基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三物白散治療胃癌的分子機(jī)制及初步驗(yàn)證

婁余 朱瑩 彭瑤 王燚霈 易書林

〔摘要〕 目的 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接探討三物白散治療胃癌的作用機(jī)制，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對相關(guān)靶點(diǎn)作初步驗(yàn)證。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取三物白散的活性成分及潛在靶點(diǎn);通過Genecards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫，收集胃癌相關(guān)的作用靶點(diǎn);將三物白散潛在靶點(diǎn)與胃癌靶點(diǎn)相匹配，獲得三物白散抗胃癌的作用靶點(diǎn)，使用STRING數(shù)據(jù)庫對作用靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選核心靶點(diǎn);用R語言對作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過程和KEGG通路富集分析;采用Auto Dock Vina軟件對核心靶點(diǎn)與對應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對接;運(yùn)用qPCR驗(yàn)證三物白散對胃癌細(xì)胞SGC-7901中Caspase-3、Caspase-7作用靶點(diǎn)的調(diào)控作用。結(jié)果 經(jīng)篩選獲得三物白散活性成分17個(gè)，三物白散作用靶點(diǎn)84個(gè)，經(jīng)拓?fù)浞治龅玫?2個(gè)核心作用靶點(diǎn)，包括TP53、AKT1、MAPK1、JUN、CASP3等。三物白散作用靶點(diǎn)涉及PI3K-AKT、p53、HIF-1、IL-17等多條信號(hào)通路，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)缺氧及炎性微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用。分子對接結(jié)果表明，活性成分與核心靶點(diǎn)有良好的結(jié)合能力。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，三物白散可上調(diào)凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Caspase-7的表達(dá)，這在一定程度上證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測及指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可靠性。結(jié)論 本研究結(jié)果體現(xiàn)了三物白散多成分、多靶點(diǎn)、多通路的治療特點(diǎn)，系統(tǒng)地揭示了其抗胃癌的藥效物質(zhì)、核心靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為后續(xù)深入研究作用機(jī)制提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕 胃癌;三物白散;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用靶點(diǎn);分子對接;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.013

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of Sanwubai Powder in the treatment of gastric cancer based on network pharmacology combined with molecular docking， and to preliminarily verify the related targets by in vitro cell experiments. Methods TCMSP was used to screen and predict the compounds and targets in Sanwubai Powder. Targets related to gastric cancer were collected by GeneCards， OMIM and TTD databases. The potential targets of Sanwubai Powder were matched with the targets of gastric cancer to obtain the anti-gastric cancer targets of Sanwubai Powder， STRING was used to analyze the protein-protein interaction of targets， PPI network was structured and then the core targets were screened by using topology analysis. GO biological process analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed by R language. Auto Dock Vina software was used to dock the core targets with the active ingredients. qPCR was used to verify the regulatory effects of Sanwubai Powder on the targets of Caspase-3 and Caspase-7 in gastric cancer cells SGC-7901. Results 17 active components were screened， and 12 hub targets of 84 targets including TP53， AKT1， MAPK1， JUN and CASP3 were obtained of Sanwubai Powder. The targets of Sanwubai Powder involved PI3K-Akt， p53， HIF-1， IL-17 signal pathways， which played an anti-tumor role by inducing cell apoptosis， inhibiting cell proliferation， regulating hypoxia and inflammatory microenvironment. The results of molecular docking showed that active ingredients had good binding capacity with targets. The results of in vitro experiments confirm that， Sanwubai Powder could up-regulate the expression of apoptosis-related molecules Caspase-3 and Caspase-7， which to a certain extent confirmed the reliability of network pharmacological prediction and experimental design guidance. Conclusion The results of this study reflected the therapeutic characteristics of Sanwubai Powder with multiple components， multiple targets and multiple pathways， revealed the active components， key targets and important pathways of Sanwubai Powder in the treatment of gastric cancer， and provided research ideas and reference basis for further discussion on the mechanism of action.

