通絡(luò)玉液湯干預(yù)APDN、AngⅡ和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度對糖尿病大鼠大血管纖維化的影響

楊艷梅 張山起 李淑貞 胡慶 趙琳杰

(1滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河北 滄州 061001；2滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

調(diào)查顯示〔1～3〕，中國成人糖尿病(DM)的患病率為10.9%，DM患者的全因死亡率明顯高于無糖尿病者，其中DM造成的心血管疾病死亡率的增加尤為突出。血管纖維化是DM患者大血管組織學(xué)病變的主要特征之一〔4〕。本實(shí)驗(yàn)通過血清脂聯(lián)素(APDN)、血管緊張素(Ang)Ⅱ和大血管細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度等指標(biāo)的觀察，探討通絡(luò)玉液湯干預(yù)DM大鼠大血管纖維化的影響機(jī)制，揭示通絡(luò)玉液湯對DM大血管的保護(hù)作用，為DM的防治提供線索。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 通絡(luò)玉液湯組成為生黃芪30 g，生曬參8 g，生山藥20 g，知母10 g，麥冬15 g，花粉10 g，五味子9 g，葛根10 g，雞內(nèi)金6 g，當(dāng)歸尾15 g，丹參15 g，地龍8 g，生藥購于滄州同仁堂藥店。按傳統(tǒng)工藝制備水煎，濃縮至含原方生藥量1.7 g/ml的藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鏈脲佐菌?STZ)購于美國Sigma公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于上海建寧生物科技公司。Ca2+熒光探針(Fluo-3 AM)購于中國碧云天公司。

1.2模型建立與藥物干預(yù) 將體重170～190 g清潔級健康雄性SD大鼠72只〔購自天津軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，編號：SCXX(軍)2009-003〕適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)分為正常對照組20只(NC組，4 w、8 w組各10只)和模型組52只。給予模型組高糖高脂飼料(20%蔗糖+10%豬油+2.5%膽固醇+67.5%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)4 w后，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(先配制0.1 mmol/L，pH 4.4 的枸櫞酸緩沖液，后在冰水中與STZ 配制成2%的濃度，5 min內(nèi)用完)，72 h后采大鼠尾靜脈血，隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L為DM造模成功，持續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)6 w，即成為DM血管病變模型(造模成功47只，成功率約90%)。NC組一直采用普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射相同劑量濃度的檸檬酸鈉緩沖液。將模型組大鼠隨機(jī)分為DM組23只(4 w組11只、8 w組12只)和通絡(luò)玉液湯組24只(TYD組，4 w、8 w組各12只)，通絡(luò)液湯組按照人鼠等效劑量給予通絡(luò)玉液湯煎劑17 g/(kg·d)灌胃；NC組和DM組每日給予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.3APDN、AngⅡ、血糖、血脂和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測 大鼠禁食12 h后，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，采頸總動(dòng)脈血液，取其中的4 ml分離血清，雙抗體夾心ELISA檢測血清APDN和AngⅡ含量；其余血液用于檢測血糖(強(qiáng)生快速血糖儀)和血脂(奧林巴斯 AU400 全自動(dòng)生化分析儀)。經(jīng)處理后腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，采用熒光探針Fluo-3 AM標(biāo)記法在流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)波長下檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

1.4腹主動(dòng)脈血管形態(tài)學(xué)檢查 大鼠處死后迅速切取腹主動(dòng)脈血管，制成1 mm3小塊，先后用4%戊二醛和1%鋨酸固定，制作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色后用透射電鏡(Philips CM12)觀察動(dòng)脈血管的微細(xì)結(jié)構(gòu)；另取一部分腹主動(dòng)脈血管用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察動(dòng)脈血管的病理變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖、血脂檢測結(jié)果比較 DM 4 w組、8 w組空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯高于同時(shí)間NC組(P<0.01)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于同時(shí)間NC組(P<0.01)；TYD 4 w組、8 w組FBG、TG、TC和LDL-C明顯低于同時(shí)間DM組(P<0.01)，HDL-C明顯高于同時(shí)間DM組(P<0.01)。見表1。

表1 各組血糖、血脂檢測結(jié)果及血清APDN、AngⅡ和大血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較

