基于網(wǎng)絡藥理學探討何首烏-丹參治療阿爾茨海默病的作用機制

楊夢琳 周小青 伍大華 張運輝 鄭彩杏 童天昊

〔摘要〕 目的 應用網(wǎng)絡藥理學方法預測何首烏-丹參抗阿爾茨海默病（AD）的作用靶點及相關信號通路，挖掘其抗AD的作用機制。方法 通過中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）網(wǎng)站檢索何首烏-丹參的活性成分及對應的作用靶點，再通過Drugbank數(shù)據(jù)庫、Dis Ge NET數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫獲得AD的主要致病靶點，采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡圖，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡，然后運用生物信息學的方法對關鍵靶點進行基因功能分析和通路富集分析，最后采用MTT法、ELISA法、比色法和實時熒光定量PCR法對網(wǎng)絡藥理學主要預測的生物過程與信號通路進行驗證。結(jié)果 研究共篩選出何首烏-丹參藥對的有效成分24個，對應靶點274個，與AD相關靶點共107個，相關信號通路前10條，GO分析相關度前20個靶點分子功能。細胞實驗證實了何首烏-丹參能有效提高PC12細胞的細胞存活率及抑制PC12細胞的炎癥反應和氧化應激反應，并促進Nrf2/HO-1信號通路的激活。結(jié)論 何首烏-丹參主要是通過抗炎和抗氧化應激對AD產(chǎn)生重要的治療作用，為后續(xù)臨床治療AD提供新的思路。

〔關鍵詞〕 何首烏;丹參;阿爾茨海默病;網(wǎng)絡藥理學;作用機制

〔中圖分類號〕R285? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.012

〔Abstract〕 Objective To predict he anti-Alzheimer's disease （AD） target and related signaling pathways， and explore the anti-AD mechanism of Heshouwu （Polygoni Multiflori Radix Praeparata）-Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） by network pharmacology. Methods The Chinese medicine system pharmacology technology platform （TCMSP） was used to search the active ingredients and corresponding targets of Heshouwu （Polygoni Multiflori Radix Praeparata）-Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma）. The Drugbank database， the Dis Ge NET database and the TTD database were used to obtain the main pathogenic targets of AD. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct the active ingredient-target network diagram. STRING database was used to construct the protein-protein interaction （PPI） network. The bioinformatics method was used to analyze the gene function and pathway enrichment analysis of key targets. Finally， the MTT， ELISA， colorimetry method and qRT-PCR were used to verify the main biological processes and signal pathways predicted by network pharmacology. Results A total of 24 active ingredients of Heshouwu （Polygoni Multiflori Radix Praeparata）-Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） were screened ， 274 corresponding targets， 107 targets related to AD， top 10 related signaling pathways， and top 20 target molecular functions by GO analysis. Cell experiments also proved that Heshouwu （Polygoni Multiflori Radix Praeparata）-Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） could effectively improve the cell survival rate of PC12 cells and inhibit inflammation and oxidative stress response of PC12 cells， and promote the activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway. Conclusion Heshouwu （Polygoni Multiflori Radix Praeparata）-Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） has an important therapeutic effect on AD mainly through anti-inflammatory and anti-oxidative stress， which provides a new idea for subsequent clinical treatment of AD.

〔Keywords〕 Heshouwu （Polygoni Multiflori Radix Praeparata）; Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma）; Alzheimer's

disease; network pharmacology; mechanism of action

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease， AD）是一種以認知功能下降、精神行為功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。隨著全球人口老齡化，AD發(fā)病率不斷升高，已成為現(xiàn)代醫(yī)學亟需解決的難題[2]。目前，西醫(yī)對AD病因及發(fā)病機制仍未完全闡明，尚無根治AD的藥物[3]。中醫(yī)通過辨病與辨證相結(jié)合，抓住AD病機特點，隨證加減用藥，在改善AD患者學習記憶等認知功能、提高生活和社會交往能力方面具有較確切的療效[4]。

