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      電針對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功能及TGF-β、TNF-α、IL-8的影響

      2021-07-06 20:18:39李瑋劉自兵潘婭玲林先剛
      關(guān)鍵詞:洗液電針肺泡

      李瑋 劉自兵 潘婭玲 林先剛

      〔摘要〕 目的 觀察電針“肺俞”“足三里”對慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD)大鼠肺功能及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)表達(dá)的影響,初步探討針刺治療COPD的效應(yīng)機(jī)制。方法 60 只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、針刺組,每組20 只,因模型復(fù)制和針刺干預(yù)過程中部分大鼠死亡,最終納入統(tǒng)計(jì)為每組10 只。采用氣管灌注脂多糖聯(lián)合香煙煙熏法復(fù)制COPD大鼠模型。針刺組采用電針對大鼠雙側(cè)“肺俞”“足三里”穴進(jìn)行干預(yù)治療,每次20 min,1 次/d,共干預(yù)15 d,模型組和正常組大鼠不作干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后測定各組大鼠肺通氣功能,蘇木精-伊紅(hematine-eosine, HE)染色法觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清、肺泡灌洗液和肺組織中TNF-α、TGF-β、IL-8含量。結(jié)果 與正常組比較,模型組大鼠肺泡腔明顯擴(kuò)張伴肺組織間隙炎性浸潤,肺活量、第0.1 秒用力呼氣量占用力肺活量(forced vital capacity, FVC)比值以及第0.3 秒用力呼氣量占FVC比值均顯著降低(P<0.05或P<0.01),血清、肺泡灌洗液和肺組織中TNF-α、IL-8、TGF-β含量均升高(P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠肺泡腔擴(kuò)張和肺組織炎性浸潤減輕,肺活量、第0.1 秒用力呼氣量占FVC比值以及第0.3秒用力呼氣量占FVC比值均顯著升高(P<0.05或P<0.01),血清、肺泡灌洗液和肺組織中TNF-α、TGF-β、IL-8水平明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 電針可以改善COPD氣道通氣受限情況,緩解肺泡擴(kuò)張和肺組織炎性反應(yīng),降低機(jī)體炎性細(xì)胞因子水平。其中,抑制TNF-α、TGF-β、IL-8的高表達(dá)狀態(tài)可能是針刺改善COPD呼吸道炎癥和氣道阻塞的效應(yīng)機(jī)制之一。

      〔關(guān)鍵詞〕 慢性阻塞性肺疾病;針刺;肺功能;炎癥;轉(zhuǎn)化生長因子-β;腫瘤壞死因子-α;白細(xì)胞介素-8

      〔中圖分類號(hào)〕R245.97? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.009

      〔Abstract〕 Objective To observe the effect of electroacupuncture "Feishu" (BL13) and "Zusanli" (ST36) on lung function and expression of transforming growth factor-β (TGF-β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-8 (IL-8) in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), to explore the therapeutic effect of electroacupuncture on COPD. Methods 60 male SD rats were randomly divided into normal group, model group and acupuncture group, with 20 rats in each group. Some rats died in the process of model replication and acupuncture intervention, finally, 10 rats in each group were included. COPD rat model was established by tracheal injection of lipopolysaccharide combined with cigarette smoke. The rats in the acupuncture group were treated with electroacupuncture on both sides of "Feishu" (BL13) and "Zusanli" (ST36) for 20 minutes every time, once a day, 15 days in total. The rats in the model group and the normal group were not intervened. At the end of the intervention, the lung function indexes of each group were measured, the lung histopathological changes of each group were observed by HE staining, and the levels of TNF-α, TGF-β, IL-8 in serum, bronchoalveolar fluid and lung tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with the normal group, the alveolar cavity of the model group was obviously dilated with inflammatory infiltration in the lung tissue. The vital capacity, the ratio of forced expiratory volume at 0.1 second and forced expiratory volume at 0.3 second to forced vital capacity (FVC) were significantly decreased (P<0.05, P<0.01), and the levels of TNF-α, IL-8 and TGF-β in serum, bronchoalveolar fluid and lung tissue were increased (P<0.01); compared with the model group, the alveolar cavity and inflammatory infiltration in lung tissue were reduced, vital capacity and the ratio of forced expiratory volume at 0.1 second and forced expiratory volume at 0.3 second to FVC in electroacupuncture group were significantly increased (P<0.05, P<0.01), and the levels of TNF-α, TGF-β and IL-8 in serum, bronchoalveolar fluid and lung tissue were significantly decreased (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture can improve COPD airway ventilation restriction, relieve alveolar dilation and inflammatory response of lung tissue, and reduce the level of inflammatory cytokines. Inhibition of TNF-α, TGF-β, IL-8 expression may be one of the mechanisms of electroacupuncture in improving airway inflammation and airway obstruction in COPD.