〔Keywords〕 gastric cancer; Sanwubai Powder; network pharmacology; effect target; molecular docking; in vitro cell experiment

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)全國腫瘤登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國胃癌的發(fā)生率及病死率位居各類腫瘤的第二位[1]，已嚴(yán)重危害了人們的生命和健康。目前，胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但不可否認(rèn)的是，胃癌的發(fā)生發(fā)展是由癌基因和抑癌基因大量遺傳改變積累而成，導(dǎo)致多種信號(hào)通路失調(diào)，擾亂細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖與死亡的平衡[2]。在治療上，早期胃癌缺乏特異性的癥狀與體征，導(dǎo)致其早期檢出率較低，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于進(jìn)展期，治療效果不佳，且無論是放化療，還是靶向治療，毒副作用都較大，嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量，甚至可能因不能耐受而被迫終止治療。

中醫(yī)藥治療胃癌具有獨(dú)特優(yōu)勢，其在減輕化療不良反應(yīng)、增強(qiáng)療效、改善生存質(zhì)量、延長生存期等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。中醫(yī)學(xué)基于胃癌臨床癥狀，將其歸于“噎膈”“反胃”“積聚”等范疇，認(rèn)為胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)邪正斗爭、正邪力量不斷變化的過程，進(jìn)展期胃癌表現(xiàn)為邪盛為主，兼顧正虛。在治療上，醫(yī)家張從正認(rèn)為“醫(yī)之道，損有余乃所以補(bǔ)其不足”“不補(bǔ)之中有真補(bǔ)存焉”，突出強(qiáng)調(diào)了“祛邪以扶正”的治療原則[5]。三物白散是溫下攻邪的代表方，出自《傷寒論·辨太陽病脈證并治》：“寒實(shí)結(jié)胸，無熱證者，與三物白散”，方中巴豆溫通寒實(shí)、攻逐痰水;貝母消痰散結(jié);桔梗宣暢氣機(jī)，輔以祛痰，共奏溫下逐瘀、消痰散結(jié)之功。前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，三物白散治療胃癌具有確切的臨床療效，相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究[7]證實(shí)了該復(fù)方能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，但其抗癌作用的分子機(jī)制尚未完全闡明。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的整體性作用特點(diǎn)，其作用機(jī)制的研究較為復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是發(fā)展于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)基礎(chǔ)上的，利用多種數(shù)據(jù)庫平臺(tái)及計(jì)算機(jī)軟件，構(gòu)建藥物成分、作用靶點(diǎn)、疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其整體性的研究策略與中醫(yī)學(xué)整體觀的理念不謀而合[8-9]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)地預(yù)測三物白散治療胃癌的活性成分、潛在靶點(diǎn)、信號(hào)通路，利用分子對接法初步模擬成分與靶點(diǎn)的結(jié)合，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，為后續(xù)深入研究提供參考依據(jù)。

1 資料

1.1? 主要材料及試劑

人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司;SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（動(dòng)物合格證號(hào)：43004700030743），飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[場地許可證號(hào)：SKY（湘）2013-0005]。

二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：D8370）;MTT試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：M8180）;Giemsa染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1010）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega公司，批號(hào)：A3500）;q-PCR mix（promega公司，批號(hào)：A6001）。三物白散混懸液由巴豆霜（含10%油）、浙貝母、桔梗以1∶3∶3組成，所需飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房。

1.2? 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（德國 Eppendorf公司，型號(hào)：Galaxy 48 R）;超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1FD）;倒置顯微鏡（德國ZEISS公司，型號(hào)：Axio Vert.A1）;多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司，型號(hào)：Cytation3）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司，型號(hào)：Fresco17）;實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX Connect）。

2 方法

2.1? 活性成分的篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索三物白散方中巴豆、浙貝母、桔梗3味藥物的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和化合物類藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)[10]，選出三物白散方中具有較高活性的成分。利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），收集與校對活性成分的名稱，下載對應(yīng)的活性成分信息，以3D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式，以備分子對接。

2.2? 作用靶點(diǎn)的篩選

2.2.1? 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測? 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取三物白散活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），限定物種為“Homo sapiens”，對靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化基因注釋。

2.2.2? 胃癌靶點(diǎn)篩選? 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：//www.omim.org/）和TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）三大數(shù)據(jù)庫中輸入檢索詞“gastric cancer”，收集胃癌相關(guān)的非重復(fù)靶基因。

2.2.3? 作用靶點(diǎn)篩選? 將胃癌相關(guān)靶點(diǎn)與藥物活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得三物白散治療胃癌的作用靶點(diǎn)，用作后續(xù)分析。

2.3? “藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件將藥物活性成分與疾病作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，構(gòu)建藥物活性成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，其中“節(jié)點(diǎn)（node）”代表活性成分、作用靶點(diǎn)，“邊（edge）”代表節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系，進(jìn)而分析出主要的藥物活性成分。

2.4? 蛋白相互作用（PPI）和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

2.4.1? PPI網(wǎng)絡(luò)? 利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）分析作用靶點(diǎn)，選擇Multiple Protein，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定combined score>0.7，將獲得的信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，進(jìn)一步篩選獲得核心靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲞^程見方法“2.4.2”項(xiàng)。

