高鳴鄉(xiāng)，蔣佩文，李敏惠，楊 平，代 敏

1成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學院；2成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；3成都醫(yī)學院科研實驗中心；4成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院,成都 610500

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常見的惡性腫瘤之一。國際癌癥研究機構(International Agency For Research on Cancer，IARC)估計，2020年全球將有910,677例新增的NPC病例，且763 570 000例患者或將死于這種癌癥[1]。據WHO統(tǒng)計，約80%NPC發(fā)生在中國，嚴重危害人民健康和生命安全，是中國重點防治的惡性腫瘤之一[2]。目前，放射和化學藥物治療是其主要的治療手段，而局部復發(fā)及遠處轉移又是治療失敗的主要原因[3]；治療鼻咽癌的藥物主要有紫杉醇類、順鉑、5-氟尿嘧啶、西妥昔單抗[4,5]等，但這些抗腫瘤藥物多為非特異性藥物，伴有淋巴細胞減少、黏膜炎、咽喉/口腔疼痛、貧血、皮疹等毒副作用[6]。因此，為了更有效的治療鼻咽癌，學者們致力于靶向性強、毒副作用小的抗鼻咽癌的新型天然藥物研發(fā)。

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire)為姜科豆蔻屬植物草果的干燥成熟果實，主產于廣西、云南、貴州等地，是我國重要的藥食兩用植物[7]；中醫(yī)認為其具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效，主治寒濕內阻，痞滿嘔吐，瘧疾寒熱，瘟疫發(fā)熱等癥狀，廣泛用于治療痔瘡、咽喉感染、消化系統(tǒng)疾病、惡心和腹痛等病癥[8,9]?，F代研究表明，草果具有降脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、防霉和抗炎鎮(zhèn)痛等生物活性[10]。草果揮發(fā)油作為草果重要的活性成分，其包含1，8-桉葉素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香葉酯、芳樟醇、反-橙花叔醇、β-月桂烯等，具有抗氧化、調節(jié)胃腸、抗菌、抗腫瘤及改變藥物通透性等生物活性[11]，但其在抗腫瘤活性方面的研究較少，目前僅有草果揮發(fā)油抗肝癌的研究[12]，而關于草果揮發(fā)油抑制鼻咽癌的相關研究尚無報道?；诖耍狙芯繑M通過探討草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞增殖的抑制作用，闡釋其作用機制，為草果揮發(fā)油在抗鼻咽癌等腫瘤的開發(fā)與應用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 藥物

草果購自北京同仁堂，產于云南，由成都醫(yī)學院生藥學專家李弈教授鑒定為草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemaire)。

1.2 腫瘤細胞

鼻咽癌6-10B細胞，四川大學生物治療國家重點實驗室饋贈，已在原實驗室完成細胞STR鑒定，保存于成都醫(yī)學院科研實驗中心。

1.3 主要試劑

胎牛血清(Cat.No.10100147)、DMEM基礎培養(yǎng)基(Cat.No.11965-092)(Gibco公司)；CCK-8檢測試劑盒(Cat.No.CK04)(日本同仁化學研究所)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(Cat.No.KGA108-2)(凱基生物公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(Cat.No.MAK160)、蛋白酶抑制劑Cocktail(Cat.No.11206893001)(Roche公司)；通用蛋白裂解液(百泰克生物公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Cat.No.7780)、抗GAPDH(Cat.No.5174)、促凋亡及抗凋亡BCL-2家族抗體試劑盒(Cat.No.5023、Cat.No.2933、Cat.No.4223、Cat.No.2764)、抗Caspase-3(Cat.No.14220)、抗PARP(Cat.No.9542)、抗Caspase-7/9(Cat.No.12827、Cat.No.9502)、抗cleaved Caspase-7/9抗體(Cat.No.8438、Cat.No.52873)和羊抗兔IgG抗體(Cat.No.7074)(Cell Signaling Technology公司)。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜(Thermo公司)；低溫離心機和高速離心機(Eppendorf公司)；水平離心機(浙江湘儀公司)；超純水機Direct Q5(Millipore公司)；酶標儀(Bioteke公司)；流式細胞儀NovoCyte(ACEA公司)。

2 實驗方法

2.1 草果揮發(fā)油的提取及其制備

草果揮發(fā)油采用水蒸氣蒸餾法提取[13]，密度ρ=929 mg/mL。采用吐溫-80進行乳化，乳化后用無菌超純水進行稀釋。

2.2 草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞的增殖抑制試驗

預試驗篩選草果揮發(fā)油抑制鼻咽癌6-10B細胞增殖活性的濃度，確定具有增殖抑制活性的5個不同濃度(0.058、0.12、0.23、0.46和0.93 mg/mL)。采用上述5個不同濃度的草果揮發(fā)油處理鼻咽癌6-10B細胞24 h，CCK-8法[14]檢測草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞的抑制情況，并用GraphPad Prism 7繪制鼻咽癌6-10B細胞的生長抑制曲線。

