張潤婧，陳玉潔，蔡 超，陳 震，劉河洲

(上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 金屬基復(fù)合材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240)

1 前 言

組織損傷或缺失嚴(yán)重影響著人類的健康狀況。人體許多重要組織的自我修復(fù)能力有限，如軟骨組織作為一種無血管組織，由于缺乏血液供應(yīng)，從而很難進(jìn)行自身修復(fù)[1, 2]。組織工程技術(shù)能有效幫助人類組織和器官進(jìn)行修復(fù)，其基本原理為：將細(xì)胞接種至可降解吸收的生物支架上，細(xì)胞可進(jìn)行大量增殖及代謝，同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成新的生物組織，之后將細(xì)胞-支架復(fù)合物移植到組織缺失處進(jìn)行體內(nèi)重構(gòu)，最終達(dá)到修復(fù)或者替代組織的目的[3, 4]。傳統(tǒng)的組織工程支架材料需經(jīng)手術(shù)植入，帶來了操作風(fēng)險(xiǎn)與術(shù)后感染等問題[5]。針對此問題，微創(chuàng)手術(shù)快速發(fā)展，可注射性水凝膠材料是目前微創(chuàng)組織移植的優(yōu)選細(xì)胞載體[6]。水凝膠材料由于具備與人體組織相似的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、高溶脹性以及較好的生物相容性，在細(xì)胞培養(yǎng)、組織修復(fù)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力[7, 8]?？勺⑸渌z可通過注射器注入體內(nèi)特定位置，其微創(chuàng)性可有效減輕患者的痛苦，提高臨床安全性，還可以利用注射器深入人體組織，填充缺損處的不規(guī)則形狀[6, 9, 10]，是當(dāng)前組織工程支架材料的研究熱點(diǎn)。為滿足組織修復(fù)功能及應(yīng)用需求，理想的可注射水凝膠材料應(yīng)滿足以下要求：

(1) 生物安全性?？勺⑸渌z材料作為生物體植入物，其生物安全性是最基本的應(yīng)用前提條件之一。支架材料應(yīng)具有優(yōu)異的生物相容性，植入體內(nèi)后可在合適的速率下完成降解[11, 12]。

(2) 操作便捷性?？勺⑸渌z材料應(yīng)在體外或體內(nèi)的溫和環(huán)境條件下，以合適的凝膠化速率發(fā)生凝膠化轉(zhuǎn)變，以便醫(yī)療人員進(jìn)行注射操作[9, 13]。

(3) 機(jī)械強(qiáng)度。為滿足組織工程應(yīng)用的需求，可注射水凝膠在形成凝膠后應(yīng)該有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和韌性，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的支撐及負(fù)載[14]。

根據(jù)水凝膠中聚合物原料的來源，可將其分為天然高分子水凝膠和化學(xué)合成高分子水凝膠兩大類。多糖材料作為自然界中廣泛存在的重要天然聚合物，可以在酶催化或特定生物體條件下實(shí)現(xiàn)高度降解，其降解產(chǎn)物一般是單糖或者雙糖，不僅具有生物相容性，易被吸收，甚至還可為生命體提供能量[15-17]。因此，多糖類聚合物非常適用于體內(nèi)植入水凝膠材料的制備。目前，天然多糖基可注射水凝膠材料已經(jīng)成為組織工程領(lǐng)域的重要研究主題之一[18-21]。

2 可注射水凝膠的多糖基聚合物原料

天然多糖聚合物原料來源廣泛、安全無毒、化學(xué)結(jié)構(gòu)易修飾，基于天然多糖的水凝膠材料具有高保水性、可再生性、生物降解性、生物相容性、無毒性等特點(diǎn)，適合作為體內(nèi)植入的醫(yī)用材料[22]。多糖種類繁多，由于官能團(tuán)及聚合物鏈長的差異，不同種類多糖材料的性質(zhì)差別很大。近年來，科研人員利用海藻酸鈉、殼聚糖、纖維素和透明質(zhì)酸制備了多種多糖基醫(yī)用可注射水凝膠，取得了大量研究成果[12, 19, 21, 23, 24],上述4種常見天然多糖可注射水凝膠原料的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)總結(jié)于表1。

表1 常見天然多糖可注射水凝膠原料的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

2.1 海藻酸鹽

海藻酸鹽是從植物褐藻中提取出的親水多糖聚合物，是由含有β-1,4-D-甘露糖醛酸的M單元和含有α-1,4-L-古洛糖醛酸的G單元經(jīng)過糖苷鍵連接而成的天然高分子材料。由于海藻酸鹽具有良好的生物相容性、較高的吸水和保水能力及非免疫原性等優(yōu)勢，在組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景[23, 25]。

