山蒼子精油抑制沙門(mén)菌作用機(jī)制研究

李欣越，茍玉虹，申瀚君，李育浩，王 濤，尹立子

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

沙門(mén)菌屬（Salmonella）是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陰性細(xì)菌，可感染人和動(dòng)物引發(fā)菌血癥、敗血癥、胃腸炎等，威脅人和動(dòng)物的健康[1-2]。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）統(tǒng)計(jì)，沙門(mén)菌在美國(guó)每年會(huì)造成135萬(wàn)人感染，26 500人住院，400余人死亡；在全球可造成超過(guò)9 000萬(wàn)人感染和15余萬(wàn)人死亡[3]。因其廣泛存在于肉類(lèi)、乳類(lèi)、蛋類(lèi)、果蔬類(lèi)食品甚至土壤中，故由其引起的感染主要是食源性的[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，從人體和雞肉中分離的沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林等多種抗生素產(chǎn)生了高度耐藥性[5]。因此，尋找沙門(mén)菌的有效防治方法、維護(hù)公共衛(wèi)生已迫在眉睫。

植物精油是從植物的果實(shí)、花、葉、根等中提取得到的揮發(fā)性芳香物質(zhì)，含量低但卻有多種生物活性，近年來(lái)在食品抗菌方面的應(yīng)用研究尤其深入[6-7]。山蒼子精油（Litsea cubeba essential oil，LC-EO）呈淡黃色，由山蒼子果實(shí)中提取得到，且有強(qiáng)烈的檸檬味。山蒼子精油有廣譜抗菌作用，Liu T.等[8]和趙露露等[9]的研究表明，山蒼子精油對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌都有良好的抑菌活性。戴錦銘[10]的研究表明山蒼子精油可以破壞大腸桿菌的細(xì)胞膜、影響其能量代謝、抑制其蛋白質(zhì)合成、減少胞內(nèi)DNA含量等。吳均等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油可以改變金黃色葡萄球菌菌體的通透性、降低其蛋白質(zhì)的利用率。但目前山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌的抑菌機(jī)理方面的研究還很少。本研究旨在從細(xì)胞膜通透性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、可溶性蛋白質(zhì)含量、生物被膜形成等方面探究山蒼子精油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的抑菌機(jī)制。為防治沙門(mén)菌引起的食物中毒、開(kāi)發(fā)以山蒼子精油為基礎(chǔ)的新型藥食同源產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品和菌株

山蒼子精油（純度≥98%，成都瑞芬思公司）用二甲亞砜（成都浩博優(yōu)公司）溶解，配制成質(zhì)量濃度為40.96 mg/mL的母液備用；鼠傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 14028）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑和器材

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、腦心浸出液肉湯（BHI）購(gòu)自杭州微生物試劑公司；PBS磷酸緩沖鹽粉劑、2.5%Gluta固定液、無(wú)水葡萄糖購(gòu)自成都浩博優(yōu)公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、4×雙色蛋白上樣緩沖液、雙色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自成都羅寧生物公司。

UV-2000型紫外分光光度計(jì)（UNICO，美國(guó)）、ZD-85A氣浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器公司，中國(guó)）、DDS-307電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器公司，中國(guó)）、全功能凝膠成像系統(tǒng)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生長(zhǎng)的影響

采用二倍稀釋法測(cè)定山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌的MIC，設(shè)立只加菌液的陽(yáng)性對(duì)照組，只加山蒼子精油的陰性對(duì)照組，只加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，37℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后，用肉眼進(jìn)行觀(guān)測(cè)，所有透明且澄清的試管中，含最小的山蒼子精油濃度的試管所設(shè)定的濃度值，即為MIC[12]。采用平板畫(huà)線(xiàn)法測(cè)定MBC，從MIC試驗(yàn)中所有澄清的試管中吸取0.1 mL均勻涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后觀(guān)察計(jì)數(shù)，以5個(gè)以下菌落的培養(yǎng)基所對(duì)應(yīng)的山蒼子精油濃度為MBC[13]。

