梁 鑫，宋林江，劉 馳，何 煊，江 舟，陳浩然，成姝婷*，王正榮*

（1.成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學與生命科學學院/附屬生殖婦幼醫(yī)院，成都 610041；2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，成都 610041）

由于環(huán)境污染、精神壓力等因素的綜合作用，生殖疾病的發(fā)生率逐年上升。根據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計，超過10%的育齡人口患有不孕癥[1]。生殖疾病增加了社會負擔，對患者的生理、心理和家庭幸福產(chǎn)生了嚴重的負面影響。因此，生殖疾病發(fā)病機制的研究是醫(yī)學界防治的重點。

生物節(jié)律是人體適應(yīng)環(huán)境和調(diào)節(jié)身體功能的最重要機制之一[2]。生物節(jié)律與許多疾病的發(fā)生直接相關(guān)，特別是一些節(jié)律基因，如近日節(jié)律基因，直接參與多種生理和病理過程[3]。因此，一旦人體的節(jié)律基因發(fā)生改變，可能引起生理功能障礙和各種疾病。

近日節(jié)律基因已經(jīng)在生理學和行為學領(lǐng)域得到了廣泛的研究。最近的研究表明，近日節(jié)律基因、生殖行為和內(nèi)分泌生理學之間存在某種特定的關(guān)系[4-5]。在眾多的近日節(jié)律基因中，Clock發(fā)揮著重要的作用，Clock是近日節(jié)律的核心基因，Clock突變的小鼠，機體的近日節(jié)律遭到嚴重破壞，導致生育力下降[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在精子生成過程中，CLOCK蛋白限制性地表達于圓形精子的頂體，值得關(guān)注[8]。眾所周知，精子頂體在受精過程中發(fā)揮重要的作用，CLOCK蛋白在對受精起重要作用的頂體部位限制性地表達，提示Clock與生殖功能有密切關(guān)系，值得進一步探索。前期研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，干擾小鼠睪丸中Clock基因的蛋白質(zhì)表達后，導致頂體酶活性、體外受精率和囊胚形成率下降[9]。本研究擬進一步研究Clock基因?qū)ε咛ブ布疤ナ蟀l(fā)育的影響，檢測甲基轉(zhuǎn)移酶表達水平及各階段胎鼠甲基化水平的差異，揭示影響胎鼠發(fā)育異常的可能機制或原因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物分組與處理

ICR 小鼠，雄性 8～10周齡，雌性 4～6周齡，購自四川省成都達碩實驗動物有限公司。使用標準小鼠籠具分籠飼養(yǎng)于光暗循環(huán)箱內(nèi)（光/暗=12 h∶12 h），自由進食和飲水，保持室溫為24℃±1℃。以隨機分組原則將小鼠分為2組，一組為干擾組，注射Clock干擾質(zhì)粒于睪丸內(nèi)，另一組為陰性對照組，注射武漢晶賽公司提供的通用陰性HK質(zhì)粒于睪丸內(nèi)。注射方法：雄性小鼠乙醚麻醉后，將小鼠腹腔內(nèi)的兩側(cè)睪丸推入已經(jīng)松弛的陰囊，固定后，用微量注射器分別將干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒溶液20 μL注射入干擾組和對照組小鼠的雙側(cè)睪丸里。實驗動物及方案已通過四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法學院研究倫理委員會審查。

1.1.2 試驗材料與儀器

材料：切片刀，溫臺，蠟杯，酒精燈，包埋盒，染色缸，樹膠，樹膠瓶，溫度計，熔蠟爐，無菌塑料組織培養(yǎng)皿等。

儀器：高效液相色譜儀，PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，純水儀，離心機，體視顯微鏡，倒置顯微鏡，切片機，恒溫箱，水浴鍋，電子天平，微量注射器，眼科剪、眼科鑷等手術(shù)器械。

1.1.3 試劑

Clock干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒；動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑In vivo-jetPEITM為Poly Plus公司產(chǎn)品；孕馬血清促性腺激素（PMSG）和絨毛膜促性腺激素（HCG）購于寧波市第二激素廠；質(zhì)粒提取試劑盒購于OMEGA公司；Trizol（美國，Invitrogen）；First Strand cDNA Synthesis Kit（美國，F(xiàn)ermentas）；動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑In vivo-jetPEITM為Poly Plus公司產(chǎn)品；Taq酶（美國，F(xiàn)ermentas）；芝加哥天藍 6B（Sigma C8679）。引物序列如下：