      〔Keywords〕 chronic obstructive pulmonary disease; acupuncture; lung function; inflammation; transforming growth factor-β; tumor necrosis factor-α; interleukin-8

      慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmo-nary disease, COPD)是以喘咳、胸悶、呼吸困難等為主癥的慢性肺病,伴隨進(jìn)行性的肺通氣障礙和呼吸道炎癥,其病理損傷不完全可逆,病程綿長難愈,COPD的病程進(jìn)展和肺功能下降與呼吸道炎癥有直接關(guān)系[1-2]。臨床數(shù)據(jù)顯示,COPD患者血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)等參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子水平,與其病程發(fā)展及肺功能損傷具有密切相關(guān)性[3]。COPD的臨床治療一般以提升呼吸功能和抑制呼吸系統(tǒng)炎癥為主要策略,針灸作為中醫(yī)外治手段之一,現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于包括COPD在內(nèi)的多種慢性疾病的康復(fù)治療中,并發(fā)揮其獨(dú)特的效果和優(yōu)勢[4]。研究[5]表明,針刺介入COPD的臨床治療能夠提升患者的肺康復(fù)效果,對呼吸道炎癥和肺通氣功能具有明顯改善作用,且安全性較好。但是目前對于針灸治療COPD的效應(yīng)機(jī)制尚不完全清晰,仍需進(jìn)一步研究。既往研究[6]顯示,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中采用電針作為針刺干預(yù)手段能夠保持較為穩(wěn)定的刺激強(qiáng)度、頻率和時(shí)間控制,不僅節(jié)約了人力還具備較好的可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針對COPD模型大鼠肺功能及血清、肺泡灌洗液、肺組織中細(xì)胞纖維化和炎性相關(guān)因子TGF-β、TNF-α、IL-8含量的影響,探討電針治療COPD的作用,以期為針灸治療COPD作用機(jī)制的研究提供一定的參考。

      1 材料與方法

      1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

      健康雄性SD大鼠60 只,體質(zhì)量(220±20) g,購于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(皖)2011-002]。大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、針刺組,每組20 只,模型復(fù)制和針刺干預(yù)過程中,因部分大鼠對麻醉劑的耐受度差異以及實(shí)驗(yàn)造模和電針初期熟練度不夠,導(dǎo)致手術(shù)創(chuàng)口過大或者麻醉后未能蘇醒,實(shí)驗(yàn)前期存在較多實(shí)驗(yàn)大鼠死亡事件,而后通過練習(xí)減小造模手術(shù)創(chuàng)口、適度減少麻醉深度,大鼠死亡情況好轉(zhuǎn)。最后各組實(shí)際納入統(tǒng)計(jì)的為每組10 只大鼠(正常組大鼠無死亡,亦隨機(jī)挑選10只納入統(tǒng)計(jì))。大鼠飼養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,相對濕度為50%±5%,每日更換水食、墊料。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(國科發(fā)財(cái)字〔2006〕398號(hào))》規(guī)定進(jìn)行。