前期運用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療AD證候組合中，以腎虛血瘀型最多，腎精虧虛、瘀血阻絡是AD的主要病機，補腎活血法是治療AD的基本方法[5]。提取腎虛血瘀型方劑核心藥對何首烏-丹參，采用網(wǎng)絡藥理學方法分析藥物的化學成分、靶點和通路之間的關系，試圖從整體層面揭示中藥治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1? AD核心藥對挖掘及其化學成分篩選

借助中國中醫(yī)科學院研制的中醫(yī)傳承輔助平臺（2.5版本）建立AD方劑數(shù)據(jù)庫并進行數(shù)據(jù)挖掘[6]，數(shù)據(jù)庫收集120位現(xiàn)代醫(yī)家的214個方劑，通過組方規(guī)律分析，獲得腎虛血瘀型方劑26個，涉及藥物164味，其中補腎藥中，何首烏出現(xiàn)20次，使用頻次最高;活血化瘀藥中，丹參出現(xiàn)16次，使用頻次最高。設置支持度為0.09，置信度為0.85時，何首烏-丹參配伍頻次最高（見表1）。關聯(lián)規(guī)則分析，出現(xiàn)何首烏時，出現(xiàn)丹參的概率為88.6%。因此，選取何首烏-丹參為腎虛血瘀型AD的核心藥對進行網(wǎng)絡藥理學分析。

1.2? 何首烏和丹參有效成分及其靶點的篩選

以“何首烏”“丹參”為關鍵詞，從TCMSP數(shù)據(jù)庫（中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）查詢何首烏-丹參2味中藥的有效成分，本研究基于ADME（藥物吸收、分布、代謝、排泄）模型，運用OBioavail 1.1來預測有效成分的口服利用度（oral bioavailability， OB），對何首烏-丹參的化學組分進行OB和類藥性（drug likeness， DL）篩選，并設置OB≥20%及DL≥18%作為篩選條件。借助美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（NCBI）和Uniprot數(shù)據(jù)庫，將物種限定為“Homo sapiens”，將靶點轉(zhuǎn)換成對應的基因。

1.3? AD疾病相關基因檢索

在Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）和TTD數(shù)據(jù)庫（https：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）中篩選治療AD的相關靶點，以“Alzheimer”為檢索關鍵詞，并對檢索到的靶點進行處理，之后將3個數(shù)據(jù)庫重復項去除從而獲得最終的疾病靶點。

1.4? 何首烏-丹參有效成分與AD共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡構(gòu)建

將何首烏-丹參有效成分的相關靶點和AD的靶點導入OmicShare平臺（https：//www.omicshare.com/）找出何首烏-丹參活性成分與AD的交集靶點，再將這些交集靶點導入到STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”進行操作，最小相互作用閥值設為“medium confidence=0.4”，得到PPI網(wǎng)絡，即“何首烏-丹參-靶點-AD”網(wǎng)絡。

1.5? 關鍵靶基因的篩選

應用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網(wǎng)絡進行拓撲屬性分析，計算PPI網(wǎng)絡整體的度（degree）、緊密度（closeness）和中介性（betweenness）”，以betweenness、closeness和degree的均數(shù)為“閾值”，選取betweenness、closeness和degree同時在閾值之上的靶點為“關鍵靶點”，明確PPI網(wǎng)絡中的關鍵靶點。

1.6? 關鍵靶基因的代謝通路與生物過程分析

為進一步研究何首烏-丹參抗AD的作用情況，采用Metascape平臺對何首烏-丹參的AD靶點群進行KEGG代謝通路富集分析，研究何首烏-丹參靶點的主要抗AD代謝通路;再進行GO分子功能富集分析，詮釋何首烏-丹參靶點的抗AD生物過程，Metascape的平臺列表與背景均選擇“Homo Sapiens”進行操作。篩選出AD與何首烏-丹參有效組分相關性前20的分子功能和前10的信號通路。

1.7? 網(wǎng)絡構(gòu)建

將何首烏-丹參有效成分、對應靶點導入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建何首烏-丹參有效成分-基因靶點網(wǎng)絡。

