0.0 3 3）也顯著降低（P＜0.05，圖1）。36例MTC患者MTC組織及癌旁組織中miR-19b-3p和MTUS1 mRNA的表達情況見表2。

圖1 miR-19b-3p和MTUS1在MTC組織及癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of miR-19b-3p and MTUS1 in MTC tissue and para-carcinoma tissue

表2 miR-19b-3p和MTUS1在MTC組織及癌旁組織中的表達情況Tab.2 Expressions of miR-19b-3p and MTUS1 in MTC and para-carcinoma tissue

2.2 抑制miR-19b-3p表達對MTC-TT細胞凋亡的影響

采用RTFQ-PCR實驗驗證轉(zhuǎn)染anti-miR-19b-3p的轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，anti-miR-19b-3p轉(zhuǎn)染組中miR-19b-3p的表達水平（0.361±0.038）與anti-miR-NC轉(zhuǎn)染組（1.028±0.084）相比顯著降低（P＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，anti-miR-19b-3p轉(zhuǎn)染組中Bcl-2蛋白的表達水平（0.351±0.046）較anti-miR-NC轉(zhuǎn)染組（0.758±0.083）顯著降低（P＜0.05），而anti-miR-19b-3p轉(zhuǎn)染組中Bax蛋白的表達水平（0.682±0.038）較anti-miR-NC轉(zhuǎn)染組（0.319±0.074）顯著升高（P＜0.05），antimiR-19b-3p轉(zhuǎn)染組中cleaved caspase-3蛋白的表達水平（0.592±0.062）較anti-miR-NC轉(zhuǎn)染組（0.257±0.057）也顯著升高（P＜0.05，圖2）。表明抑制miR-19b-3p表達可通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白表達進而誘導MTC-TT細胞凋亡。

圖2 抑制miR-19b-3p表達對MTC-TT細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibition of miR-19b-3p expression on apoptosis of MTC-TT cells

2.3 MTUS1過表達對MTC-TT細胞凋亡的影響

采用Western blot檢測MTUS1過表達的轉(zhuǎn)染效果，pcDNA-MTUS1組MTC-TT細胞中MTUS1的蛋白表達水平（0.869±0.041）較pcDNA組（0.547±0.027）顯著升高（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。pcDNA-MTUS1組（0.604±0.033）較pcDNA組（0.298±0.052）明顯促進Bax的表達（P＜0.05），pcDNA-MTUS1組（0.634±0.021）較pcDNA組（0.781±0.042）明顯抑制Bcl-2的表達（P＜0.05，圖3）。表明MTUS1過表達可通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白表達進而誘導MTC-TT細胞凋亡。

圖3 MTUS1過表達對MTC-TT細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of MTUS1 overexpression on apoptosis of MTC-TT cells

2.4 miR-19b-3p靶向調(diào)控MTUS1的表達

采用TargetScan預(yù)測miR-19b-3p的靶基因，結(jié)果顯示，MTUS1可能為miR-19b-3p的功能性靶基因，MTUS1的3’-UTR的靶點見圖4A。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-MTUS1與miR-19b-3p mimic的熒光素酶活性（0.385±0.050）較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-MTUS1與miR-NC的熒光素酶活性（0.998±0.047）顯著降低（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染MUT-MTUS1與miR-19b-3p mimic的熒光素酶活性（0.998±0.041）較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-MTUS1與miR-NC的熒光素酶活性（0.999±0.033）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4），表明MTUS1是miR-19b-3p的直接靶基因。miR-19b-3p組MTC-TT細胞中MTUS1的表達水平（0.1937±0.0201）較miR-NC組（0.5269±0.0317）顯著降低（P＜0.05），anti-miR-19b-3p組MTC-TT細胞中MTUS1的表達水平（0.8364±0.0403）較anti-miR-NC組（0.5071±0.0282）顯著升高（P＜0.05）。這表明miR-19b-3p可負向調(diào)控靶基因MTUS1的表達。

圖4 miR-19b-3p靶向調(diào)控MTUS1的表達Fig.4 miR-19b-3p targeted regulation of MTUS1 expression

2.5 抑制MTUS1表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-19b-3p表達對MTC-TT細胞凋亡的作用

Anti-miR-19b-3p+si-MTUS1組MTC-TT細胞中Bcl-2蛋白的表達水平（0.706±0.036）較anti-miR-19b-3p+si-NC組（0.341±0.072）上調(diào)（P＜0.05），而Anti-miR-19b-3p+si-MTUS1組MTC-TT細胞中Bax蛋白的表達水平（0.428±0.072）較anti-miR-19b-3p+si-NC組（0.725±0.037）下調(diào)（P＜0.05，圖5），表明抑制MTUS1表達可恢復抑制miR-19b-3p表達對MTC-TT細胞凋亡的作用。

圖5 抑制MTUS1表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-19b-3p表達對MTC-TT細胞凋亡的作用Fig.5 Inhibition of MTUS1 expression reverses effect of inhibition of miR-19b-3p expression on apoptosis of MTC-TT cells

3 討論

miR-19b-3p在前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤中均高表達，其可能作為腫瘤早期診斷及評估患者預(yù)后的潛在生物標志物［11-12］。Wei等［13］研究表明，苦參堿可通過調(diào)控miR-19b-3p/PTEN軸進而抑制黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展進程。Jin等［14］研究表明，下調(diào)miR-19b-3p可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路抑制乳腺癌細胞增殖并逆轉(zhuǎn)塞卡替尼的抗性。劉磊峰等［15］研究表明，沉默miR-19b-3p表達可上調(diào)亮氨酸重復和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（leucinerich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1）的表達從而誘導喉癌細胞凋亡并增強其放射敏感性。Wei等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌發(fā)生過程中存在miR-19b-3p/Nrp1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miR-19b-3p/Nrp1軸可能成為胃癌診斷和治療的潛在靶點。

本研究檢測MTC組織、癌旁組織及MTC-TT細胞中miR-19b-3p的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-19b-3p的表達水平均顯著升高，體外培養(yǎng)MTCTT細胞并轉(zhuǎn)染anti-miR-19b-3p從而抑制其表達，進一步觀察細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，抑制miR-19b-3p表達可明顯促進MTC細胞凋亡，并可促進Bax、cleaved caspase-3表達及抑制Bcl-2表達。已有研究［17］指出，Bcl-2屬于抗凋亡基因，Bax屬于凋亡基因，Bcl-2可通過調(diào)控線粒體凋亡通路激活caspase-3級聯(lián)反應(yīng)進而促進細胞凋亡。提示下調(diào)miR-19b-3p表達可通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白進而促進MTC細胞凋亡。

綜上所述，MTC中miR-19b-3p、MTUS1的表達異常與細胞凋亡相關(guān)，靶向下調(diào)miR-19b-3p的表達可上調(diào)靶基因MTUS1的表達，通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白進而促進MTC細胞凋亡，其可能作為MTC的潛在治療靶點及MTC的早期診斷分子標志物，但其是否可在臨床上廣泛應(yīng)用仍需臨床實踐證實。