吸取80 μL過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)菌菌液于30 mL BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600=0.3時(shí)，加入山蒼子精油，并使其質(zhì)量濃度為 0、32、64、128、256 和512 μg/mL，振蕩培養(yǎng)。并在第 0、1、2、4、6、8、16、24 h測(cè)定其OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.2 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌電導(dǎo)率的影響

參考F.Bendali等[14]的方法，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的沙門(mén)菌液1 mL接種于50 mL TSB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)16 h后，加入山蒼子精油使其質(zhì)量濃度等于2 MIC，對(duì)照組加入同體積的DMSO。37℃恒溫培養(yǎng)，在第0、1、2、4、6和 8h時(shí)，分別取5 mL菌液，4500r/min離心10 min，取適量上層澄清液體，將其按1∶40比例與5%的無(wú)菌葡萄糖溶液混合，用電導(dǎo)率儀測(cè)定混合溶液的電導(dǎo)率。

1.3.3 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞膜電位的影響

呂：當(dāng)然，你的《德克薩斯》的價(jià)值除了展現(xiàn)戰(zhàn)爭(zhēng)跳動(dòng)的旋律和令人窒息的危險(xiǎn)，在表述戰(zhàn)爭(zhēng)的慣性恐怖感受和作戰(zhàn)的超現(xiàn)實(shí)主義方面成功外，啟示人們用另一種眼光來(lái)審視世界的，給讀者更大闡釋空間的是你對(duì)處在戰(zhàn)爭(zhēng)這一非常態(tài)下的情愛(ài)的描寫(xiě)，對(duì)非常態(tài)的情愛(ài)的這種人文關(guān)懷同樣令我癡迷。特別想聽(tīng)聽(tīng)你自己是如何詮釋小說(shuō)中蘇珊與克洛特·蓋博之間的情愛(ài)的。

參考楊磊等[15]的方法，將沙門(mén)菌于MH培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5～0.6后，取適量菌液，3 000 r/min離心10 min，舍棄上層澄清液體，用5 mmol/L含葡萄糖的HEPES緩沖液洗滌沉淀并將其稀釋至OD600=0.05左右。向適量稀釋后的菌液中加入0.4 mmol/L DISC3（5）工作液并使其最終濃度為 0.8 μmol/L，在室溫下避光振蕩1.5 h后，加入4 mol/L KCL工作液并使其最終濃度為100 mmol/L，在室溫下避光振蕩0.5 h。取200 μL制備的菌液，在避光處迅速加入山蒼子精油并使其最終濃度為 0、64、128、256、512 μg/mL，激發(fā)光622 nm、發(fā)射光670 nm條件下，間隔5 min，時(shí)長(zhǎng)30 min，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.3.4 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

將沙門(mén)菌在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入山蒼子精油使其濃度等于2 MIC，對(duì)照組加入同體積的DMSO，振蕩培養(yǎng)。分別在第12、16、24 h時(shí)取適量菌液，4 500 r/min離心10 min，保留沉淀并用PBS緩沖液洗滌2次，用Gluta固定液固定，12、16 h樣品經(jīng)脫水、浸透、包埋、修塊、切片、染色處理，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[16]；24 h樣品經(jīng)脫水、干燥、鍍金后在掃描電鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[17]。

1.3.5 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌可溶性蛋白的影響

按探究山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響樣品制備步驟，用PBS緩沖液洗滌下層菌體沉淀3次并定容至1 mL。將定容后的菌液超聲破碎后，6 000 r/min離心10 min，取適量上層清液，用BCA蛋白試劑盒測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量。將上清液與蛋白上樣緩沖液按3∶1體積比混合，高溫變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，經(jīng)染色、脫色、成像后觀(guān)察蛋白質(zhì)電泳結(jié)果[18]。

