右美托咪定通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)肝葉切除術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙大鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響*

程亮亮 田毅 譚義文 王丹

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院麻醉科,海南 海口 570208)

術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙(Post-operative neurocognitive dysfunction，PNCD)是老年麻醉手術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，具有記憶受損、認(rèn)知功能異常等表現(xiàn)，影響疾病恢復(fù)進(jìn)程，甚至?xí)l(fā)展為老年癡呆，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前，臨床尚無有效防治PNCD的手段，部分藥物通過減輕全身炎癥或營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)治療效，但果仍不理想[2-3]。臨床研究表明，臨床常用吸入麻醉藥物，如七氟醚、氟烷等，具有誘導(dǎo)迅速、無明顯蓄積、蘇醒快等優(yōu)點(diǎn)，但高濃度藥物仍會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)功能造成損傷，尤其是老齡人群廣泛存在腦組織功能退化，麻醉術(shù)后PNCD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，七氟醚吸入麻醉可能通過激活海馬神經(jīng)元自噬引起海馬神經(jīng)元損傷，具有一定神經(jīng)毒性作用。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)屬于高選擇性α2腎上腺素能受體(α2 adrenergic receptor，α2-AR)激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，常于老年患者麻醉誘導(dǎo)前用藥，以穩(wěn)定誘導(dǎo)過程中血流動(dòng)力學(xué)，輔助全身麻醉[8-9]。近年來，有報(bào)道認(rèn)為DEX可預(yù)防老年非心臟手術(shù)患者術(shù)后PNCD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但具體影響機(jī)制尚不明確[10]。鑒于此，本研究在七氟醚麻醉下采用肝葉部分切除術(shù)建立PNCD大鼠模型，模擬腹腔術(shù)后神經(jīng)功能損傷，觀察不同劑量DEX通過自噬信號(hào)通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)對(duì)老年P(guān)NCD大鼠神經(jīng)功能的影響，為DEX臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090248，規(guī)格2 mL:200 μg，批號(hào)：10081435)，七氟醚(湖北廣奧生物科技有限公司，批號(hào)：6120104)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)：D31145791)，兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)單抗(批號(hào)：ab11362)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)單抗(批號(hào)：ab12054)、磷酸化Akt(phosphorylation of Akt，p-Akt)多抗(批號(hào)：ab37159)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)單抗(批號(hào)：ab60218)、自噬標(biāo)記蛋白Beclin-1(批號(hào)：ab55140)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(light chain 3，LC3，批號(hào)：ab12194)(一抗，美國(guó)Abcam公司)，山羊抗兔PI3K(批號(hào)：ab13446)、Akt(批號(hào)：ab20137)、p-Akt(批號(hào)：)、mTOR(批號(hào)：ab32194)、Beclin-1(批號(hào)：ab01510)、LC3(批號(hào)：ab00120)(二抗，美國(guó)Abcam公司)。

1.2 主要儀器 CM-120型透射電鏡(荷蘭PHILIPS公司)，Morris水迷宮及其配套圖像采集分析系統(tǒng)(北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，3550UV酶標(biāo)儀、7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳儀、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，18月齡，體質(zhì)量(600±100)g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0001，飼養(yǎng)條件：室溫(24±1)℃，60%濕度，12 h/12 h晝夜節(jié)律照明，2只/籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)表法將50只SD大鼠分為5組：對(duì)照組、模型組、DEX低、中、高劑量組5組。模型組吸入3%七氟醚麻醉；DEX低、中、高劑量組分別預(yù)先腹腔注射25、50、100 μg/kg右美托咪定(按照人與動(dòng)物體表面積換算法換算臨床等效劑量為6.3 μg/kg，DEX低、中、高劑量分別約為4倍、8倍、16倍臨床等效劑量)，30 min后3組均吸入3%七氟醚麻醉。各組大鼠麻醉后，參照文獻(xiàn)[11]均進(jìn)行部分肝葉切除術(shù)，建立PNCD大鼠模型，Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比差異顯著，即為建模成功。對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 mL/kg，持續(xù)麻醉2 h(手術(shù)均結(jié)束)。