      1.2? 主要試劑及儀器

      南京牌過濾嘴香煙(江蘇中煙工業(yè)責(zé)任有限公司,批號(hào):7120192130761280);脂多糖(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):818E034);大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司,批號(hào):E20190701A)、大鼠TGF-β ELISA試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司,批號(hào):E20190701A)、大鼠IL-8 ELISA試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司,批號(hào):E20190701A)。AniRes2005小動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司,型號(hào):V3.5);電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,型號(hào):SDZ-Ⅱ);0.25 mm×20 mm針灸毫針(貴州安迪藥械有限公司,批號(hào):160509);切片機(jī)(德國Leica公司,型號(hào):2235);高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司,型號(hào):JW3021HR)。

      1.3? 動(dòng)物模型復(fù)制方法

      參照文獻(xiàn)[7-8]方法,采用香煙環(huán)境煙熏結(jié)合脂多糖氣管灌注方法復(fù)制COPD模型大鼠,模型復(fù)制包括60 d香煙環(huán)境煙熏和2次脂多糖氣管灌注。煙熏方法為使用自制1 m×1 m×1 m的有機(jī)玻璃箱為煙熏箱,頂端開1個(gè)直徑5 cm透氣孔,將大鼠置于箱內(nèi)并同時(shí)點(diǎn)燃20支香煙,30 min后更換1次香煙,每次煙熏60 min,1次/d,持續(xù)60 d。造模第1 天和第15天分別將大鼠麻醉后手術(shù)暴露氣管,灌注濃度為1 mg/mL的脂多糖溶液0.2 mL于大鼠氣道內(nèi)。正常組大鼠不進(jìn)行造模處理。

      1.4? 針刺方法

      參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]中的動(dòng)物穴位圖譜對大鼠肺俞和足三里進(jìn)行選穴定位。造模結(jié)束后次日,將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái),剃除大鼠針刺穴區(qū)2 cm直徑區(qū)域體毛,暴露穴區(qū)皮膚,毫針刺入雙側(cè)肺俞0.5 cm、足三里1 cm,針刺后將同側(cè)肺俞、足三里兩穴的毫針針柄分別連接電針儀的同一對輸出線正負(fù)極,設(shè)置電流強(qiáng)度2 mA、頻率20 Hz疏密波進(jìn)行干預(yù)。每日針刺干預(yù)1 次,每次20 min,連續(xù)刺激15 d。

      1.5? 指標(biāo)觀察及檢測方法

      1.5.1? 測定肺通氣功能? 電針干預(yù)15 d后,各組大鼠麻醉后氣管插管并連接呼吸機(jī),AniRes-2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)檢測大鼠用力肺活量(forced vitalcapacity, FVC)、第0.1秒用力呼氣量占FVC比值(FEV0.1/FVC),以及第0.3秒用力呼氣量占FVC比值(FEV0.3/FVC)。

      1.5.2? 觀察肺組織病理形態(tài)? 各組大鼠麻醉后處死,取肺組織固定于4%多聚甲醛24 h,按照蘇木精-伊紅(hematine-eosine, HE)染色步驟進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、染色等操作,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察支氣管、肺組織形態(tài)學(xué)變化。

      1.5.3? 測定血清、肺泡灌洗液和肺組織中TGF-β、TNF-α、IL-8含量? 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血于無抗凝真空管中;手術(shù)開胸,止血鉗封閉右總支氣管,注射器抽取2 mL PBS緩沖液經(jīng)氣管插管處注入左肺,重復(fù)灌洗3次后抽出肺泡灌洗液;取右肺上葉,于勻漿器中加入PBS緩沖液勻漿;將大鼠血液、肺泡灌洗液、肺組織勻漿液于4 ℃、3 000 r/min、半徑13.5 cm、離心15 min,取上清-80 ℃冷藏備用。各樣本檢測參照酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒指導(dǎo)說明進(jìn)行操作。