Yan等[26]以海藻酸鹽為基體，通過鈣離子的原位釋放，并結(jié)合羥基磷灰石(HAP)和明膠微球(GMs)的雙重交聯(lián)，得到可注射及可生物降解的復(fù)合可注射水凝膠。通過成分控制以及體系pH調(diào)節(jié)，制備出的水凝膠支架表現(xiàn)出優(yōu)異的力學(xué)性能與穩(wěn)定性。此外，成骨細(xì)胞包覆培養(yǎng)測試證實(shí)了該凝膠支架在骨組織工程中的潛在應(yīng)用。通過與抗生素結(jié)合使用，凝膠支架展現(xiàn)出對于成骨細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。

然而，由于海藻酸鹽的分子量太大，難以降解，且缺乏與氨基酸、蛋白質(zhì)等反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，這些問題在一定程度上限制了海藻酸鹽作為體內(nèi)移植物的應(yīng)用范圍[27]。為了進(jìn)一步增強(qiáng)海藻酸鹽的實(shí)用性，研究人員對海藻酸鹽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，引入更多的活性基團(tuán)或側(cè)鏈分子[28]，成功拓展了海藻酸鹽在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，利用高碘酸鈉對海藻酸鹽進(jìn)行氧化，可生成具有高化學(xué)活性的醛基結(jié)構(gòu)。基于此原理，Wei等[29]利用N-羧乙基殼聚糖(CEC)和己二酸的動態(tài)反應(yīng)以及氧化海藻酸鈉的醛基結(jié)構(gòu)，開發(fā)出一種基于生物相容性多糖的新型自修復(fù)可注射水凝膠。體系中多種動態(tài)共價(jià)鍵共存的特性賦予該水凝膠優(yōu)異的力學(xué)性能和自修復(fù)能力。此外，該水凝膠還具有良好的細(xì)胞相容性及細(xì)胞釋放能力，在生物工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。Balakrishnan等[30]在硼砂存在的條件下完成氧化海藻酸鹽與明膠的自交聯(lián)，制備出一種快速凝膠的氧化海藻酸鹽基可注射水凝膠。該水凝膠可以與軟骨組織進(jìn)行良好結(jié)合且?guī)缀鯖]有炎癥或應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)。包裹在水凝膠中的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出良好的增殖活性和遷移能力，表明該水凝膠有潛力應(yīng)用于軟骨組織工程的可注射細(xì)胞支架材料。Xu等[20]利用金剛烷修飾硫酸酯化海藻酸鈉(S-Alg-Ad)并完成與3,4-乙二氧基噻吩(EDOT)的氧化聚合，生成生物導(dǎo)電聚合物PEDOT∶S-Alg-Ad，通過聚-β-環(huán)糊精(Pβ-CD)與金剛烷的主客體作用，形成PEDOT∶S-Alg-Ad/Pβ-CD導(dǎo)電可注射水凝膠。高度動態(tài)的主客體作用可促進(jìn)PEDOT納米顆粒在水凝膠中的重排和堆積，PEDOT之間的π-π堆積及PEDOT與硫酸化聚合物的陰離子-π相互作用可以進(jìn)一步穩(wěn)定非共價(jià)網(wǎng)絡(luò)。包覆在此種水凝膠中的C2C12成肌細(xì)胞展現(xiàn)出良好的增殖速率，且利用水凝膠主客體作用的可逆性能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有效釋放；更重要的是，此種導(dǎo)電水凝膠還能顯著促進(jìn)肌管狀結(jié)構(gòu)的形成，有潛力作為可注射生物電極應(yīng)用于基礎(chǔ)細(xì)胞研究及表型藥物篩選等眾多領(lǐng)域。

2.2 殼聚糖

殼聚糖是一種天然堿性多糖，由自然界廣泛存在的甲殼素經(jīng)過脫乙酰作用獲得[31]。殼聚糖具有良好的生物相容性，能被酶解為低分子殼寡糖、葡萄糖胺等無害產(chǎn)物，不會引發(fā)人體組織免疫排斥作用，因此在醫(yī)用注射植入與組織工程領(lǐng)域具有巨大潛力[32]。

Kamoun[33]在不使用傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑的條件下，將兩種多糖衍生物材料——N-琥珀酰殼聚糖與水溶性二醛淀粉進(jìn)行混合，通過席夫堿反應(yīng)制備出了一種新型無毒且可生物降解的多糖基可注射水凝膠材料，且提高N-琥珀酰殼聚糖含量有助于獲得更加致密的水凝膠交聯(lián)結(jié)構(gòu)、更短的膠凝化時(shí)間及更少的水解質(zhì)量損失。經(jīng)體外細(xì)胞黏附性測試可知，N-琥珀酰殼聚糖除能夠提高水凝膠的生物相容性外，還改善了凝膠表面的親水性，從而增強(qiáng)了水凝膠的細(xì)胞黏附性及生物活性。