1.4.2 修正神經(jīng)功能缺損程度(neurological severity score，NSS)評(píng)估 術(shù)后1、3、7 d采用NSS評(píng)分量表[12]對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)估，包括提尾、行走、感覺、平衡、反射5個(gè)試驗(yàn)內(nèi)容，每個(gè)試驗(yàn)評(píng)分3、3、2、6、4分，總分18分，分?jǐn)?shù)越高提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4.3 認(rèn)知功能評(píng)估 采用Morris水迷宮試驗(yàn)[13]對(duì)各組大鼠認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估：水迷宮直徑1.5 m、水深0.75 m、控制水溫(25±1)℃，將水池分為4個(gè)象限，安全島置于第I象限，水下1 cm，宮體正上方攝像頭可記錄運(yùn)動(dòng)軌跡，固定4各入水點(diǎn)和固定實(shí)驗(yàn)時(shí)間。術(shù)后第7 d開始進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1次，實(shí)驗(yàn)分兩部分：①術(shù)后第8～11 d定位巡航試驗(yàn)，隨機(jī)選取某1象限入水點(diǎn)，大鼠面對(duì)宮壁輕放入池，開始計(jì)時(shí)，記錄60 s內(nèi)找到并登陸安全島的時(shí)間，即逃避潛伏期；若60 s內(nèi)未找到安全島，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)大鼠至安全島，并停留30 s，逃避潛伏期記錄為60 s。每個(gè)象限入水1次/d，共入水4次/d，每次間隔2 h。②術(shù)后第12 d進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，撤去安全島，隨機(jī)選擇入水點(diǎn)，記錄60 s內(nèi)的游泳軌跡，統(tǒng)計(jì)目標(biāo)象限游泳距離占比，即大鼠在目標(biāo)象限(第I象限)內(nèi)的游泳距離/總游泳距離×100%。

1.4.4 海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，立即處死各組大鼠，冰凍手術(shù)臺(tái)迅速取出腦組織，取左側(cè)海馬組織，修整為邊長(zhǎng)為1 cm的組織塊，放置于4%戊二醛中固定4 h，然后放置1%鋨酸固定30 min，脫水后樹脂包埋，制作厚度為50 nm切片，進(jìn)一步醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察、拍照，計(jì)數(shù)自噬小體數(shù)目。

1.4.5 海馬PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA檢測(cè) 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠后取部分右側(cè)海馬組織，剪碎后提取組織中取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)含量，逆轉(zhuǎn)錄法獲得互補(bǔ)鏈脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，經(jīng)鑒定后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反應(yīng)體系：Taq酶 11.5 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)。以β-actin為管家基因，2-△△CT為目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，重復(fù)3次取Ct平均值。引物序列，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.6 海馬PI3K、pAkt、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3-II、LC3-I蛋白檢測(cè) 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠后取部分右側(cè)海馬組織，加入液氮研磨，加入細(xì)胞裂解液，沸水浴8～10 min，12000 r/min離心15 min，取上清液，蛋白定量后，取40 μg樣品于上樣緩沖液混勻，沸水浴3 min，再次離心收集上清液，然后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜60 min，加入封閉液搖床2 h(室溫)，洗滌后加入一抗(1∶1000)，搖床孵育過夜(4℃)，洗滌后二抗(1∶8000)，孵育60 min(常溫)，暗室中曝光，并于凝膠成像系統(tǒng)中掃描，進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損程度對(duì)比 術(shù)后50只大鼠均存活。DEX各劑量組NSS評(píng)分術(shù)后3 d、7 d均低于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)；DEX各劑量組術(shù)后NSS評(píng)分均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(P<0.05)，模型組術(shù)后7 d較術(shù)后3 d稍有降低，但較術(shù)后1 d仍較高(P<0.05)，而對(duì)照組無明顯變化，見表2。