      1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行繪制統(tǒng)計(jì)圖表。對計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),采用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,方差齊者采用LSD法分析,方差不齊者采用Games-Howell分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果均用“x±s”表示,均以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1? 各組大鼠一般狀況

      正常組大鼠一般狀況自始至終未見異常,毛發(fā)順滑光潔,呼吸均勻,未見咳嗽氣喘等呼吸道癥狀。模型組大鼠煙熏30 d后,開始出現(xiàn)咳嗽、噴嚏、嘴角流涎,毛發(fā)呈現(xiàn)淡黃色,精神狀態(tài)尚可;煙熏60 d以后,咳嗽加重,喘息聲明顯,喉中哮鳴音,嘴角和鼻孔周圍附著有黏液,精神萎靡,毛發(fā)發(fā)黃、嚴(yán)重脫落、黯淡無光,精神萎靡不振。針刺組針刺15 d后喘息聲減輕、口鼻周圍黏液減少,精神狀態(tài)有所改善。

      2.2? 各組大鼠肺通氣功能比較

      與正常組比較,模型組大鼠FVC、FEV0.1、FEV0.3、FEV0.1/FVC以及FEV0.3/FVC均明顯降低(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠FVC、FEV0.1、FEV0.3、FEV0.1/FVC、FEV0.3/FVC均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

      2.3? 各組大鼠肺組織、氣管病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

      正常組大鼠肺組織間隙無明顯炎細(xì)胞浸潤,肺泡組織結(jié)構(gòu)連續(xù)、緊密,肺泡腔正常、未見擴(kuò)大,肺泡壁完整;模型組大鼠肺泡腔有明顯擴(kuò)大,肺組織間隙出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,肺部出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng);針刺組大鼠肺組織間隙炎性細(xì)胞浸潤緩解,肺泡擴(kuò)張程度較模型組減輕。見圖2。

      2.4? 各組大鼠血清、肺泡灌洗液和肺組織內(nèi)TNF-α、TGF-β和IL-8含量比較

      與正常組比較,模型組大鼠血清、肺泡灌洗液和肺組織內(nèi)TNF-α、TGF-β、IL-8含量均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,針刺組TNF-α、TGF-β、IL-8水平明顯降低(P<0.01)。見圖3。

      3 討論

      COPD作為一種慢性進(jìn)行性呼吸系統(tǒng)異質(zhì)性疾病,雖然可以防治,但其難以治愈,多因長期暴露于有害顆?;驓怏w中引起氣道或肺泡異常而發(fā)病,吸煙是常見的致病因素[10]。本病屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”“痰飲”“喘證”等范疇[11],中醫(yī)理論中肺司呼吸、主一身之氣、為清虛之臟,并具有維持水道通調(diào)和血脈運(yùn)行的作用。正如《理虛元鑒·治虛有三本》所云“肺為五臟之天”,肺在機(jī)體生命運(yùn)動(dòng)中扮演者重要的角色,特別是其主導(dǎo)的呼吸功能是維持生命活動(dòng)的必須條件,而呼吸障礙是COPD的主要癥狀,因此,治療本病首要在于改善呼吸功能,進(jìn)而緩解因氣機(jī)不暢引發(fā)的全身癥狀。針灸是基于中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說的外治療法,常用于本病的康復(fù)治療。研究[12]表明,針灸對COPD患者的咳嗽、氣喘等癥狀的療效較佳,能夠改善肺通氣功能、提升免疫力。在臨床上,足太陽膀胱經(jīng)的肺俞和足陽明胃經(jīng)的足三里是針灸治療COPD選用頻率較高的腧穴[13]。COPD多屬于本虛標(biāo)實(shí)之證,治療上既要宣發(fā)肺氣以改善呼吸不暢,又要注重補(bǔ)虛扶正,以提升機(jī)體整體功能。《素問·咳論》指出“治臟者治其俞”,肺俞為肺的背俞穴,是治療肺系病癥之要穴。足三里是胃經(jīng)合穴,具有強(qiáng)壯保健的作用,是治療虛勞之證的常用穴位,如《針經(jīng)指南·流注通玄指要賦》記載:“三里卻五勞之羸瘦”,《醫(yī)學(xué)入門·治病要穴》云:“上、中、下部疾,無所不治”?,F(xiàn)代研究[14]發(fā)現(xiàn),在生理狀態(tài)下,針刺足三里穴可以增加肺通氣量和肺活量,在病理狀況下,可使呼吸階段的氣道阻力降低,也可有效防治小兒呼吸道感染。

