植物乳桿菌CCFM8610緩解腸易激綜合征并改善腸道菌群失調(diào)—一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的先導(dǎo)性臨床試驗(yàn)

劉洋，郁辛杰，于雷雷，田豐偉,d，趙建新，張灝,e,f,g，錢龍，王群，薛正青，翟齊嘯,d,*，陳衛(wèi),e,i

a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

c Hwa Chong Institution (College), Singapore 269734, Singapore

d International Joint Research Laboratory for Probiotics, Jiangnan University, Wuxi 214122 China

e National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

f Wuxi Translational Medicine Research Center and Jiangsu Translational Medicine Research Institute Wuxi Branch, Wuxi 214122, China

g (Yangzhou) Institute of Food Biotechnology, Jiangnan University, Yangzhou 225004, China

h The Tinghu People’s Hospital, Yancheng 224002, China

i Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048, China

1.引言

腸易激綜合征（IBS）是一種慢性腸道疾病，通常伴有腸道功能障礙，但不會(huì)引起器質(zhì)性損害[1]?，F(xiàn)階段，全球中超過10%的人口患有IBS [2]。由于高患病率和治愈方法的缺失，IBS給世界各國的醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。根據(jù)患者糞便的性狀特點(diǎn)（硬塊、松散、水樣糞便），IBS被可分為四種亞型：腹瀉型IBS（IBS-D）、便秘型IBS、混合型IBS及不定型IBS [3]。IBS-D即是IBS的亞型之一，其主要癥狀包括嚴(yán)重的腹瀉、反復(fù)的腹痛和腹脹，以及排便習(xí)慣的改變[4]。由于IBS-D的臨床癥狀比其他亞型更為迫切，因此IBS-D患者在飲食和日?；顒?dòng)方面受到了更多的限制[5]。此外，在IBS患者中，患有IBS-D的患者通常必須接受至少10倍于其他患者的檢查才能確診，這導(dǎo)致了極高的診斷成本[6]。隨著社會(huì)的發(fā)展，生活環(huán)境污染和精神壓力正在急劇增加[7,8]。這種環(huán)境及心理的變化進(jìn)一步導(dǎo)致了IBS-D的發(fā)病與流行。而基于此，IBS-D患者無疑承受著更大的經(jīng)濟(jì)及精神壓力。因此，盡快找到IBS-D的有效治療方法是至關(guān)重要的。

多項(xiàng)研究表明，IBS-D患者的多個(gè)生理特征發(fā)生了顯著變化。IBS-D患者結(jié)腸中環(huán)氧合酶-2和前列腺素E2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，這可能導(dǎo)致患者的內(nèi)臟超敏癥狀并加重腸道功能的紊亂[9]。IBS-D患者腸道中肥大細(xì)胞的激活導(dǎo)致了大量的類胰蛋白酶和組胺的釋放，這加劇了閉合蛋白（occludin）的降解并增加了腸道通透性[10]。此外，IBS-D患者還顯示出了嚴(yán)重的腸道菌群失調(diào)癥狀。在IBS-D患者的腸道菌群中，厚壁菌門（Firmicutes）以及變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度顯著上升，擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度顯著下降[11]。在腸道菌群屬水平上，諸如雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Faecalibacterium和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等多個(gè)屬的相對(duì)豐度也顯示出了顯著變化[12]。

益生菌指可以定殖在人體內(nèi)發(fā)揮有益作用的活微生物，它們普遍被認(rèn)為是安全可食用的，并常被用于緩解各種疾病[13]。多種動(dòng)物模型已證明，攝入益生菌可以有效改善腸道菌群失調(diào)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、增強(qiáng)腸屏障功能并抑制內(nèi)臟超敏癥狀[14–17]。而在臨床試驗(yàn)中，已發(fā)現(xiàn)部分益生菌具有緩解IBS的功效。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的攝入可以顯著降低IBS患者的排便頻率并改善其脂肪酸代謝[18]。兩岐雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）的干預(yù)可以顯著減輕腹痛并降低IBS的嚴(yán)重程度[19]。長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）降低了IBS患者的抑郁癥狀并改善了患者的生活質(zhì)量[20]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）則減輕了IBS患者的腹脹癥狀，使其排便習(xí)慣趨于正常[21]。這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的證據(jù)表明益生菌作為IBS的潛在治療劑正在受到關(guān)注。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CCFM8610是一株分離自發(fā)酵蔬菜的益生菌菌株，具有卓越的生理特性。體外實(shí)驗(yàn)表明，植物乳桿菌CCFM8610的模擬胃腸道環(huán)境存活率可達(dá)83.18% ± 0.34%，具有菊粉、低聚果糖及低聚半乳糖的發(fā)酵能力，具有較高的共軛亞油酸轉(zhuǎn)化能力（57.39% ± 1.08%），并具有較短的世代時(shí)間[（124.2 ± 4.33）min][22]。與其他乳桿菌菌株相比，植物乳桿菌CCFM8610在這些生理特性上具有明顯優(yōu)勢。而這些優(yōu)良的生理特性有助于該菌株在宿主體內(nèi)發(fā)揮益生作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，植物乳桿菌CCFM8610已被證明可以顯著增加多種腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，從而恢復(fù)腸屏障功能[23]。在結(jié)腸炎模型中，植物乳桿菌CCFM8610可降低結(jié)腸中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細(xì)胞因子水平，并抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信號(hào)通路的激活，從而減輕腸道炎癥[22]。此外，先前進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明，植物乳桿菌CCFM8610可以顯著恢復(fù)腸道菌群多樣性并改善腸道菌群組成[24]。因此，我們認(rèn)為該菌株具有緩解IBS-D患者臨床癥狀的潛力。而為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了這項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的先導(dǎo)性臨床研究，以探究植物乳桿菌CCFM8610緩解IBS-D的功效。本研究為益生菌緩解IBS-D臨床癥狀提供了新的證據(jù)，并為探索益生菌治療IBS的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2.材料與方法