表2 NSS評(píng)分對(duì)比Table 2 Comparison of NSS scores

2.2 逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳距離占比對(duì)比 DEX各劑量組術(shù)后9～11 d逃避潛伏期均短于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍長(zhǎng)于較對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組、3劑量組逃避潛伏期隨時(shí)間而縮短(P<0.05)，而模型組無明顯變化。DEX各劑量組目標(biāo)象限游泳距離占比均高于模型組，其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

表3 逃避潛伏期、目標(biāo)象限游泳距離占比對(duì)比Table 3 Comparison of escape latency and target quadrant swimming distance

2.3 海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組未觀察到自噬小體，模型組自噬小體廣泛存在(8.20±0.94)個(gè)/視野，形態(tài)多樣化，可見雙層膜包裹的顆粒狀細(xì)胞質(zhì)或退化細(xì)胞器。DEX各劑量組自噬小體數(shù)量減少，DEX低、中、高劑量組分別為(5.58±0.50)個(gè)/視野、(4.22±0.37)個(gè)/視野、(2.07±0.24)個(gè)/視野；DEX各劑量組自噬小體數(shù)目均少于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍多于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 透射電鏡下海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)圖片(×12 K)Figure 1 Ultrastructural picture of hippocampal neurons under transmission electron microscopy注：Ly.溶酶體；M.線粒體；N.細(xì)胞核；紅色箭頭為自噬小體

2.4 海馬PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA表達(dá)對(duì)比 DEX各劑量組PI3K、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組，其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)；DEX各劑量組Beclin-1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，Akt mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)比Figure 2 Comparison of relative expressions of PI3K,Akt,mTOR,Beclin-1 and LC3 mRNA

2.5 海馬PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)及pAkt/Akt、LC3-II/LC3-I對(duì)比 DEX各劑量組PI3K、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量、pAkt/Akt均高于模型組，其中DEX低劑量組<中劑量組<高劑量組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)；DEX各劑量組Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量、LC3-II/LC3-I均低于模型組，其中DEX低劑量組>中劑量組>高劑量組，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 海馬PI3K、Akt、pAkt、mTOR、Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表達(dá)(n=4，F(xiàn)igure 3 Expressions of PI3K,Akt,pAkt,mTOR,Beclin-1,LC3-I and LC3-II in hippocampus 注：與對(duì)照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與DEX低劑量組比，③P<0.05；DEX中劑量組比，④P<0.05注：與對(duì)照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與DEX低劑量組比，③P<0.05；DEX中劑量組比，④P<0.05

3 討論

中樞神經(jīng)功能損害屬于麻醉手術(shù)后常見并發(fā)癥，臨床多表現(xiàn)為記憶、學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能異常等，可能持續(xù)數(shù)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[16-17]，麻醉及手術(shù)應(yīng)激可引起PNCD，其多能自行恢復(fù)，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)仍會(huì)造成一定損傷。PNCD發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多種蛋白質(zhì)表達(dá)及信號(hào)通路調(diào)控作用，最終可引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡。DEX屬于美托嘧啶的異構(gòu)體，其作用機(jī)制為通過激動(dòng)腦脊髓中α2-AR而發(fā)揮鎮(zhèn)靜、止痛和抗交感作用，且已有研究證實(shí)DEX對(duì)多種腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[18-20]。