此外，殼聚糖還具有一定的抑菌作用[34]。Zhao等[35]利用殼聚糖獨(dú)特的抗菌性能，制備出一種具備抗菌、抗氧化能力及電活性的可注射水凝膠。該研究將聚苯胺接枝季胺化殼聚糖(QCSP)與聚乙二醇-聚(甘油-葵二酸)共聚物進(jìn)行混合，在室溫條件下即可發(fā)生動態(tài)化學(xué)鍵交聯(lián)，制備出同時(shí)具備自修復(fù)能力與高傷口黏合力的可注射抗菌水凝膠材料。QCSP中的殼聚糖成分本身具備抗菌能力，并與聚苯胺片段的電活性和抗氧化性產(chǎn)生協(xié)同作用，共同促進(jìn)傷口處的快速愈合。另外，在季銨化殼聚糖聚合物鏈上引入聚苯胺，可降低季銨化殼聚糖的細(xì)胞毒性并提高其抗菌活性[36]。通過調(diào)整聚合物上的活性氨基含量，水凝膠體系可獲得最優(yōu)性能。利用水凝膠的原位成膠方法和組織黏附性能，可以快速填充任意形狀的傷口，并與傷口輪廓進(jìn)行黏合。

殼聚糖與軟骨基質(zhì)中的糖胺聚糖具有非常相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究表明，殼聚糖基支架可幫助軟骨細(xì)胞進(jìn)行增殖[37]。擁有足夠的力學(xué)強(qiáng)度有利于殼聚糖基水凝膠材料在組織工程中獲得更強(qiáng)的實(shí)用性。基于此目的，Latifi等[11]模仿人體軟組織中的膠原纖維結(jié)構(gòu)，制備出具有膠原纖維半互穿網(wǎng)絡(luò)的殼聚糖基仿生可注射水凝膠。I型膠原蛋白與III型膠原蛋白共同存在于人體的許多軟組織中，研究人員受此啟發(fā)，按照人體組織中兩種膠原蛋白的特定比例，將二者共同引入乙二醇-殼聚糖基質(zhì)。經(jīng)生物及力學(xué)測試可知，此種仿生殼聚糖基水凝膠可使細(xì)胞保持良好的存活能力、代謝活性及遷移能力，同時(shí)還具備突出的力學(xué)性能，其綜合性能可以滿足組織工程的基本實(shí)用要求，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 纖維素

纖維素是由葡萄糖連接而形成的線性天然聚合物，廣泛存在于植物、細(xì)菌等生物中，是自然界分布最為廣泛的天然多糖高分子材料[38]，具有天然低毒、易于加工、生物可降解、可再生等優(yōu)良特性[39, 40]。近年來，圍繞纖維素材料作為組織工程領(lǐng)域植入物的研究與應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[24, 41]。

由于纖維素分子鏈上存在大量羥基，易生成分子間氫鍵，從而使纖維素具備出色的化學(xué)穩(wěn)定性及力學(xué)性能，可滿足人體組織的生物力學(xué)要求，因此非常適合作為組織工程中的支架材料[42]。Yang等[43]利用可溶性纖維素衍生物制備出具有高效自修復(fù)能力與雙重環(huán)境響應(yīng)能力的纖維素基可注射水凝膠。他們首先合成了纖維素衍生物羧乙基纖維素接枝二硫代二丙酰肼(CEC-TPH)和二苯甲醛封端聚乙二醇(PEG-DA)，在無毒催化劑4-氨基-DL-苯丙氨酸(4a-Phe)的活化作用下，體系中的酰肼鍵和醛基可形成動態(tài)酰腙鍵。動態(tài)共價(jià)鍵在生理?xiàng)l件下的可逆斷裂重建能力，賦予了水凝膠優(yōu)異的可注射性能及力學(xué)強(qiáng)度?；诶w維素衍生物等原料的低毒性及生物相容性，研究者將成纖維細(xì)胞L929包覆于水凝膠內(nèi)部進(jìn)行三維培養(yǎng)，細(xì)胞可以保持高的細(xì)胞活性和增殖能力，表明該纖維素基可注射水凝膠有望成為組織工程中三維細(xì)胞培養(yǎng)的有效支架材料。為制備同時(shí)具備力學(xué)強(qiáng)度與韌性的纖維素基可注射水凝膠，Zhao等[44]利用羥乙基纖維素、木質(zhì)素磺酸鹽等原料，制備出具有半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠。研究者首先利用化學(xué)交聯(lián)使丙烯酸與木質(zhì)素磺酸鹽發(fā)生自由基聚合，再利用羥乙基纖維素含有的大量羥基進(jìn)行分子間氫鍵交聯(lián)，最終形成水凝膠的半互穿網(wǎng)絡(luò)。此種水凝膠具備突出的力學(xué)性能，可滿足生物體承重組織的力學(xué)性能要求。

為進(jìn)一步拓展纖維素基可注射水凝膠的醫(yī)用功能，Park等[45]利用羧甲基纖維素與殼聚糖之間的靜電作用，制備出可負(fù)載姜黃素微膠囊(Cur-M)的可注射載藥水凝膠(圖1)。陽離子殼聚糖溶液和陰離子羧甲基纖維素通過簡單機(jī)械混合即可發(fā)生靜電交聯(lián)作用，從而形成可在腫瘤內(nèi)注射的載藥水凝膠材料。利用雙注射器將混合溶液注入小鼠體內(nèi)后，由體內(nèi)實(shí)時(shí)成像結(jié)果可知，經(jīng)皮下注射的水凝膠可在生物體內(nèi)快速成型，并在體內(nèi)留存20 d左右。相比于直接注射的藥物，利用多糖基可注射水凝膠包裹的Cur-M可在病變區(qū)域表現(xiàn)出更大的分布范圍，從而印證了該水凝膠體系具備的藥物緩釋效果。