      目前,研究認(rèn)為COPD發(fā)病機(jī)制與炎細(xì)胞浸潤、自身免疫機(jī)制減弱、遺傳等關(guān)系密切。COPD會(huì)促使氣管中的炎性細(xì)胞活化,導(dǎo)致TNF-α、IL-8等炎性因子水平上升,而這些炎性因子的水平與肺損傷的程度呈正相關(guān)。TNF-α能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),同時(shí)促進(jìn)炎性細(xì)胞的活化與浸潤作用,增加因炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸道黏液細(xì)胞高分泌狀態(tài),從而引發(fā)支氣管狹窄、收縮等氣道高反應(yīng)性[15-16]。IL-8能趨化中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞聚集于氣管,并進(jìn)一步刺激中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞至呼吸道,引起呼吸道炎癥和氣管阻塞[17]。TGF是具有強(qiáng)致纖維化作用的前炎性因子,可能影響炎癥因子的釋放及TGF-β/Smads信號(hào)通路,加重氣道炎性損傷及阻塞重構(gòu)[18]。當(dāng)機(jī)體受到炎性物質(zhì)、煙霧等刺激時(shí),單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞會(huì)增加TNF-α、IL-8等炎性因子的釋放,且升高TGF-β水平,而呼吸道因過多的炎性因子趨化聚集而導(dǎo)致氣道重塑,從而引發(fā)一系列的病理變化。TNF-α、TGF-β、IL-8三者在COPD呼吸系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了協(xié)同效應(yīng),共同參與了炎癥反應(yīng)的進(jìn)程,最終造成呼吸道阻塞和重塑[19-20]。

      本研究結(jié)果顯示,COPD模型大鼠肺通氣功能受到明顯損傷,肺活量、FEV0.1/FVC及FEV0.3/FVC均顯著降低(P<0.05或P<0.01),經(jīng)電針干預(yù)后,肺通氣功能得到改善(P<0.05或P<0.01);血清、肺泡灌洗液、肺組織內(nèi)TNF-α、TGF-α和IL-8含量明顯降低(P<0.01)。這些結(jié)果提示,電針可以改善COPD氣道通氣受限情況和呼吸困難癥狀,且有較好的抗炎作用,能夠抑制炎細(xì)胞活化和炎癥因子釋放,從而減少黏液分泌,通暢氣道?;诖?,認(rèn)為抑制TNF-α、TGF-β、IL-8的高表達(dá)狀態(tài)可能是針刺改善COPD呼吸道炎癥和氣道阻塞的效應(yīng)機(jī)制之一。然而本實(shí)驗(yàn)的大鼠模型需要進(jìn)行手術(shù)處理,手術(shù)會(huì)對大鼠的呼吸道造成損傷,并可能引起機(jī)體炎癥反應(yīng)及呼吸道感染,但是本實(shí)驗(yàn)缺少假手術(shù)對照組,未能有效排除手術(shù)創(chuàng)傷造成的影響,這是本次研究不足之處,未來進(jìn)一步研究需要完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以期更好地闡釋針刺干預(yù)COPD的效應(yīng)機(jī)制。

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      (本文編輯? 匡靜之)

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