1.2 試驗方法和步驟

1.2.1 早期胚胎著床點的觀察

雄鼠睪丸內(nèi)注射干擾質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒。注射質(zhì)粒16 d后，雌鼠注射PMSG 10 IU/只促超排卵，18 d后注射雌鼠hCG 10 IU/只，將雄鼠與雌鼠1∶2合籠。合籠后第二日清晨取出雌鼠，觀察其陰道栓以確定交配，篩選出具有陰道栓的孕鼠。取交配后5.5 d（5.5 dpc）的妊娠小鼠，尾靜脈注射0.1 mL 1%的芝加哥天藍染液。注射后3 min，處死小鼠，分離子宮，分別記錄干擾組和對照組著床點數(shù)目。

1.2.2 檢測妊娠小鼠各階段胎鼠生長情況

分別獲取 10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5 dpc期胎鼠做檢測，包括大體形態(tài)、體重和有無死胎等。

1.2.3 胎鼠組織細胞生長發(fā)育和觀察

將胎鼠用固定液固定，石蠟切片，HE染色，鏡下觀察胎鼠組織結(jié)構(gòu)。做整體矢狀面切片，以及對其大腦、心、肝、脾、肺、腎等各自位置的水平面切片。

1.2.4 測定胎鼠總甲基化水平和甲基轉(zhuǎn)移酶表達量

分別獲取 9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5 dpc期胎鼠，將獲取的不同階段胎鼠于凍存管中，-80℃保存。從胎鼠組織中提取并水解DNA，用高效液相色譜儀測定胎鼠總甲基化水平；從胎鼠組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。用高效液相色譜儀測定胎鼠甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 24.0和GraphPad Prim 8軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均值±標準差（x±s）表示。兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗，多組間比較采用One way ANOVA的分析方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾小鼠睪丸Clock基因表達對胚胎著床的影響

干擾組小鼠和對照組小鼠分別注射干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒，然后與雌性小鼠交配。交配后5.5 d處死妊娠小鼠（5.5 dpc），尾靜脈注射芝加哥天藍染色液。注射3 min后，處死小鼠，分離子宮，觀察子宮內(nèi)胚胎著床部位的數(shù)量（圖1）。

圖1 胚胎著床點Figure 1 Study of embryo implantation

結(jié)果表明，干擾組平均胚胎植入量為14.50±2.93，對照組平均胚胎植入量為20.33±3.32。兩組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明對雄性小鼠睪丸內(nèi)Clock基因的干擾顯著改變了小鼠胚胎的植入（圖2）。

圖2 干擾小鼠睪丸Clock基因表達對胚胎著床的影響Figure 2 The influence of interfering gene Clock on embryo implantation of mice

2.2 干擾小鼠睪丸Clock基因表達對胎鼠生長發(fā)育的影響

干擾組雄性小鼠和對照組雄性小鼠分別注射干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒，然后與雌性小鼠交配。本組分別取 12.5、14.5、16.5 dpc期胎鼠，觀察其形態(tài)、體重、有無死胎等，用固定液、石蠟切片、HE染色固定胎鼠，并在顯微鏡下觀察胚胎的胎鼠組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著天數(shù)的增加，干擾組死胎/畸形兒發(fā)生率明顯高于對照組，而不同發(fā)育階段的體重均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（圖 3，表 1，2）。

圖3 發(fā)育畸形的胎鼠Figure 3 The malformation of mice fetus

表1 干擾小鼠睪丸Clock基因表達后死胎與異常胎的比較Table 1 The comparation of dead fetus and abnormal fetus after interfering of gene Clock

表2 干擾小鼠睪丸Clock基因表達后對胎鼠體重的影響Table 2 The effect of interfered Clock on weights of mice fetus g

2.3 干擾小鼠睪丸Clock基因表達對胎鼠組織結(jié)構(gòu)的影響

在干擾小鼠睪丸內(nèi)時鐘基因的表達后，觀察到小鼠心臟發(fā)育不良（包含組織疏松、薄壁等異常），脊柱發(fā)育分段性差。隨著發(fā)育時間的延長，發(fā)育缺陷更加明顯（圖4）。