2.4 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸(HA)是一種非硫酸化的陰離子親水糖胺聚糖，存在于人體關(guān)節(jié)軟骨中，可提供潤滑作用并在細(xì)胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用?；谕该髻|(zhì)酸的可注射水凝膠由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性而具有作為組織工程支架的巨大實(shí)用潛力[46, 47]。

基于透明質(zhì)酸在軟骨組織中的分布及重要功能，Palumbo等[48]利用氨基官能化的透明質(zhì)酸衍生物(HA-EDA-C18)與二乙烯基砜官能化的菊粉(INU-DV)制備適合軟骨細(xì)胞增殖的可注射水凝膠支架，在生理環(huán)境下發(fā)生偶氮-邁克爾加成反應(yīng)，制備出對酶水解具有較高抵抗力且具有彈性的可注射水凝膠，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞在HA-EDA-C18/INU-DV水凝膠中培養(yǎng)1 d后便可進(jìn)行有效增殖。為提高視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(RPC)的增殖和分化能力，Tang等[21]利用邁克爾加成反應(yīng)制備出明膠-透明質(zhì)酸凝膠(Gel-HA)，并進(jìn)一步模仿貽貝結(jié)構(gòu)，引入聚多巴胺(PDA)，制備出Gel-HA-PDA凝膠。該工作研究了透明質(zhì)酸基水凝膠對RPC生物學(xué)行為的影響。結(jié)果表明，Gel-HA水凝膠可利用RPC細(xì)胞簇，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而Gel-HA-PDA水凝膠可顯著增強(qiáng)RPC的黏附和遷移能力，并誘導(dǎo)RPC優(yōu)先分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元，從而為視網(wǎng)膜生物醫(yī)學(xué)材料的研究提供了新思路。

考慮到注射型植入材料的實(shí)用性，F(xiàn)eng等[49]針對水凝膠在注入人體后凝膠化速率有待提升的問題，提出了一種載有干細(xì)胞的新型微凝膠的概念。此種微凝膠可以通過微創(chuàng)方式注射到軟骨缺損部位并實(shí)現(xiàn)自組裝，有望應(yīng)用于體內(nèi)的軟骨組織工程修復(fù)領(lǐng)域。該工作首先合成了巰基化的明膠(Gel-SH)和乙烯基磺化的透明質(zhì)酸(HA-VS)，然后基于液滴微流控方法，將Gel-SH、HA-VS和骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)混合，利用快速有效的硫醇-邁克爾加成反應(yīng)，在20 s內(nèi)即可完成快速凝膠，生成富含干細(xì)胞的明膠-透明質(zhì)酸微凝膠(Gel-HA)。Gel-HA微凝膠提供的優(yōu)異微環(huán)境促進(jìn)了細(xì)胞的迅速增殖，還能通過細(xì)胞間的相互連接，誘導(dǎo)微凝膠自組裝成類似于軟骨組織的大孔支架，促進(jìn)了物質(zhì)運(yùn)輸及軟骨修復(fù)。Gel-HA可注射微凝膠的概念及其簡單有效的合成方法，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)材料提供了全新的設(shè)計(jì)思路。

3 可注射水凝膠的設(shè)計(jì)方法

根據(jù)可注射水凝膠的設(shè)計(jì)及制備機(jī)理，可將可注射水凝膠主要分為基于物理交聯(lián)的可注射水凝膠與基于化學(xué)交聯(lián)的可注射水凝膠。各類可注射水凝膠的設(shè)計(jì)方法總結(jié)如圖2所示。

3.1 基于物理交聯(lián)的可注射水凝膠

利用物理交聯(lián)方法形成的可注射水凝膠主要依靠聚合物的分子間弱相互作用力形成聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，如氫鍵、靜電相互作用、主客體相互作用等[45, 50, 51]。此類材料在注射前呈流動性液體狀態(tài)，一旦注入人體，即可利用溫度、pH等物理?xiàng)l件的變化，在生理?xiàng)l件下迅速完成溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，無需任何化學(xué)引發(fā)劑。