1.3.6 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜形成的影響

向5個(gè)TSB培養(yǎng)基中加入山蒼子精油并使其濃度為 0、8、16、32、64 μg/mL，將沙門(mén)菌振蕩培養(yǎng)至OD600=0.2后，取10 μL菌懸液于96孔板中，每孔再加290 μL含蔗糖和對(duì)應(yīng)濃度山蒼子精油的TSB培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)48～72 h。移除96孔板中混合溶液，加入10 μL 10%甲醛溶液并室溫培養(yǎng)過(guò)夜，移除甲醛溶液，加入100 μL 0.1%的結(jié)晶紫并在室溫放置30 min，移除結(jié)晶紫，用雙蒸水小心沖洗孔板，加入200 μL 33%乙酸溶液后，用酶標(biāo)儀測(cè)OD570值[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生長(zhǎng)的影響

圖1 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Figure 1 The growth curve of LC-EO against Salmonella

2.2 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌電導(dǎo)率的影響

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)的無(wú)機(jī)鹽等會(huì)滲透過(guò)細(xì)胞膜到細(xì)胞外，從而引起菌液電導(dǎo)率的增加[20]。據(jù)此原理，本實(shí)驗(yàn)對(duì)加入2 MIC濃度的山蒼子精油的鼠傷寒沙門(mén)菌液電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定。據(jù)圖2，與0 h的數(shù)據(jù)相比，菌懸液培養(yǎng)1 h的電導(dǎo)率為（8.39±0.50）%（P＜0.01）；培養(yǎng) 2 h的電導(dǎo)率為（9.82±0.49）%（P＜0.01）；培養(yǎng) 8 h 的電導(dǎo)率為（8.39±0.37）%（P＜0.01）。而加入 DMSO 的菌液的電導(dǎo)率基本不變。由此可看出，山蒼子精油可迅速且顯著地改變沙門(mén)菌細(xì)胞膜的通透性。

圖2 2 MIC的山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌菌懸液電導(dǎo)率的影響Figure 2 Effect of 2 MIC LC-EO on conductivity of Salmonella suspension

2.3 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞膜電位的影響

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜破損或發(fā)生去極化時(shí)，DISC3（5）熒光探針可進(jìn)入細(xì)胞水相溶液發(fā)出可檢測(cè)熒光，引起熒光值變化[15]。據(jù)圖3，與未加入山蒼子精油的對(duì)照組相比，加有山蒼子精油的沙門(mén)菌的熒光強(qiáng)度均增大，且呈濃度依賴(lài)性。在30 min內(nèi)，加有山蒼子精油的沙門(mén)菌熒光強(qiáng)度總體略呈增加趨勢(shì)，而對(duì)照組率呈降低趨勢(shì)。表明山蒼子精油使沙門(mén)菌細(xì)胞膜發(fā)生了破損，改變了其通透性。

圖3 不同濃度的山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞膜電位的影響Figure 3 Effect of different mass concentration LC-EO on membrane potential of Salmonella

2.4 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

據(jù)圖4，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、邊界清晰，胞內(nèi)染色質(zhì)和生物被膜豐富。而經(jīng)山蒼子精油處理的菌體，在透射電鏡下觀(guān)察到細(xì)胞變形，細(xì)胞膜皺縮、破損甚至溶解，從而使細(xì)胞內(nèi)容物流出，胞質(zhì)減少而染色變淺，且出現(xiàn)大量空泡化；在掃描電鏡下觀(guān)察到細(xì)胞膜塌陷，細(xì)胞發(fā)生粘連而邊界不清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整。

圖4 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Figure 4 Effects of LC-EO on morphological structures of Salmonella cells

2.5 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌可溶性蛋白的影響

BCA蛋白試劑盒測(cè)定結(jié)果顯示，山蒼子精油作用12、16 h后，鼠傷寒沙門(mén)菌的可溶性蛋白分別減少（41.69±0.97）%（P＜0.01）、（39.05±0.92）%（P＜0.01）。據(jù)圖5，經(jīng)2 MIC的山蒼子精油處理后，分子量在40 000和70 000左右的可溶性蛋白質(zhì)減少，分子量在25 000～30 000間的蛋白質(zhì)明顯減少甚至消失。由此可看出，山蒼子精油可使沙門(mén)菌的可溶性蛋白質(zhì)減少。