2.4.2? 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治? 將方法“2.4.1”項(xiàng)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，根據(jù)3個(gè)主要參數(shù)度（DC）、度介中心度（BC）和接近中心度（CC）大于中位數(shù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選核心靶點(diǎn)。

2.5? 作用靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

應(yīng)用R軟件對疾病與藥物共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，將富集結(jié)果以柱狀圖形式呈現(xiàn)，分析其涉及的主要生物學(xué)過程。并應(yīng)用R軟件對以上靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，將結(jié)果以氣泡圖形式呈現(xiàn)，并根據(jù)P值的大小分析核心通路富集程度，以探討三物白散抗胃癌的可能作用機(jī)制。

2.6? 分子對接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊蠛Y選出的核心靶蛋白作為核心受體蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）中輸入靶蛋白名稱，設(shè)置ORGANISM為“Homo sapiens”，選取分辨率高的靶蛋白三維結(jié)構(gòu)。使用Pymol軟件對原受體蛋白pdb文件去除水分子及原配體分子，將處理后的受體和配體的pdb文件導(dǎo)入Auto Dock Tools，進(jìn)行常規(guī)處理，保存為pdbqt的格式文件，再用Auto Grid得到對接位點(diǎn)參數(shù)，運(yùn)行Auto Dock Vina[11]進(jìn)行分子對接。以最低結(jié)合能作為靶蛋白和配體對接的結(jié)果，使用Pymol軟件進(jìn)行分析及可視化。

2.7? SGC-7901細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1? 含藥血清制備? 將20只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白對照組和三物白散組，每組10只。參照課題組前期研究的方法[12]進(jìn)行含藥血清制備：三物白散組按0.07 g/kg劑量灌胃，空白對照組給予等體積生理鹽水灌胃，1 次/d，連灌7 d。于末次給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃下靜置4 h，以3 000 r/min離心20 min，分離血清。經(jīng)56 ℃水浴鍋滅活30 min后，經(jīng)0.22 ？滋m微孔濾膜無菌過濾后，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.2? 細(xì)胞培養(yǎng)? SGC-7901細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞生長至70%～80%開始傳代，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7.3? MTT法檢測細(xì)胞增殖活性? SGC-7901細(xì)胞分為空白對照組與三物白散組，空白對照組加入含5%空白對照組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基;三物白散組加入含5%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，每孔加5 mg/mL MTT試劑10 ？滋L，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱孵育4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 ？滋L，振蕩10 min。在490 nm波長下用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度（OD）值。

2.7.4? Giemsa染色法檢測細(xì)胞克隆形成? 將SGC-7901細(xì)胞以500個(gè)/孔接種到6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)方法同上。當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，PBS浸洗細(xì)胞2次，甲醇固定5 min，Giemsa染色30 min，沖去染色液，室溫下干燥。在顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞克隆數(shù)。

2.7.5? q-PCR法檢測Caspase-3、Caspase-7 mRNA的表達(dá)? 提取各組細(xì)胞總RNA，按試劑盒指導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Caspase-3上游引物為5-TGGAAGCGAATCAATGGACTCTGG-3，下游引物為5-CCAGACCGAGATGTCATTCCAGTG-3，擴(kuò)增片段為132 bp;Caspase-7上游引物為5-GCTGACTTCCTCTTCGCCTATTCC-3，下游引物為5-TGCCTGGCAACTCTGTCATTCAC-3，擴(kuò)增片段為167 bp。β-actin上游引物為5-TATGACTT GTTGCGTTACAC-3，下游引物為5-CCTTCCCGTTCAGTTT-3，擴(kuò)增片段為155 bp。按如下程序擴(kuò)增：94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，×40 cycle。導(dǎo)出CT值，采用2-？葒？葒CT法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

2.7.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 活性成分及作用靶點(diǎn)

通過檢索TCMSP共檢索到三物白散方中化學(xué)成分158個(gè)，其中包括桔梗102個(gè)，浙貝母17個(gè)，巴豆39個(gè)。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選出18個(gè)化學(xué)成分，去重后得到17個(gè)活性成分。見表1。

3.2? 作用靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共得到三物白散活性成分潛在作用靶點(diǎn)176個(gè)，其中巴豆35個(gè)、桔梗85個(gè)、浙貝母56個(gè)，剔除重復(fù)部分，共有潛在靶點(diǎn)90個(gè)。利用Genecards、OMIM、TTD 3個(gè)數(shù)據(jù)庫分別獲得8 611、170、37個(gè)與胃癌相關(guān)的疾病靶基因，整合數(shù)據(jù)并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，獲得與胃癌相關(guān)的靶點(diǎn)共8 633個(gè)。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，最終收集84個(gè)共同作用靶點(diǎn)用于后續(xù)分析。見圖1。