溫度敏感性可注射水凝膠是指，環(huán)境溫度的變化可以影響水凝膠網(wǎng)絡(luò)中聚合物鏈之間的親疏水性及氫鍵的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)凝膠化轉(zhuǎn)變。溫度敏感性可注射水凝膠存在一個(gè)最低臨界溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，當(dāng)環(huán)境溫度低于這一溫度時(shí),聚合物分子鏈上的親水基與水分子通過氫鍵作用進(jìn)行連接，體系呈溶膠狀態(tài)；當(dāng)注入人體后，溫度升至最低臨界溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度以上,疏水作用成為主要作用力,高分子鏈通過疏水作用互相聚集，聚合物從優(yōu)先聚合物-水的相互作用狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先聚合物-聚合物的相互作用狀態(tài)，從而發(fā)生凝膠化相變(圖3)[9, 52]。利用天然多糖制備的溫敏性材料具有良好的生物相容性及簡便的凝膠條件，適用于醫(yī)用可注射水凝膠領(lǐng)域[50, 53]。

圖3 溫度敏感性可注射水凝膠示意圖，Tgel代表最低臨界溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度[9]Fig.3 Schematic presentation of a thermo-gelling injectable hydrogel system, Tgel is the sol-gel transition temperature[9]

Tan等[54]通過將具有單個(gè)羧基的聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM-COOH)利用酰胺鍵，接枝到胺化后的海藻酸酯(AAlg)上，合成了一種溫敏梳狀共聚物可注射水凝膠，在人體溫度下可發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)是一種具有最低臨界溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的典型溫敏材料。在低溫條件下，水凝膠中的親水基團(tuán)幫助聚合物分子與水分子產(chǎn)生強(qiáng)相互作用，從而具有良好的溶解性；當(dāng)溫度上升時(shí)，分子鏈上的正電荷靜電作用及化學(xué)反應(yīng)活性增強(qiáng)，分子間氫鍵作用增強(qiáng)，從而脫去水分子而交聯(lián)形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)。此外，通過體外降解研究表明，基于海藻酸衍生物等對PNIPAM的修飾，該水凝膠表現(xiàn)出可降解性能。同時(shí)，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明該熱敏梳狀可注射水凝膠具有一定的生物相容性并能刺激細(xì)胞增殖。

利用pH變化實(shí)現(xiàn)凝膠化也是制備可注射水凝膠的重要方法。pH敏感性可注射水凝膠體系中通常含有高分子聚電解質(zhì)，即聚合物鏈上有大量可以接受或釋放質(zhì)子的可電離基團(tuán)。當(dāng)pH變化時(shí)，聚電解質(zhì)中原本不帶電荷的酸堿度響應(yīng)基團(tuán)會發(fā)生電離而帶電，相同電荷產(chǎn)生的靜電排斥力將影響聚合物鏈間及其與水分子間的氫鍵作用，導(dǎo)致聚合物鏈的親疏水能力發(fā)生變化，從而發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變[55]。

Zhao等[56]制備出一種以殼聚糖衍生物為基體的pH響應(yīng)可注射納米復(fù)合水凝膠，有望用于骨組織再生的理想支架材料。他們將羧甲基殼聚糖(CMCh)和無定形磷酸鈣(ACP)進(jìn)行復(fù)合，利用材料表面的可電離基團(tuán)，通過調(diào)節(jié)體系的pH值，實(shí)現(xiàn)納米顆粒的靜電自組裝，從而完成凝膠化反應(yīng)。在人體生理?xiàng)l件(pH=7.4)下，可形成穩(wěn)定的固態(tài)水凝膠(圖4)。該研究制備出的CMCh-ACP水凝膠具有出色的生物相容性，有助于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和細(xì)胞黏附。成骨分化實(shí)驗(yàn)證明，CMCh-ACP水凝膠還具有骨誘導(dǎo)作用，能提升體內(nèi)骨組織形成的效率。因此，此種pH響應(yīng)的CMCh-ACP可注射水凝膠有望被進(jìn)一步開發(fā)為骨組織再生生物支架。

圖4 采用羧甲基殼聚糖(CMCh)和無定形磷酸鈣(ACP)制備的具有pH敏感性的CMCh-ACP可注射水凝膠：(a)在pH=7.0和pH=7.5條件下的樣品瓶傾倒實(shí)驗(yàn); (b)pH為7.5時(shí)，水凝膠在樣品瓶底部形成穩(wěn)定凝膠；(c)CMCh-ACP水凝膠制備完成4和36 h后，通過注射器針頭的可注射能力[56]Fig.4 pH sensitive carboxymethyl chitosan-amorphous calcium phosphate(CMCh-ACP)hybrid gels：(a) Vial-inversion tests of CMCh-ACP hybrid gels at pH 7.0 and pH 7.5; (b) At pH 7.5, the gel remains at the bottom of the vial; (c) Injectability of CMCh-ACP gel (at pH 7.5) through medical syringes with needle after 4 and 36 h preparation[56]

3.2 基于化學(xué)交聯(lián)的可注射水凝膠

利用化學(xué)交聯(lián)方法形成可注射水凝膠，其交聯(lián)機(jī)理為利用化學(xué)聚合反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)共價(jià)鍵，因而可形成更加穩(wěn)定的共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。此類水凝膠中的聚合物分子鏈一般含有多種活性官能團(tuán)，常見的交聯(lián)反應(yīng)包括：席夫堿反應(yīng)、邁克爾加成反應(yīng)、點(diǎn)擊化學(xué)及光熱引發(fā)的交聯(lián)反應(yīng)等[29, 48, 49]。