2.3 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡檢測

用上述5個不同濃度草果揮發(fā)油處理鼻咽癌6-10B細胞24 h，倒置顯微鏡下(20×物鏡)觀察鼻咽癌6-10B細胞形態(tài)變化。綜合分析細胞增殖抑制活性、細胞毒性和形態(tài)學結果，選擇明顯引起細胞凋亡的3個不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理，探討其作用機制。采用Annexin V/PI雙染法[15]，通過流式細胞儀檢測經3個不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細胞24 h后，對鼻咽癌6-10B腫瘤細胞的凋亡誘導效應，以未處理組為空白對照。

2.4 草果揮發(fā)油作用鼻咽癌6-10B細胞后線粒體膜電位檢測

JC-1是一種用于檢測線粒體膜電位的陽離子親脂性熒光探針[16]，可通過流式細胞儀檢測胞內熒光強度來監(jiān)測線粒體膜電位的改變。3個不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細胞24 h，JC-1染色，流式細胞儀檢測鼻咽癌6-10B細胞線粒體膜電位的變化情況，以未處理組為空白對照。

2.5 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡的蛋白檢測

3個不同濃度的草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細胞24 h后，采用Western blot法[17]，分析凋亡通路相關蛋白PARP、Caspase-3/7/9及其cleaved片段，以及線粒體途徑凋亡相關蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL等表達情況，以未處理組為對照。

3 實驗結果

3.1 草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞的增殖抑制作用

結果顯示，草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞具有增殖抑制作用，且呈劑量依賴性，24 h的IC50為0.14 mg/mL(見圖1)。

圖1 草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞的生長抑制曲線Fig.1 Growth inhibition curve of nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells treated by A.tsaoko essential oil

3.2 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡

3個不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理后，鼻咽癌6-10B細胞可見典型的細胞凋亡現象，即細胞皺縮、變圓，核染色質致密深染，形成致密質塊，細胞膜完整但出現發(fā)泡現象，晚期可見凋亡小體(見圖2B)。而草果揮發(fā)油在較高濃度(0.93和0.46 mg/mL)呈細胞毒性作用，鼻咽癌6-10B細胞呈現死亡現象，貼壁細胞出現完全脫落、變形和膜破裂(見圖2C)。

圖2 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞形態(tài)學變化Fig.2 Morphological change on nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：空白對照組；B：0.23 mg/mL草果揮發(fā)油；C：0.46 mg/mL草果揮發(fā)油。Note:A:Blank control;B:0.23 mg/mL A.tsaoko essential oil;C:0.46 mg/mL A.tsaoko essential oil.

形態(tài)學結果顯示，高濃度(0.93 mg/mL和0.46 mg/mL)草果揮發(fā)油使6-10B細胞破碎裂解，發(fā)揮明顯的細胞毒作用；而在較低濃度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)草果揮發(fā)油作用下，鼻咽癌6-10B細胞呈現凋亡誘導現象。進一步用Annexin V/PI雙染法、流式細胞術驗證藥物的凋亡誘導效應，結果顯示：不同濃度草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)對鼻咽癌6-10B細胞具有明顯誘導腫瘤細胞凋的作用，其中凋亡細胞所占比例分別為47.51%、33.91%、23.22%(對照組為2.76%)，呈典型劑量依賴性(見圖3)。

圖3 草果揮發(fā)油對鼻咽癌6-10B細胞的凋亡誘導作用Fig.3 Apoptosis in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：不同濃度草果揮發(fā)油作用6-10B細胞 24 h后的凋亡檢測圖；B：凋亡率的統(tǒng)計學分析(*P<0.05)。Note:A is the apoptosis detection diagram of 6-10B cells exposed to different concentrations of A.tsaoko essential oil for 24 h;B is a statistical analysis of the apoptotic rate (*P<0.05).

3.3 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡蛋白改變

用對6-10B細胞具有凋亡誘導效應的草果揮發(fā)油作用濃度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)處理鼻咽癌6-10B細胞24 h，Western blot法分析凋亡通路相關蛋白PARP和Caspase-3/7/9及其cleaved片段的表達情況。發(fā)現鼻咽癌6-10B細胞PARP和Caspase-7/9的cleaved片段表達明顯增加，較空白對照組具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)(見圖4)。

圖4 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡相關蛋白差異表達Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：草果揮發(fā)油作用6-10B細胞24 h后凋亡標志性蛋白表達；B：蛋白表達的數據統(tǒng)計學分析(*P<0.05)。Note:A shows the expression of apoptotic marker proteins after treatment with Amomum tsaoko essential oil was applied to 6-10B cells for 24 h;B is the data statistical analysis of protein expression (*P<0.05).