圖4 胎鼠組織結(jié)構(gòu)圖Figure 4 The organizational chart of mice fetu

2.4 干擾小鼠睪丸Clock基因?qū)μナ罂偧谆郊凹谆D(zhuǎn)移酶的影響

干擾組雄性小鼠和對照組雄性小鼠分別注射干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒，然后與雌性小鼠交配。收集不同發(fā)育階段的胎鼠，用高效液相色譜法測定胎鼠總甲基化水平，用RT-PCR法檢測甲基轉(zhuǎn)移酶的表達。發(fā)現(xiàn)在胎鼠發(fā)育的11.5～16.5 dpc階段，干擾組內(nèi)的甲基化水平顯著低于對照組（圖5）。兩組間DNMT3B-4有顯著性差異，干擾組低于對照組，其他甲基轉(zhuǎn)移酶無顯著性差異。這表明，在干擾小鼠睪丸內(nèi)Clock基因表達后，可能是由于DNMT3B-4的水平降低，導致胎鼠的總甲基化水平降低，從而影響妊娠期間胎鼠的發(fā)育（圖6）。

圖5 干擾小鼠睪丸Clock基因表達后對胎鼠總甲基化水平的影響Figure 5 The effects of interfered Clock on total methylation levels of mice fetus

圖6 交配后11.5～16.5 d胎鼠甲基轉(zhuǎn)移酶水平Figure 6 The levels of all kinds of methyltransferase on 11.5 dpc to 16.5 dpc

3 討論

胚胎著床過程非常復雜，涉及母體子宮內(nèi)膜與孕體之間大量基因的協(xié)同作用，以達到相互識別和黏附，最后胚胎植入子宮內(nèi)膜[10]。胚胎著床是哺乳動物生殖過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到妊娠的成敗。近年來關(guān)于近日節(jié)律基因與著床的關(guān)系鮮有報道。C.K.Ratajczak等人曾報道，與野生型小鼠相比，bmal1-/-小鼠的植入失敗率較高[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸Clock基因表達受到干擾后，小鼠著床數(shù)下降。

有關(guān)近日節(jié)律在胚胎發(fā)育方面的作用仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，排卵后延遲受精4～6 h對小鼠胚胎的存活有明顯的影響[12]。近日節(jié)律基因在小鼠母體內(nèi)發(fā)育的二細胞期胚胎中有表達[13]，而在桑椹胚期表達量降低[14]。胚胎在通過輸卵管時可能受到母體節(jié)律信號的影響。在大鼠的輸卵管發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)有近日節(jié)律基因或其控制的基因表達[15]。目前有報道子宮也存在近日節(jié)律基因表達[16]。將小鼠置于22和26 h非節(jié)律性的光暗周期環(huán)境下，小鼠胚胎的重吸收率較高，胎仔的存活率很低[17]。

近日節(jié)律基因的敲除將導致其生殖功能紊亂。早期的研究表明，Clock△19突變的小鼠具有生殖缺陷，表現(xiàn)為動情周期延長、產(chǎn)仔率下降[18]。2004年，B.H.Miller等研究發(fā)現(xiàn)Clock△19突變的小鼠排卵容易紊亂，且流產(chǎn)、胎鼠的再吸收情況比例增高，仔鼠的存活率降低[19]。2006 年，H.Dolatshad 等[20]進一步證實了Clock△19突變的小鼠有較高的難產(chǎn)率。純合子Clock△19突變Balb/c小鼠與野生型比較，胎仔數(shù)顯著降低，其存活率由94%下降到84%[21]。D.J.Kennaway等研究發(fā)現(xiàn)Clock△19+MEL的小鼠與野生型比較，懷孕時間延遲，存活率低（80%∶96%），胎仔數(shù)略有降低[15]。因此，目前研究顯示，Clock△19的突變與生殖功能存在某種聯(lián)系，引起生殖能力下降，但并沒有引起完全不育發(fā)生。研究表明，精子質(zhì)量參數(shù)與流產(chǎn)等存在必然聯(lián)系[22-25]。在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)，使用RNA干擾（RNAi）技術(shù)降低小鼠睪丸內(nèi)Clock基因的表達時，頂體酶活性、體外受精率和囊胚形成率降低[26]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，干擾睪丸Clock基因后，小鼠死胎和異常胎增多，胎鼠的體重較對照組顯著下降，與已有報道一致。另外研究發(fā)現(xiàn)，Clock△19突變的小鼠Clock在肝、心臟、腎臟和肌肉的表達明顯下調(diào)，并呈非節(jié)律性表達[26-27]。暗示Clock基因表達異常，可能會影響小鼠某些組織結(jié)構(gòu)的異常，而導致胎鼠死亡或畸形。本研究顯示，干擾Clock基因表達后，胎鼠顯示心臟發(fā)育不良，脊柱發(fā)育分節(jié)不良。這說明干擾Clock基因表達后，胎鼠的發(fā)育受到影響。