1.8? 體外驗證實驗

1.8.1? 細胞與試劑? 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞（長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，批號2015032007）;Aβ25-35（美國Sigma公司，批號053M4804V）;谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號A00512）、丙二醛（MDA，批號A00312）和超氧化物歧化酶（SOD，批號A00112）（均購自南京建成生物研究所）;ELISA測定試劑盒（南京建成生物研究所南京建成生物研究所，IL-1β批號Y16036021，TNF-α批號Y17036022，IL-6批號Y14036607）;Nrf2、HO-1引物合成（由上海生工生物工程有限公司提供）;qRT-PCR試劑盒（中國北京康為世紀公司，批號50445）;總RNA抽提試劑Trizol（中國北京康為世紀公司，批號36320）;DMEM細胞培養(yǎng)液（默飛世爾生物化學制品有限公司，批號SH3002201）;10%新生小牛血清（Hyclone Lab，批號220118612）;PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號SH30256）;FBS（吉泰遠成生物科技有限公司，批號10099141）。何首烏和丹參飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經(jīng)鑒定為正品。

1.8.2? 藥物制備? 采用水提醇沉法制備何首烏-丹參水提物：何首烏-丹參質(zhì)量比1∶2，水和藥材質(zhì)量比9∶1，煎煮3次，每次50 min，合并藥液，加入75%乙醇定容置于4 ℃冰箱過夜，過濾雜質(zhì)，低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到藥物干燥粉末（每克含生藥 3.6 g），4 ℃密封避光保存。

1.8.3? 細胞培養(yǎng)及分組干預? PC12細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS、1%P/S），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞貼壁后取對數(shù)生長期細胞，分為5組。對照組：加入不含 FBS、P/S的DMEM中孵育24 h;模型組：予Aβ25-35（20 umol/L）孵育24 h[7];何首烏-丹參低劑量組（20 μg/mL）、中劑量組（40 μg/mL）、高劑量組（80 μg/mL）孵育24 h。

1.8.4? MTT法檢測細胞存活率? 將5×MTT用稀釋液稀釋成1×MTT溶液;每孔加50 μ L1×MTT溶液，37 ℃孵育4 h;棄上清液，每個孔加入200 μL DMSO，在平板搖床上搖2～3 min使其均勻。酶標儀在570 nm波長處檢測每個孔PC12細胞的吸光度值。計算PC12細胞的存活率：

1.8.5? ELISA法檢測PC12細胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-α水平? PC12細胞以1×107接種于96孔板中，100 μL/孔，當80%融合時，分別給予各組處理因素，每組3個復孔。按實驗要求處理完成后，收集上清液留作待測標本。采用ELISA測定進行檢測，按照 ELISA測定試劑盒的說明進行操作。

1.8.6? 比色法檢測PC12細胞培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px和MDA? 冰上裂解細胞，離心，取上清，制成樣品溶液，按GSH-Px、MDA和SOD試劑盒說明書操作，檢測各項指標。

1.8.7? 實時熒光定量PCR法檢測PC12細胞上清液Nrf2、HO-1mRNA表達? Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測。預變性引物見表2。

1.8.8? 統(tǒng)計學處理? 實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，采用SPSS 24.0軟件做統(tǒng)計分析，組間差異比較用單因素方差分析統(tǒng)計，方差齊者用LSD檢驗（方差不齊者先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后使之方差齊），P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 何首烏-丹參有效成分的篩選

本研究共篩選出何首烏-丹參藥對中含有的24個有效化學組分，其中何首烏有效成分9個（HSW1-9），丹參有效成分15個（DS10-24）。見表3。

2.2? 有效成分-基因靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

將篩選后的24個有效組分及274個相關靶點導入 Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“有效成分-靶點網(wǎng)絡”（圖1）。24個橢圓形表示何首烏-丹參的有效成分，274個“V”形為有效成分作用靶點，共有1 610條邊代表靶點和化學成分之間的相互作用，體現(xiàn)了何首烏-丹參多成分、多靶點的特點。

2.3? AD相關基因

在Drugbank、DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫AD的靶基因，共得到2 245個基因。

2.4? 蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建圖

在Drugbank、DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫檢索AD的靶點與何首烏-丹參作用的靶點有107個重復，這107個靶基因可能為何首烏-丹參抗AD的靶點。為研究各靶點在體內(nèi)的相互作用關系，尋找核靶點，將潛在靶點蛋白群進行PPI網(wǎng)絡分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)107個靶蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生786條代表蛋白之間相互作用的邊。見圖2。