圖5 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Figure 5 Effect of LC-EO on the soluble protein contents of Salmonella

2.6 山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜的影響

據(jù)圖6，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同亞抑菌濃度的山蒼子精油處理后，8 μg/mL組的生物被膜總量減少（19.25±3.42）%（P＜0.01）；16 μg/mL 組的生物被膜總量減少（37.73±2.84）%（P＜0.01）；32 μg/mL 組的生物被膜總量減少（56.91±3.40）%（P＜0.01）；64 μg/mL組的生物被膜總量減少（65.91±4.41）%（P＜0.01）。據(jù)此可知，經(jīng)亞抑菌濃度的山蒼子精油處理后，沙門(mén)菌生物被膜的形成均被抑制，且隨山蒼子精油濃度增高，抑制作用增強(qiáng)，呈濃度依賴(lài)性。

圖6 不同濃度的山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜形成的影響Figure 6 Effects of different concentrations of LC-EO on biofilm formation of Salmonella

3 討論與結(jié)論

沙門(mén)菌感染是食源性疾病的主要原因，研究表明目前沙門(mén)菌已有較高的耐藥性[21]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的MIC和MBC均為256 μg/mL，表明山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌有明顯的抑制和殺滅作用，山蒼子精油可作為沙門(mén)菌的殺菌藥，因此，以山蒼子精油為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，治療沙門(mén)菌引起的感染性疾病有很大前景。

細(xì)胞膜是細(xì)胞的屏障，受損會(huì)改變細(xì)胞的通透性，影響細(xì)胞的新陳代謝[22]。膜電位試驗(yàn)中，加有山蒼子精油的沙門(mén)菌的細(xì)胞膜電位與對(duì)照組相比均增大，表明山蒼子精油改變了沙門(mén)菌的通透性。電導(dǎo)率試驗(yàn)再次證明了這一觀(guān)點(diǎn)。這與孟玉霞等[23]的結(jié)論一致。

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。何學(xué)文等[24]發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的肉桂醛可使沙門(mén)菌蛋白質(zhì)條帶變淺甚至部分條帶消失。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油可使沙門(mén)菌的蛋白質(zhì)含量減少，部分蛋白質(zhì)條帶變淺甚至消失，這可能是因?yàn)樯缴n子精油改變了沙門(mén)菌膜結(jié)構(gòu)的通透性和完整性，蛋白質(zhì)外流所致。

生物被膜不僅可幫助菌體適應(yīng)環(huán)境利于生存，還可以導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性和持續(xù)性感染。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的山蒼子精油可明顯抑制沙門(mén)菌生物被膜的形成。崔海英等[25]的研究表明山蒼子精油可通過(guò)清除胞外聚合物來(lái)破壞MRSA生物膜的結(jié)構(gòu)，抑制膜內(nèi)細(xì)菌的代謝水平，山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌生物被膜的作用機(jī)制可能如此。

山蒼子精油來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)GB2760-86標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)已批準(zhǔn)山蒼子精油用于食品中，因其無(wú)毒副作用，其還被廣泛用于醫(yī)藥、化工等行業(yè)[26]。因此，以山蒼子精油為原料，將其制成食品保鮮劑或藥食同源產(chǎn)品有良好前景。

綜上所述，山蒼子精油可明顯抑制沙門(mén)菌生長(zhǎng)，可通過(guò)改變沙門(mén)菌的細(xì)胞通透性、抑制生物被膜合成、減少可溶性蛋白質(zhì)含量、改變細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)影響沙門(mén)菌的新陳代謝，從而起到抑菌和殺菌作用。為更好地開(kāi)發(fā)出山蒼子精油的相關(guān)產(chǎn)品以抑制沙門(mén)殺菌，還應(yīng)探究山蒼子精油對(duì)沙門(mén)菌遺傳物質(zhì)的作用，并進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)。