3.3? “藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步分析三物白散中發(fā)揮抗胃癌的關(guān)鍵活性成分，應(yīng)用Cytoscape軟件將11個(gè)藥物成分與84個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，構(gòu)建“藥物成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖2），共包括95個(gè)節(jié)點(diǎn)（藥物活性成分11個(gè)，作用靶點(diǎn)84個(gè)）和134條邊，結(jié)果顯示三物白散關(guān)鍵作用成分有木犀草素（luteolin，與51個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)），？茁-谷甾醇（beta-sitosterol，與25個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)），金合歡素（acacetin，與21個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）及天竺葵素（pelargonidin，與13個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)），這些關(guān)鍵作用成分主要是黃酮類和甾醇類。

3.4? PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將84個(gè)共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，得到靶蛋白間互作關(guān)系，節(jié)點(diǎn)數(shù)（靶點(diǎn)蛋白）78個(gè)，邊數(shù)（蛋白間相互作用）441條，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。并采用CytoNCA插件，根據(jù)DC、BC、CC對此網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯x取大于中位值的靶點(diǎn)構(gòu)建三物白散抗胃癌的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。對由78個(gè)節(jié)點(diǎn)和441條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選，經(jīng)過第1次篩選（DC≥10，BC≥25.581 7，CC≥0.450 2）初步得到含26個(gè)節(jié)點(diǎn)和172條邊的互作網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)過第2次篩選（DC≥12，BC≥5.003 9，CC≥0.657 9）得到含12個(gè)節(jié)點(diǎn)和57條邊的核心作用網(wǎng)絡(luò)（圖3），12個(gè)核心靶點(diǎn)信息詳見表2。

將12個(gè)核心靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)進(jìn)一步構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，按節(jié)點(diǎn)大小降序排序（圖4），節(jié)點(diǎn)越大說明該靶點(diǎn)連接的節(jié)點(diǎn)越多，在網(wǎng)絡(luò)中作用越重要，如TP53、AKT1、MAPK1、JUN、CASP3、CCND1等，可作為三物白散抗胃癌的潛在作用靶點(diǎn)。

3.5? GO功能富集分析

應(yīng)用R軟件對共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到柱狀圖（圖5），主要涉及外源性凋亡信號(hào)通路、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)、肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等生物學(xué)過程，體現(xiàn)了三物白散抗胃癌作用可能通過調(diào)控多種生物學(xué)過程協(xié)同作用的結(jié)果。

3.6? KEGG通路富集分析

為了揭示三物白散對胃癌的抗癌作用機(jī)制，應(yīng)用R軟件對篩選出的84個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，節(jié)點(diǎn)的大小表示富集到該通路的靶點(diǎn)數(shù)目，節(jié)點(diǎn)越大表示靶點(diǎn)富集數(shù)目越多;節(jié)點(diǎn)的顏色由藍(lán)色至紅色表示P值大到小，故紅色節(jié)點(diǎn)越大表明信號(hào)通路的顯著性越高，作用越重要。圖6中列出了排名前30的信號(hào)通路，包括PI3K-Akt、p53、HIF-1及IL-17等涉及調(diào)控細(xì)胞凋亡、缺氧代謝、免疫炎癥等的信號(hào)通路，提示了三物白散可通過多條通路發(fā)揮抗胃癌作用，且作用靶點(diǎn)可作用于多條通路發(fā)揮作用，通路間存在著較為復(fù)雜的交互作用。

3.7? 分子對接結(jié)果分析

利用Auto Dock Vina軟件，將12個(gè)核心靶蛋白與對應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表2，結(jié)合能<-5.0 kcal/mol，表明靶蛋白與活性成分結(jié)合性好，且結(jié)合能越小表明兩者對接越好[13]。TP53與luteolin、AKT1與luteolin、MAPK1與luteolin、JUN與luteolin、CASP3與beta-sitosterol、CCND1與luteolin、EGFR與luteolin、AR與luteolin、VEGFA與luteolin、ESR1與6-Methoxyl-2-acetyl-3-methyl-1，4-naphthoquinone-8-O-beta-D-glucopyranoside、RELA與acacetin、MMP9與luteolin為靶蛋白與活性成分對接最好的組合。見圖7。

3.8? 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

3.8.1? 細(xì)胞活性檢測結(jié)果? MTT檢測結(jié)果表明，與空白對照組比較，三物白散組細(xì)胞增殖活性明顯降低（P<0.05）。見圖8。

3.8.2? 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對照組比較，三物白散組SGC-7901細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著降低（P<0.05）。見圖9。