光聚合方法是制備化學(xué)交聯(lián)可注射水凝膠的重要方法。水凝膠的前驅(qū)體溶液在注射完成后，經(jīng)可見光或紫外光的照射即可發(fā)生聚合[12]，從而在體內(nèi)形成水凝膠，因此可以較好地控制凝膠化時(shí)間和位置。

Babo等[46]制備出一種基于透明質(zhì)酸的可注射水凝膠，用于牙周缺損組織的修復(fù)。此種可注射體系基于甲基丙烯酸化的透明質(zhì)酸(me-HA)，加入具有抗菌能力的血小板裂解液(PL)，在紫外照射條件下，利用光引發(fā)劑Irgacure 2959中的活性羥基即可完成光聚合反應(yīng)，形成可注射水凝膠。經(jīng)降解實(shí)驗(yàn)可知，加入PL的透明質(zhì)酸可注射水凝膠能夠增強(qiáng)水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促進(jìn)生長因子等活性物質(zhì)的有效傳遞，從而有望增強(qiáng)牙周組織的修復(fù)和再生能力。

然而，需要光照條件的凝膠化方法會對實(shí)際操作造成一定的不便。因此，無需外界刺激的化學(xué)交聯(lián)方法引發(fā)了研究者的關(guān)注。席夫堿反應(yīng)是利用羰基化合物與氨基化合物生成可逆亞胺鍵的化學(xué)縮合反應(yīng)[57]。由于席夫堿反應(yīng)條件溫和，且無需添加引發(fā)劑或交聯(lián)劑，因此被廣泛用于組織工程生物材料的研究。Qu等[58]利用動態(tài)席夫堿反應(yīng)，制備出基于水溶性殼聚糖的自修復(fù)可注射水凝膠。研究者將CEC及苯甲醛修飾的聚乙二醇(PEGDA)溶液進(jìn)行混合，CEC分子鏈上的氨基與PEGDA的苯甲醛基團(tuán)可發(fā)生席夫堿反應(yīng)，交聯(lián)形成水凝膠。當(dāng)水凝膠受到巨大剪切力時(shí)，水凝膠中的可逆共價(jià)鍵因外力破壞而發(fā)生斷裂；當(dāng)外力撤除后，動態(tài)席夫堿亞胺鍵可以再次形成，從而實(shí)現(xiàn)動態(tài)斷裂-重建的過程。因此，此種水凝膠可以順利通過注射器針頭。研究者利用大鼠體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了水凝膠的體內(nèi)可注射性。隨后，還使用成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，結(jié)果表明此種可注射水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性。

同席夫堿反應(yīng)一樣，邁克爾加成反應(yīng)也能夠在人體生理環(huán)境中進(jìn)行，且反應(yīng)時(shí)間可控[59]，因而成為另一種制備醫(yī)用可注射水凝膠的重要方法。Fiorica等[60]利用兩種透明質(zhì)酸衍生物的原位聚合制備可注射水凝膠，該水凝膠有望用于關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療。在這項(xiàng)工作中，研究者利用透明質(zhì)酸的氨基衍生物(HA-EDA)及其α-彈性蛋白的接枝共聚物(HA-EDA-g-α-elastin)與二乙烯基砜衍生化的α，β-聚(N-2-羥乙基)-DL-天冬酰胺進(jìn)行反應(yīng)，原料中的氨基與乙烯基可在生理?xiàng)l件下發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，制備出基于透明質(zhì)酸的可注射水凝膠。該水凝膠展現(xiàn)出良好的溶脹性及可降解能力，同時(shí)與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有良好的相容性，滿足了其作為可注射水凝膠支架以治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的基本要求。

由于有效的化學(xué)鍵合與溫和的生物反應(yīng)條件，酶促交聯(lián)和Diels-Alder(DA)點(diǎn)擊化學(xué)在水凝膠形成中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。Yu等[61]同時(shí)利用上述兩個(gè)交聯(lián)過程，成功地制備出可注射的透明質(zhì)酸/PEG水凝膠。酶促交聯(lián)使HA/PEG在5 min內(nèi)快速凝膠化，形成可注射的凝膠。DA反應(yīng)交聯(lián)使得水凝膠具有優(yōu)異的形狀記憶和抗疲勞性能。此外，包裹在水凝膠中的小鼠胚胎瘤細(xì)胞ATDC-5細(xì)胞表現(xiàn)出良好的代謝活力和增殖能力。綜合結(jié)果表明，結(jié)合兩個(gè)化學(xué)交聯(lián)過程形成的HA/PEG可注射水凝膠在軟骨組織工程中具有巨大的潛力。