3.4 草果揮發(fā)油通過線粒體途徑誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡

JC-1染色和流式檢測細胞線粒體膜電位(MMP)，發(fā)現草果揮發(fā)油(0.23、0.12和0.058 mg/mL)作用6-10B細胞24 h后，藥物組較對空白照組(2%)的線粒體膜電位明顯改變，其比例分別為：32.68%、43.24%和8.22%，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖5)。提示線粒體凋亡途徑極有可能參與了草果揮發(fā)油誘導的鼻咽癌6-10B腫瘤細胞凋亡過程。

圖5 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞的線粒體膜電位改變Fig.1 The change of mitochondrial membrane potential in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A。 tsaoko essential oil注：A：草果揮發(fā)油作用6-10B細胞24 h后的線粒體膜電位變化趨勢；B：線粒體膜電位改變的統(tǒng)計學分析(*P<0.05)。Note:A shows the change trend of mitochondrial membrane potential of 6-10B cells after 24 h treatment with A.tsaoko essential oil;B is a statistical analysis of changes in mitochondrial membrane potential (*P<0.05).

Western blot進一步分析線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL表達情況，結果顯示鼻咽癌6-10B細胞經草果揮發(fā)油處理后，凋亡蛋白Bax和Bim表達升高，Bcl-2和Bcl-xL表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)(見圖6)。推測線粒體凋亡途徑參與了草果揮發(fā)油誘導的鼻咽癌細胞凋亡。

圖6 草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌6-10B細胞線粒體途徑相關蛋白差異表達Fig.6 Differential expression of mitochondrial pathway-related proteins in nasopharyngeal carcinoma 6-10B cells induced by A.tsaoko essential oil注：A：草果揮發(fā)油處理24 h后6-10B細胞的線粒體途徑相關蛋白表達變化；B：蛋白表達數據統(tǒng)計分析(*P<0.05)。Note:A shows the changes of mitochondrial pathway related proteins expression in 6-10B cells after 24 h treatment with A.tsaoko essential oil;B is the statistical analysis of protein expression data (*P<0.05).

4 討論

鼻咽癌為頭頸部上皮細胞惡性腫瘤，其主要病理類型為非角化型未分化癌。早期鼻咽癌單純放療效果相對較好，而晚期病變的治療效果欠佳，所以嘗試將放療和化療結合用于治療晚期鼻咽癌[18]。但是，目前常用的化療藥物又存在耐藥性和高劑量等缺點[19]。因此，學者們致力于探索天然藥物治療鼻咽癌的效果，研究表明，吐根堿、番茄堿苷和喜樹堿等生物堿類化合物，以及腫節(jié)風提取物等多種天然產物對鼻咽癌細胞的增殖有一定抑制作用[20,21]。

草果揮發(fā)油是草果主要活性成分，具有抗氧化、調節(jié)胃腸功能、抗菌、抗腫瘤及改變藥物通透性等作用[22]。關于草果揮發(fā)油抗腫瘤研究鮮有報道，僅見Zhang[12]報道草果揮發(fā)油具有抑制肝癌細胞增殖作用。本研究首次對草果揮發(fā)油抑制鼻咽癌細胞的增殖情況進行探討，結果發(fā)現草果揮發(fā)油對6-10B細胞有增殖抑制作用，且呈劑量依賴性，24 h的IC50為0.14 mg/mL；同時形態(tài)學結果顯示，在高濃度(0.93和0.46 mg/mL)草果揮發(fā)油的作用下，腫瘤細胞完全破碎裂解，而低濃度(0.23、0.12和0.058 mg/mL)草果揮發(fā)油卻對鼻咽癌腫瘤細胞6-10B具有明顯的凋亡誘導效應。

線粒體途徑是細胞凋亡的主要途徑之一，線粒體膜電位改變(Δψm)是細胞凋亡的早期標志[16]。本研究發(fā)現藥物濃度為0.23、0.12和0.058 mg/mL的草果揮發(fā)油作用6-10B細胞24 h后，線粒體膜電位明顯改變，提示線粒體凋亡途徑參與了草果揮發(fā)油誘導鼻咽癌細胞凋亡的過程。Bcl-2家族蛋白[23]在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮極為重要的調控作用。外界凋亡刺激因素激活促凋亡因子(如Bax、Bim等)，促使線粒體膜電位改變，導致線粒體膨脹，外膜通透性增加，細胞色素C釋放，Caspase-9激活，從而引發(fā)Caspase級聯反應，導致細胞凋亡。Western blot進一步分析線粒體途徑相關蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xL及凋亡標志性蛋白Caspase-3/7/9、PARP等的表達水平變化，結果進一步證實了草果揮發(fā)油通過線粒體凋亡途徑誘導鼻咽癌6-10B細胞凋亡。

綜上，草果揮發(fā)油體外對鼻咽癌細胞有明顯增殖抑制作用，可通過線粒體凋亡途徑誘導6-10B細胞發(fā)生凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤生物學效應；課題組后續(xù)將深入探討草果揮發(fā)油體內治療鼻咽癌的療效及其作用機制，并分析其對其它腫瘤細胞的增殖抑制作用，這些研究將為草果揮發(fā)油在后續(xù)抗腫瘤天然藥物開發(fā)與應用提供科學依據，同時也為藥食兩用植物—草果的綜合開發(fā)與利用奠定基礎。