劉廣娜，王嘉辰，李欣諾，黨永康，李海濤，王艷玲

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林 132101；2.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，梧州 543000)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer.)為五加科人參屬多年生草本植物[1]。人參中含有人參皂苷，可以健腦、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等，在人參中起著主要作用[2]。蠐螬為鞘翅目(Coleoptera)金龜甲科(Scarabaeidae)幼蟲的總稱，依靠進(jìn)食土壤中的腐殖物、植物莖葉等維持生存。在生物體處于逆境情況下，即會激發(fā)昆蟲體內(nèi)存在的保護(hù)酶系統(tǒng)，被稱作一個(gè)抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)機(jī)體免受損傷[3]。本研究通過參考譚世強(qiáng)等[4]的載毒葉碟法，將人參根總皂苷作用于田間常見昆蟲蠐螬，運(yùn)用酶標(biāo)儀測定其體內(nèi)保護(hù)酶活性，研究人參皂苷對蠐螬的趨避效果及其體內(nèi)保護(hù)酶活性，為新型植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：3齡蠐螬，用新鮮土豆片飼養(yǎng)，備用。

供試試劑：人參根總皂苷(純度80%)，購于上海源葉生物科技有限公司；1 000 μg·mL-1結(jié)晶牛血清白蛋白、0.15 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH 7.0)、30 μmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉溶液、40 μmol·L-1核黃素溶液、2.25 mmol·L-1氮藍(lán)四唑(NBT)溶液，均購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；CAT、POD、SOD活性測定試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供；曲拉通，購于上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司。

供試儀器：BS-1E恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市良友儀器有限公司；Hitachi×CT15E高速冷凍離心機(jī)，上海妙生科貿(mào)有限公司；Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；Top Pette移液器，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 趨避試驗(yàn) 參考譚世強(qiáng)等[4]載毒葉碟法，進(jìn)行選擇性拒食趨避試驗(yàn)。用1‰曲拉通將人參根總皂苷濃度分別配制成0、5、10、20、30、60 mg·mL-1，依次設(shè)為CK(對照)、T1、T2、T3、T4、T5。將土豆切片后，溶液浸泡3 s，取出，自然晾干，放于襯有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿1片處理、1片對照(CK)，設(shè)置3次重復(fù)。向每個(gè)培養(yǎng)皿中接3齡饑餓處理6 h的蠐螬20頭，用黑膜封住皿口，扎若干小孔，室溫避光飼養(yǎng)。于24、48 h后分別統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中兩側(cè)蠐螬數(shù)目，并計(jì)算選擇性趨避率[5]。

選擇性趨避率(%)=(C-T)/(C+T)×100。

式中，C為對照中蠐螬的數(shù)目，T為處理中蠐螬的數(shù)目。

1.2.2 試蟲試驗(yàn) 釆用載毒葉碟法[4]。具體步驟同1.2.1趨避試驗(yàn)，不同之處為處理和對照不放于相同培養(yǎng)皿中，而是每個(gè)處理中僅含有處理的土豆片，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 酶源的制備 將處理24 h和48 h后的蠐螬取出，解剖取腸，用相應(yīng)的酶提取液提取酶液，即為酶源，用于蛋白質(zhì)含量及酶活力測定[6]。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定[7](1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取1.5 mL離心管6支，按表1操作，搖勻，得到不同濃度的牛血清白蛋白稀釋液。

表1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制加液含量

在96孔酶標(biāo)板中，每孔依次加入上述稀釋蛋白液5 μL(板中重復(fù)3次)，再加入200 μL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，放置5 min，在595 nm處測定OD值。以吸光度A 595 nm為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1。

由圖1可知，回歸方程為y=0.000 3x+0.230 2，R2=0.990 6，將所測吸光度值的平均值作為y值，代入方程，可求出相應(yīng)的x值，即為蛋白質(zhì)濃度(μg·mL-1)。

(2)酶液蛋白質(zhì)含量的測定。加樣方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同的是對照每個(gè)孔加5 μL蒸餾水，樣品每個(gè)孔加5 μL酶液。室溫放置5 min，于595 nm處測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶液蛋白質(zhì)濃度(μg·mL-1)。

1.2.5 蠐螬體內(nèi)保護(hù)酶活性測定 過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)三種保護(hù)酶活性測定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2017和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度人參根總皂苷對蠐螬趨避作用的影響