3.8.3? 靶基因Caspase-3、Caspase-7 mRNA的表達(dá)? 與空白對照組相比，三物白散組Caspase-3、Caspase-7 mRNA的表達(dá)量顯著增高（P<0.05）。見圖10。

4 討論

研究[7，14-15]發(fā)現(xiàn)，三物白散可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、拮抗多藥耐藥、減少免疫抑制因子釋放等方面抑制胃癌發(fā)展，并能在整體水平上發(fā)揮抗腫瘤免疫正相調(diào)節(jié)作用，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法，對三物白散抗胃癌的藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

通過構(gòu)建藥物活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)及對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫胶诵陌悬c(diǎn)及相作用的藥物活性成分關(guān)系，利用分子對接法對兩者進(jìn)行初步模擬驗(yàn)證，證實(shí)其具有良好的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)木犀草素、金合歡素、β-谷甾醇、天竺葵素等可能是三物白散抗胃癌作用的關(guān)鍵藥效成分。木犀草素具有抑制胃癌細(xì)胞集落形成、遷移、侵襲及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，參與調(diào)控胃癌細(xì)胞PI3K/AKT等信號(hào)通路[16]。β-谷甾醇可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA和蛋白的表達(dá)相關(guān)[17]。金合歡素可通過線粒體通路，即金合歡素減少Bcl-2表達(dá)，Bax/Bcl-2比例上調(diào)，引發(fā)線粒體膜電位的喪失，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，啟動(dòng)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。天竺葵素具有抗細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)化的防御作用，其分子機(jī)制可能是通過Nrf2啟動(dòng)子去甲基化激活Nrf2-ARE防御途徑[19]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)活性成分可作用多個(gè)靶蛋白，一個(gè)靶蛋白亦能同時(shí)被多個(gè)活性成分干預(yù)，不同靶蛋白之間可通過直接或間接作用組成強(qiáng)大的互作網(wǎng)絡(luò)，充分說明了三物白散是通過多種活性成分作用于多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗癌效應(yīng)。

通過對靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析，其涉及的生物學(xué)過程主要有凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)、肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等。靶點(diǎn)通路富集分析結(jié)合已有研究發(fā)現(xiàn)[20-23]，胃癌的發(fā)生發(fā)展與PI3K-AKT、p53、HIF-1、IL-17等多條信號(hào)通路相關(guān)。細(xì)胞異常增殖、凋亡抑制在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，PI3K-AKT信號(hào)通路對細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用，PI3K和AKT蛋白激活后可促進(jìn)下游抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)增強(qiáng)，其異?？蓪?dǎo)致包括胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[24-25]。p53是人體內(nèi)與腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，具有重要的促使細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的功能[26-27]，故可介導(dǎo)2條信號(hào)通路：其一，是p53能轉(zhuǎn)錄上調(diào)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子p21的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯[28];其二，是通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，使Bcl-2/Bax蛋白比例下降，進(jìn)而激活線粒體通路中的Caspase-9和Caspase-3，觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[29-30]。缺氧在腫瘤的發(fā)展和進(jìn)程中起著重要作用，HIF-1信號(hào)通路對血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞特異性反應(yīng)，已證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的HIF-1α，可上調(diào)促血管生成因子VEGF的表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成，發(fā)揮促癌作用[31]。炎癥細(xì)胞因子IL-17在炎癥相關(guān)癌變中發(fā)揮重要作用，其可通過JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[32-33]。因此，推測三物白散活性成分可能通過靶向作用于介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、缺氧及炎性微環(huán)境的關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮抗胃癌作用。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究[12]結(jié)果證實(shí)，三物白散具有抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抑制其遷移的作用。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對三物白散的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要涉及對凋亡信號(hào)通路的調(diào)控，細(xì)胞凋亡抵抗是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，Caspase家族對細(xì)胞凋亡具有十分重要的作用，在預(yù)測的藥物作用靶點(diǎn)中涉及多個(gè)Caspase家族成員，有Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8及Caspase-9，其中Caspase-8和Caspase-9屬于細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)分子[34-35]，Caspase-3和Caspase-7是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子[36]。經(jīng)qPCR法驗(yàn)證，三物白散可上調(diào)Caspase-3和Caspase-7 mRNA的表達(dá)，在一定程度上驗(yàn)證了本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，預(yù)測了三物白散抗胃癌的藥效物質(zhì)、作用靶點(diǎn)，系統(tǒng)分析了其潛在的分子機(jī)制，充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同治療的獨(dú)特優(yōu)勢。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果有一定的可靠性，為后續(xù)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研發(fā)新藥、推廣臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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（本文編輯? 匡靜之）