2.2各組血清APDN、AngⅡ和大血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較 與同時(shí)間NC組比較，DM 4 w組、8 w組的APDN明顯偏低，AngⅡ和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯偏高(P<0.01)；與同時(shí)間DM組比較，TYD 4 w組、8 w組的APDN明顯偏高，AngⅡ和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯偏低，但Ca2+濃度及4 w AngⅡ仍明顯高于NC組(P<0.01)；TYD 4 w組、8 w組間的APDN、AngⅡ和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組大血管形態(tài)結(jié)構(gòu)比較 光鏡下觀察(見圖1)：NC 4 w組、8 w組腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞未見明顯變形，且排列規(guī)則整齊。在DM 4 w組平滑肌細(xì)胞存在不同程度的缺失且排列紊亂，少數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞變性或壞死；DM 8 w組可見大部分平滑肌細(xì)胞變性、壞死且排列紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞缺失，有脂質(zhì)沉積，并伴有明顯的炎細(xì)胞浸潤。TYD 4 w組可見少量平滑肌細(xì)胞變性、壞死且排列較規(guī)則整齊，內(nèi)皮細(xì)胞缺失明顯較少，脂質(zhì)沉積減少，炎細(xì)胞浸潤程度明顯減輕；TYD 8 w組與TYD 4 w組沒有明顯差別。電鏡下觀察(見圖2)：NC 4 w組、8 w組腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)略有腫脹。DM 4 w組內(nèi)皮細(xì)胞脫落，可見胞質(zhì)碎片，內(nèi)皮下結(jié)締組織腫脹；DM 8 w組內(nèi)皮細(xì)胞表面突起、脫落，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)吞噬小泡，線粒體空泡化，細(xì)胞核不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞游離面胞質(zhì)缺損，胞質(zhì)腫脹。TYD 4 w組內(nèi)皮細(xì)胞局部脫落、細(xì)胞質(zhì)略腫脹，線粒體部分空泡化，核間隙擴(kuò)張，部分內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)游離面脫落；TYD 8 w組與TYD 4 w組沒有明顯差別。

圖1 各組大鼠大血管光鏡觀察(HE，×400)

圖2 各組大鼠大血管電鏡觀察

3 討 論

大血管病變是DM后期嚴(yán)重的并發(fā)癥，大血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、狹窄甚至堵塞造成的缺血會(huì)嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)功能和生活質(zhì)量，而血管纖維化是大血管病變發(fā)生發(fā)展過程中的主要表現(xiàn)形式〔5〕。研究證實(shí)APDN是一種具有抗AS、促進(jìn)血管再生等保護(hù)作用的脂肪細(xì)胞因子〔6～8〕：APDN可以緩解微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥、抑制巨噬細(xì)胞因子(與AS的形成密切相關(guān))的產(chǎn)生、抑制單核細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和髓樣分化，還可以直接抑制血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1、細(xì)胞間黏附分子1和E-選擇蛋白等導(dǎo)致AS的分子；APDN可以通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、5腺苷磷酸活化蛋白激酶(AMPK) 和環(huán)氧合酶(COX)-2等重要的細(xì)胞內(nèi)信號分子促進(jìn)血運(yùn)重建。而 AngⅡ是生物活性最強(qiáng)的效應(yīng)肽，可促進(jìn)血管AS形成、刺激血管形成纖維化病變，同時(shí)增加血管平滑肌細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流，影響大血管的功能〔9～11〕：AngⅡ可以通過產(chǎn)生活性氧、活化基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬功能而加劇纖維帽的不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致AS斑塊的不穩(wěn)定；AngⅡ能夠通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)-1和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)促進(jìn)血管壁的纖維化；AngⅡ還可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流和血管收縮，進(jìn)而影響血管功能。故血清APDN 、AngⅡ是衡量動(dòng)脈粥樣硬化、血管平滑肌纖維化及功能紊亂的重要標(biāo)志物。

玉液湯可益氣滋陰、固腎止渴，目前被廣泛用于DM、高血壓等疾病的治療，但目前尚未報(bào)道其對DM血管病變的療效；生脈散可治療氣陰兩虛證，近年來也常應(yīng)用于治療心血管病變〔12〕。鑒于DM血管病變瘀血阻絡(luò)、氣陰兩虛的病機(jī)，本實(shí)驗(yàn)在玉液湯和生脈散的基礎(chǔ)上加減化裁而成通絡(luò)玉液湯，具有行活血通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰之功效，以達(dá)到DM血管損傷的防治作用。

本研究結(jié)果顯示，給予通絡(luò)玉液湯干預(yù)后，糖尿病大鼠血清APDN明顯恢復(fù)性升高，血清AngⅡ和腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯恢復(fù)性降低，F(xiàn)BG、TG、TC、LDL-C降低和HDL-C增高，鏡下發(fā)現(xiàn)通絡(luò)玉液湯可部分逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈的纖維化。表明通絡(luò)玉液湯可以通過升高血清APDN、降低血清AngⅡ和大血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度來減輕大血管發(fā)生纖維化、保護(hù)糖尿病大血管，從而減緩糖尿病大血管病變的發(fā)生和發(fā)展。