不同濃度人參根總皂苷對蠐螬趨避作用的影響見圖2。由圖2可知，不同濃度人參根總皂苷對3齡蠐螬作用48 h的選擇性趨避率明顯大于24 h趨避效果。人參根總皂苷的濃度為20 mg·mL-1處理48 h時(shí)趨避率達(dá)到最大值，為81.82%。表明人參根總皂苷對3齡蠐螬有明顯的趨避作用，而且隨著時(shí)間的推移，人參根總皂苷對蠐螬的趨避作用增強(qiáng)。

2.2 不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響

不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的影響見圖3。

由圖3可知，不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)CAT酶活性處理48 h抑制效果弱于24 h；人參根總皂苷的濃度為30 mg·mL-1處理24 h時(shí)，CAT活性達(dá)到最低值。經(jīng)過方差分析可知，處理24 h，不同濃度人參根總皂苷存在顯著性差異，多重比較結(jié)果見表2所示。

表2 不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)CAT活性的影響(24 h)

由表2可知，處理24 h，CK、T4處理與其它處理蠐螬體內(nèi)CAT活性存在顯著性差異，T1處理與T2、T5處理差異顯著，T2、T3處理和T5處理差異不顯著，T1和T3處理差異不顯著。結(jié)果表明，人參根總皂苷濃度為30 mg·mL-1處理24 h，可有效抑制蠐螬體內(nèi)的CAT活性。

2.3 不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)過氧化物酶(POD)活性的影響

不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)過氧化物酶(POD)活性的影響見圖4。由圖4可知，不同濃度人參根總皂苷處理處理24 h，各處理POD活性均明顯低于對照，且在人參根總皂苷濃度為10 mg·mL-1時(shí)，蠐螬體內(nèi)POD活性最低。經(jīng)過方差分析可知，處理24 h，不同濃度人參根總皂苷存在顯著性差異，多重比較結(jié)果見表3所示。

表3 不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)POD活性的影響(24 h)

由表3可知，處理24 h，CK、T1、T2處理與其它各濃度處理存在顯著性差異；T3處理與T4、T5處理無顯著性差異，T4處理與T5處理間無顯著性差異。結(jié)果表明，人參根總皂苷濃度為10 mg·mL-1處理24 h，對蠐螬體內(nèi)POD活性抑制效果最佳。

2.4 不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

不同濃度人參根總皂苷對蠐螬體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響見圖5。由圖5可知，不同濃度人參根總皂苷處理24 h，蠐螬體內(nèi)SOD活性均低于對照，且濃度為10 mg·mL-1時(shí)活性最低；而處理48 h，蠐螬體內(nèi)SOD活性抑制作用趨勢不是很有規(guī)律。經(jīng)過方差分析可知，處理24 h，不同濃度人參根總皂苷存在顯著性差異，多重比較結(jié)果見表4所示。

由表4可知，T2處理與其它各濃度處理均存在顯著性差異，T4處理與T3處理差異顯著，CK與T2、T3存在顯著性差異；而除以上處理外，其它處理差異不顯著。結(jié)果表明，人參根總皂苷濃度為10 mg·mL-1處理24 h，對蠐螬體內(nèi)的SOD活性抑制效果最佳。

3 結(jié)論與討論

本研究通過分析蠐螬食用人參根總皂苷后體內(nèi)的趨避率及保護(hù)酶活性的變化趨勢，結(jié)果表明，人參根總皂苷濃度為20 mg·mL-1時(shí)，處理48 h，選擇性趨避率達(dá)到最大值，為81.82%。抑制CAT、POD、SOD活性的處理時(shí)間均為24 h，而人參根總皂苷濃度分別為30、10 mg·mL-1和10 mg·mL-1。表明了人參根總皂苷很好抑制了蠐螬體內(nèi)保護(hù)酶活性。

綜上所述，人參根總皂苷可以有效趨避蠐螬并降低其體內(nèi)的保護(hù)酶活性，從而抑制蠐螬對植株的破壞力和生存活力。鑒于實(shí)踐成本、發(fā)揮藥效時(shí)間等方面考慮，建議人參根總皂苷使用濃度為10 mg·mL-1，處理24 h防治蠐螬。本研究結(jié)果可為化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥、種植模式等方式綜合防治蠐螬提供參考依據(jù)[8-10]。