2.5? 核心靶點分析結(jié)果

Cytoscape 3.7.1計算得到，PPI網(wǎng)絡平均度值為15.5，平均介數(shù)為3.66×10-2，平均緊密度為0.52，度值、介數(shù)和緊密度均超過平均值的靶蛋白共8個，依次為GNB1、MAOB、SOD2、APP、Caspase-3、AKT1、GSK3β、MAPK1，說明以上8個靶點在PPI網(wǎng)絡中處于關鍵位置，很可能是何首烏-丹參抗AD的關鍵靶點。

2.6? KEGG和GO分析結(jié)果

通過GO數(shù)據(jù)庫分析，何首烏-丹參有效成分靶標與AD疾病靶標基因功能有炎癥反應、氧化應激反應、炎癥反應的負調(diào)節(jié)、老化、記憶、調(diào)亡過程等條目。見圖3。

通過KEGG數(shù)據(jù)庫富集何首烏-丹參治療AD關鍵靶標所參與的通路主要涉及Nrf2/HO-1信號通路、MAPK信號通路、Toll-like receptor信號通路、NF-κB信號通路、AD等，說明何首烏-丹參可能主要通過調(diào)控炎癥反應、氧化應激、凋亡信號通路來防治AD。

2.7? 各組PC12細胞存活率比較

與對照組比較，模型組的PC12細胞的存活率明顯降低，有顯著性差異（P<0.01）;與模型組相比，隨著何首烏-丹參濃度增加，PC12細胞存活率顯著上升（P<0.05，P<0.01），表明何首烏-丹參對PC12細胞具有明顯保護作用。見表4。

2.8? 各組PC12細胞上清液IL-1β、IL-6和TNF-？琢水平

何首烏-丹參作用PC12細胞24 h后，與對照組比較，模型組PC12細胞IL-1β、IL-6和TNF-？琢水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，何首烏-丹參中、高劑量組的PC12細胞IL-1β、IL-6和TNF-？琢水平均明顯降低（P<0.05，P<0.01），表明何首烏-丹參對PC12細胞的炎癥反應具有明顯的抑制作用。見表5。

2.9? 各組PC12細胞培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px和MDA比較

與對照組比較，模型組SOD、GSH-Px明顯活力降低，MDA含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，何首烏-丹參各組SOD、GSH-Px活力升高，MDA含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），表明何首烏-丹參對PC12細胞的氧化應激反應具有明顯的抑制作用。見表6。

2.10? 各組PC12細胞上清液Nrf2、HO-1 mRNA的表達

與對照組比較，模型組細胞Nrf2、HO-1 mRNA表達水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，何首烏-丹參各組能夠明顯提高Nrf2、HO-1 mRNA表達水平（P<0.05，P<0.01），說明何首烏-丹參能夠明顯促進Nrf2、HO-1基因的表達。見表7。