胚胎發(fā)育是一個復雜的過程，是基因在一定時空順序上的選擇性表達[28]?；蛟谔囟A段的穩(wěn)定表達對發(fā)育中的胚胎細胞的生長和分化起著關(guān)鍵作用[29]?；虮磉_的變異決定了胚胎和生命的發(fā)育過程。DNA甲基化是一種早期確定的基因表觀遺傳修飾方式，在細胞分化過程中調(diào)控基因狀態(tài)[30-31]，并在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，是最常見的修飾[32-33]。DNA甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，抑制基因的表達[34]。基因?qū)⒈３帧俺聊?。如果轉(zhuǎn)錄活性需要恢復，DNA去甲基化就會發(fā)生[35]。在胚胎發(fā)育過程中，過早的甲基化或不完全的去甲基化可導致胚胎死亡或產(chǎn)后遺傳性疾病。早期胚胎的終止可能是由于DNA的甲基化不完全所致[36]。鑒于DNA甲基化對早期胚胎凋亡的重要性，本研究測定了妊娠不同階段胎鼠的總甲基化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾組11.5～16.5 dpc胎鼠甲基化水平顯著低于對照組。因此，我們推測，小鼠睪丸Clock基因表達受到干擾后，在11.5～16.5 dpc階段出現(xiàn)DNA甲基化水平下降，導致胎鼠發(fā)育異常。

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5′甲基胞嘧啶[37]。研究表明，胚胎的正常發(fā)育得益于基因組DNA的適當甲基化。例如，缺乏任何類型的甲基轉(zhuǎn)移酶對小鼠胚胎的發(fā)育都是致命的[38-39]。因此，在DNA甲基化的過程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用至關(guān)重要。目前發(fā)現(xiàn)存在多種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，主要有以下幾種：①DNMT 1：維持性甲基轉(zhuǎn)移酶，確保每個細胞的DNA甲基化模式的正常復制[40]。主要是催化新生鏈上DNA甲基化的發(fā)生，維持原來的甲基化，是組織中含量最為豐富的甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMT l在哺乳動物中的作用研究，已經(jīng)在鼠科類動物中得到廣泛的開展。有研究發(fā)現(xiàn)，失去DNMT l基因的胚胎干細胞和鼠類個體，都表現(xiàn)出一些明顯的變化，其中最為明顯的是，基因組發(fā)生嚴重的甲基化缺乏，導致胚胎致死[41]。② DNMT 3：主要是DNMT 3a和DNMT 3b，另外還有DNMT 3L。DNMT 3a和DNMT 3b也稱從頭甲基酶，主要介導從頭甲基化。主要功能是在配子形成期和胚胎早期建立甲基化模式[42]。研究表明，破壞DNMT 3a對小鼠是致死的，DNMT 3a和DNMT 3b雙突變時不能甲基化新整合的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA序列[43]，DNMT 3b可能與胚胎附植后經(jīng)典的衛(wèi)星DNA序列和失活X染色體上CpG島的甲基化有關(guān)。DNMT 3L是一種與甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的蛋白，它不具有甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，主要是與DNMT 3a和DNMT 3b結(jié)合調(diào)節(jié)兩者的催化活性。③DNMT 2是體外甲基轉(zhuǎn)移酶，低水平存在于小鼠的所有組織，由于該基因缺失不影響胚胎干細胞整體甲基化水平，因此推斷DNMT 2可能不涉及DNA的甲基化。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，胎鼠發(fā)育的11.5～16.5 dpc階段，干擾組DNMT3B-4水平較對照組明顯下降。因此，我們推斷，干擾小鼠睪丸Clock基因表達引起胎鼠發(fā)育異常的原因，可能是DNMT3B-4水平下降，導致胎鼠總甲基化水平下降，從而影響了胎鼠的發(fā)育。但其深層次原因，有待于進一步深入研究。