4 可注射水凝膠的組織工程功能化發(fā)展

4.1 力學(xué)性能可媲美天然組織的可注射水凝膠

相比于合成高分子水凝膠，天然多糖基水凝膠具備更好的生物相容性，增強(qiáng)了組織工程應(yīng)用中的安全性。然而，多數(shù)天然聚合物的力學(xué)強(qiáng)度較低，無法滿足軟骨組織等承力部位的使用要求，因而其使用范圍受到限制[12, 62]。針對水凝膠材料的增韌策略，F(xiàn)u等[63]利用鈣離子交聯(lián)的海藻酸鹽網(wǎng)絡(luò)以及乙烯基改性熒光粉(YAG∶Ce-VTES)交聯(lián)的聚丙烯酰胺(PAAm)網(wǎng)絡(luò)，成功構(gòu)建出分子鏈纏結(jié)、互穿的差異性雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(double network，DN)，顯著提升了水凝膠的力學(xué)性能，此種海藻酸鹽/聚丙烯酰胺雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠顯示出良好的延伸性和韌性，斷裂伸長率高達(dá)600%，壓縮強(qiáng)度高達(dá)3.6 MPa。針對組織工程生物材料，F(xiàn)u等[64]提出，組織工程材料需具備足夠的強(qiáng)度及韌性，以匹配所修復(fù)組織的力學(xué)性能，從而獲得更加廣泛的應(yīng)用。因此，制備力學(xué)性能可與天然組織相媲美的可注射水凝膠材料是組織工程移植物的重要挑戰(zhàn)。為制備多糖基高強(qiáng)度可注射水凝膠，You等[65]將季銨化纖維素與陽離子纖維素納米晶體相結(jié)合，制備出納米復(fù)合水凝膠材料，成功將水凝膠的力學(xué)性能提升了兩個(gè)數(shù)量級。體外毒性及動物體內(nèi)測試表明該水凝膠具備良好的生物相容性。Pérez-Madrigal等[66]選用了兩種天然多糖基聚合物——透明質(zhì)酸與海藻酸，制備出具有出色力學(xué)性能的可注射水凝膠。研究者首先將透明質(zhì)酸進(jìn)行巰基化修飾，并與炔基封端的聚乙二醇發(fā)生簡單高效的硫醇-炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，形成水凝膠的第一層剛性網(wǎng)絡(luò)，之后繼續(xù)引入由物理交聯(lián)形成的鈣離子-海藻酸鹽，作為第二層柔性疏松網(wǎng)絡(luò)。該工作利用雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的互穿及能量耗散機(jī)理[67]，成功制備出具有優(yōu)異力學(xué)強(qiáng)度及足夠剛度的可注射水凝膠。由于存在雙重多糖基網(wǎng)絡(luò)，此種水凝膠具有良好的生物相容性，且機(jī)械強(qiáng)度具有長期穩(wěn)定性，有較大潛力成為組織工程三維支架，以支持和促進(jìn)骨組織的再生。Rodell等[68]將透明質(zhì)酸進(jìn)行功能化修飾，利用串聯(lián)超分子作用與化學(xué)共價(jià)鍵兩種交聯(lián)策略，制備了一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。他們以β-環(huán)糊精作為主體，金剛烷作為客體，利用酯化及酰胺化反應(yīng)將主客體偶聯(lián)至透明質(zhì)酸分子鏈，之后利用甲基丙烯酸鹽和二硫蘇糖醇的共價(jià)交聯(lián)形成雙層凝膠網(wǎng)絡(luò)。雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)大大提升了水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度，主客體作用賦予水凝膠自修復(fù)及可注射性。經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)可知，細(xì)胞可在水凝膠內(nèi)部維持兩周以上的代謝活性。此種天然多糖基雙網(wǎng)絡(luò)可注射水凝膠由于具有獨(dú)特的力學(xué)性能與生物相容性，在組織工程支架領(lǐng)域具有良好前景。

4.2 利用3D打印實(shí)現(xiàn)形狀定制

為克服傳統(tǒng)組織工程材料形狀與組織損傷處不匹配、立體結(jié)構(gòu)內(nèi)部區(qū)域難以調(diào)整等問題[69]，生物3D打印技術(shù)吸引了研究人員的關(guān)注。用于組織工程領(lǐng)域的3D打印技術(shù)以仿生為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的組織或器官結(jié)構(gòu)數(shù)字化模型，將生物墨水材料經(jīng)小口徑打印噴頭擠出，通過精準(zhǔn)堆疊，制備出具有特定形狀的三維實(shí)體[70]。理想的生物打印墨水材料應(yīng)滿足安全低毒、力學(xué)穩(wěn)定等要求，且應(yīng)具備合適的粘度，在打印過程中不會堵塞噴頭。另外，能夠負(fù)載細(xì)胞的生物墨水可幫助構(gòu)建3D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)所需材料的快速批量化生產(chǎn)，為細(xì)胞生長提供支撐作用，以促進(jìn)組織形成，同時(shí)還可與缺損處結(jié)構(gòu)相匹配(圖5)[71]。水凝膠材料具有大量親水基團(tuán)及類似于細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部水合通道及交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可為細(xì)胞提供適宜的包覆條件。因此，具備剪切擠出能力的可注射水凝膠成為優(yōu)選的生物3D打印墨水材料[72, 73]。相比于合成水凝膠，天然多糖基可注射水凝膠在力學(xué)強(qiáng)度與可控性方面尚有不足，然而具備了合成水凝膠難以比肩的生物相容性及生物可降解性，非常適合用作生物3D打印的墨水材料[74]。近年來，研究人員圍繞天然多糖基可注射水凝膠在生物打印中的應(yīng)用展開了一系列研究[75, 76]。