3 討論

AD屬于中醫(yī)學“癡呆”“呆證”等范疇，清代程國彭《醫(yī)學心悟》云：“腎主智，腎虛則智不足，故喜忘其前言”。腦為髓之海，腦髓的充養(yǎng)依靠腎的藏精，腎中精氣充盈，髓海得養(yǎng)[8]。張景岳在《景岳全書》中說：“凡心有瘀血，亦令健忘?！蹦I虛可致血瘀。而血瘀又進一步影響氣血運行，且“瘀血不去，新血不生”，血瘀可致血虛;又“精血同源”，血虛可致腎精衰少，因而血瘀也可致腎虛?，F(xiàn)代醫(yī)學研究亦表明腎虛與血瘀常相伴而行：腎虛時血液處于高凝狀態(tài)，腎虛者常兼有血液流變學及微循環(huán)不同程度的異常[9]。全血黏度、血漿比黏度、紅細胞電泳、纖維蛋白原等與年齡的增加呈正比，血液朝著濃、黏、凝、聚的方向變化發(fā)展，微循環(huán)障礙遍及全身，出現(xiàn)不同程度的血瘀[10]。故AD其本為腎虛，其標為血瘀，腎虛血瘀為其主要證型，補腎活血為基本治法。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘找出了治療腎虛血瘀型AD的一組核心藥對何首烏-丹參，該藥對是中醫(yī)臨床家廣泛使用的補腎活血藥物?！侗静菥V目》記載何首烏，氣溫，味苦澀，能固精益腎、養(yǎng)血益肝、健筋骨、烏須發(fā)，為滋補腎精良藥。據(jù)《何首烏錄》記載，何首烏能“長筋益精……延年”。丹參具有活血祛瘀、安神之功效?！兜崮媳静荨吩唬骸把a心定志，安神寧心，治健忘怔忡，驚悸不寐。”[11]何首烏、丹參配伍可補腎填精、活血化瘀，其功效契合AD腎虛血瘀的基本病機。研究借助系統(tǒng)藥理學、藥代動力學和生物信息學方法來確定何首烏-丹參的活性化合物及與AD相關的靶點和通路。通過TCMSP平臺的OB和DL篩選，獲得何首烏-丹參的24個化合物，其中何首烏的有效成分中二苯乙烯苷的活性最高，可以作用39個靶點，而在丹參中活性最高的是丹參酮IIA，作用靶點達到了36個。研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，二苯乙烯苷可降低BACE1、Caspase-3表達，減少Aβ產(chǎn)生，改善神經(jīng)元損傷，以及增加突觸相關蛋白的表達，從而發(fā)揮對AD的治療作用。研究[14-15]顯示，丹參酮IIA可抑制小膠質(zhì)細胞增生，并進一步降低IL-1β、TNF-α炎性細胞因子的表達以及抑制Tau蛋白過度磷酸化對抗神經(jīng)細胞凋亡，從而發(fā)揮治療AD的作用。

將潛在有效成分和AD共同靶點相映射，得到藥物-疾病共同作用靶點107個。關鍵靶點居前三位的是GNB1、MAOB、SOD2。GNB1參與炎癥趨化因子調(diào)節(jié)通路，研究發(fā)現(xiàn)GNB1介導Akt信號轉(zhuǎn)導并促進NF-κB的活化[16]。MAOB基因的異常表達或突變與AD的發(fā)生具有密切關系[17]。MAOB活性下降有利于保持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，對機體的抗氧化及抗衰老有促進作用[18]?；趯寡趸瘧p傷的AD治療研究中發(fā)現(xiàn)，SOD-2基因多態(tài)性與AD的發(fā)生發(fā)展有關[19]。GO富集分析結(jié)果表明，“何首烏-丹參”藥對的作用靶點分布在多種細胞組分中，以胞質(zhì)為主，通過多種結(jié)合方式參與生物進程，包括炎癥反應、氧化應激反應、凋亡過程、積極調(diào)節(jié)白細胞激活等。隨著近年對AD發(fā)病機制的研究，許多學者指出，腦內(nèi)炎性反應是AD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[20]。氧化應激反應在AD的發(fā)生和發(fā)展的過程中扮演著極其重要的角色[21]。在本研究篩選出的信號通路中，與何首烏-丹參有效靶點的關聯(lián)度最高的是Nrf2/HO-1信號通路。研究發(fā)現(xiàn)[22-24]，Nrf2/HO-1信號通路是調(diào)控AD過程中炎癥反應、氧化應激的重要信號通路，Nrf2/HO-1信號通路的激活可以顯著增加大腦皮質(zhì)和海馬組織的抗炎和抗氧化應激反應能力，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

為了驗證網(wǎng)絡藥理學的分析結(jié)果，本研究選擇了何首烏-丹參對Aβ25-35誘導的PC12細胞的細胞存活率、炎癥反應、氧化應激反應、Nrf2/HO-1信號通路的調(diào)控作用進行了實驗驗證。驗證結(jié)果表明何首烏-丹參能有效抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞的炎癥反應、氧化應激反應，并提高其細胞存活率，上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路，最終抑制AD的發(fā)展。

綜上，何首烏-丹參具有多成分、多靶點協(xié)同治療AD的作用。本文基于系統(tǒng)藥理學研究何首烏-丹參對AD的具體作用靶點及機制，對今后臨床運用中藥治療AD具有重要指導意義。

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（本文編輯? 蘇? 維）