水迷宮定位巡航和空間探索實(shí)驗(yàn)可評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能。尋找休息場(chǎng)所是動(dòng)物本能，該過程可反應(yīng)出大鼠對(duì)復(fù)雜信息的采集、整合和學(xué)習(xí)能力，尋找目標(biāo)象限完成度與海馬區(qū)結(jié)構(gòu)和功能、中樞神經(jīng)功能損害等關(guān)系密切[21]。本研究采用麻醉下行部分肝葉切除術(shù)法制備PNCD大鼠模型，模擬臨床剖腹手術(shù)對(duì)機(jī)體神經(jīng)功能的影響，術(shù)后采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，逃避潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組，目標(biāo)象限游泳距離占比短于對(duì)照組，提示麻醉下行部分肝葉切除術(shù)法制備PNCD成功。DEX可有效抑制交感神經(jīng)興奮，激活突觸前膜α2-AR(α1∶α2=1∶1600)[22]，繼而負(fù)反饋抑制突觸后膜興奮，降低交感神經(jīng)興奮性。魏曉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，麻醉前應(yīng)用DEX有助于維持圍術(shù)期血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，降低PNCD發(fā)生率，與本研究結(jié)果相似。本研究對(duì)PNCD大鼠術(shù)前應(yīng)用不同劑量DEX干預(yù)，術(shù)后NSS評(píng)分低于模型組，逃避潛伏期均短于模型組，但仍長(zhǎng)于對(duì)照組，目標(biāo)象限游泳距離占比均高于模型組，但仍低于對(duì)照組，且均具有劑量依賴性，由此可知，DEX對(duì)減輕老年大鼠PNCD神經(jīng)功能損傷有積極意義。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老年大鼠術(shù)后海馬部位常出現(xiàn)萎縮、體積減小現(xiàn)象[24]，進(jìn)一步研究顯示可能與海馬神經(jīng)元死亡有關(guān)。自噬是海馬神經(jīng)元主要死亡形式，本研究中透射電鏡顯示模型組自噬小體廣泛存在，七氟醚麻醉下行肝葉切除術(shù)后大鼠海馬神經(jīng)元確有損傷。自噬屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，Beclin-1、LC3均屬于自噬調(diào)控蛋白，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大、Beclin-1表達(dá)增加均與自噬體形成正相關(guān)[25]。PI3K屬于異源二聚體，Akt是其下游效應(yīng)因子，當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞表面后，PI3K激活，Akt膜轉(zhuǎn)位磷酸化激活，細(xì)胞內(nèi)磷酸化的Akt通過活化下游靶基因發(fā)揮效應(yīng)[26-27]。mTOR屬于細(xì)胞分裂及合成的調(diào)控中心，多種信號(hào)均可通過I型PI3K/Akt傳遞至mTOR啟動(dòng)靶點(diǎn)復(fù)合體1(TORC1)，達(dá)到激活閾值后阻滯細(xì)胞分裂信號(hào)傳遞[28-29]。王建偉等[30]研究顯示，DEX可通過上調(diào)mTOR蛋白、下調(diào)LC3-II蛋白表達(dá)減輕大鼠立體肺缺血再灌注損傷引起的自噬，與本研究結(jié)果相似。本研究中模型組PI3K、mTOR mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量、pAkt/Akt均低于對(duì)照組，Beclin-1 mRNA和蛋白、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量、LC3-II/LC3-I高于對(duì)照組，提示PNCD大鼠海馬組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，自噬相關(guān)基因和蛋白異常高表達(dá)。進(jìn)一步應(yīng)用不同劑量DEX干預(yù)后，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活，自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)被抑制，提示PNCD大鼠存在PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制，使老年大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，但DEX可逆轉(zhuǎn)該信號(hào)通路的抑制作用，從而減輕海馬神經(jīng)元自噬，改善神經(jīng)功能損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，DEX可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路減輕七氟醚麻醉下肝葉切除術(shù)老年大鼠神經(jīng)功能損傷，并抑制海馬神經(jīng)元自噬，可為臨床中應(yīng)用DEX預(yù)防老年人群麻醉術(shù)后神經(jīng)功能損傷提供理論支持，但其是否存在其他調(diào)控通路發(fā)揮作用仍需要進(jìn)一步探討。