圖5 3D打印仿生人耳[71]Fig.5 Image of the 3D printed bionic ear[71]

Müller等[77]以能夠促進(jìn)有絲分裂的海藻酸鹽硫酸鹽水凝膠體系為基礎(chǔ)，引入具有良好打印能力的納米纖維素，通過兩種多糖材料的結(jié)合，成功制備出可進(jìn)行3D打印的生物墨水。研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生物性能與打印噴嘴的形狀密切相關(guān)，以最低的擠出壓力與剪切應(yīng)力打印此種多糖基生物墨水時(shí)，可保持良好的細(xì)胞鋪展性。Heo等[78]利用海藻酸鈉與成骨多肽制備出一種可促進(jìn)骨組織再生的新型3D打印生物墨水，體內(nèi)和體外測試表明，這種生物墨水可為細(xì)胞增殖提供理想的穩(wěn)定環(huán)境。為模擬生物組織的電生理環(huán)境，Shin等[75]利用微流體技術(shù)制備了透明質(zhì)酸微凝膠，通過原位金屬還原提高了材料的電導(dǎo)率，并進(jìn)一步將微凝膠組裝為含金屬-酚配位網(wǎng)絡(luò)的可注射粒狀水凝膠。此種粒狀水凝膠具備出色的可注射性及導(dǎo)電性，有望用于可穿戴電活性器件的3D打印及生物組織間電生理環(huán)境的構(gòu)建。

組織工程植入物進(jìn)入人體后，經(jīng)常面臨新生血管數(shù)量不足而導(dǎo)致組織壞死的問題[22]。曾有研究者成功制備出可以控制生成因子傳遞的可注射水凝膠材料，以誘導(dǎo)血管的形成[79]。然而，新血管的生長仍需較長時(shí)間，因而限制了大型組織工程移植體的發(fā)展[80]。3D生物打印不僅可以制備組織工程支架材料，還可用于血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，以維持組織活性并促進(jìn)組織功能的完善[81]。Kuss等[82]利用3D打印技術(shù)，在體外條件下實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸基水凝膠中血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。研究者首先將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞植入經(jīng)化學(xué)修飾的透明質(zhì)酸-明膠復(fù)合水凝膠中，之后，通過3D打印制備出水凝膠/羥基磷灰石復(fù)合多孔支架。通過裸鼠皮下注射實(shí)驗(yàn)可知，水凝膠系統(tǒng)促進(jìn)了與裸鼠血管系統(tǒng)相匹配的心血管網(wǎng)絡(luò)的形成，證明了透明質(zhì)酸基水凝膠在血管化生物打印中的巨大潛力。

5 結(jié) 語

隨著社會老齡化程度的加深及醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，組織工程技術(shù)愈發(fā)成為人體組織修復(fù)的重要手段?？勺⑸湫运z可通過微創(chuàng)方式植入人體，能有效幫助病患減輕痛苦、減少手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，還能深入特定受損位置，填充不規(guī)則形狀，因而在組織修復(fù)及體內(nèi)植入領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。由于具備良好的生物相容性、生物降解性及結(jié)構(gòu)可修飾性，多糖基可注射水凝膠在組織工程中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，并取得大量研究成果。

與此同時(shí)，多糖基可注射水凝膠在組織工程應(yīng)用領(lǐng)域仍存在一些問題亟待解決：

(1) 實(shí)現(xiàn)天然組織的眾多功能是組織工程材料的重要目標(biāo)。目前，單一組分的多糖類可注射水凝膠仍無法兼?zhèn)涮烊唤M織在生物響應(yīng)、生物力學(xué)、物質(zhì)傳輸?shù)缺姸喾矫娴耐暾δ?，因而在?shí)際應(yīng)用中受到一定局限。近期，研究者嘗試?yán)眯Q絲[83]等生物活性材料制備可注射水凝膠，為此領(lǐng)域拓展了新思路。新型生物活性材料的開發(fā)與利用，將有望推動可注射水凝膠的醫(yī)用功能性發(fā)展。

(2) 天然組織的功能機(jī)理研究尚有不足，從而難以確定并模仿功能實(shí)現(xiàn)的核心要素，這在根本上限制了醫(yī)用植入材料生物功能的發(fā)展。今后，多糖基可注射水凝膠的制備工作可與人體組織學(xué)研究相結(jié)合，從生物學(xué)原理出發(fā)，設(shè)計(jì)仿生材料結(jié)構(gòu)與物化性質(zhì)，以拓展其在組織工程中的臨床應(yīng)用。