2.1.研究設(shè)計(jì)和倫理聲明

這項(xiàng)研究是在中國江蘇省鹽城市亭湖區(qū)人民醫(yī)院進(jìn)行的一項(xiàng)為期12周的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的先導(dǎo)性臨床研究。研究的設(shè)計(jì)通過了鹽城市亭湖區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：ET2017015），并在中國臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心（Chinese Clinical Trial Registry, Chi-CTR）進(jìn)行了注冊(cè)?? http://www.chictr.org.cn/index.aspx（注冊(cè)編號(hào)：ChiCTR1800014886）。本研究按照《赫爾辛基宣言》的指導(dǎo)原則進(jìn)行，并獲得了每個(gè)參與者的知情同意。

2.2.研究對(duì)象

本研究的患者招募工作是在2018年2月和3月進(jìn)行的，招募納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)參照Niv等[25]的研究進(jìn)行了制定。年齡大于18歲的，被診斷為IBS-D的患者被允許參加本臨床研究。兩名消化內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)羅馬III標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行了IBS-D癥狀評(píng)估。然而，具有以下特性的患者被排除在外：①患有傳染病或胃腸道癌癥的患者；②具有炎癥性腸病癥狀或其他腸道疾病癥狀的患者；③在過去一個(gè)月內(nèi)服用了止瀉藥或抗生素的患者；④在過去一個(gè)月內(nèi)服用了微生態(tài)制劑、膳食補(bǔ)充劑或益生菌的患者；⑤經(jīng)常飲用酸奶或益生菌飲料的患者；⑥近期飲食習(xí)慣發(fā)生重大變化的患者；⑦以及已懷孕或希望懷孕的女性。此外，在研究期間，任何未能按時(shí)服用益生菌、未能保留糞便樣本或未能完成問卷調(diào)查的患者都被認(rèn)為是自動(dòng)退出本臨床研究。

2.3.研究產(chǎn)品

本研究中使用的產(chǎn)品包括安慰劑產(chǎn)品、低聚糖產(chǎn)品及植物乳桿菌CCFM8610產(chǎn)品。所有產(chǎn)品均為粉末狀，外觀相同，包裝相同（每包2 g）。安慰劑產(chǎn)品的成分是麥芽糊精。低聚糖產(chǎn)品的成分是5%的麥芽糊精與95%的低聚糖（菊粉7.8%、低聚半乳糖15.6%、低聚果糖71.6%）。植物乳桿菌CCFM8610產(chǎn)品的成分是植物乳桿菌CCFM8610 [5%，>5×109個(gè)菌落形成單位（CFU）·g–1]與95%的低聚糖（成分等同于低聚糖產(chǎn)品）。所有產(chǎn)品均需在4 ℃下保存。此外，經(jīng)測定，植物乳桿菌CCFM8610產(chǎn)品中的活菌數(shù)在3個(gè)月內(nèi)可保持在5 × 109CFU·g–1以上。

2.4.隨機(jī)化與干預(yù)方法

最初，本研究共招募了96名患者。經(jīng)體檢后，21名患者因不符合研究要求而被排除在外。根據(jù)計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)數(shù)表，剩余75位患者被隨機(jī)分為了3組，安慰劑組、低聚糖組及植物乳桿菌CCFM8610組，每組25人。

研究總時(shí)長為12周，包括了兩周的觀察期（第1周、第2周）、8周的干預(yù)期（第3周到第10周）與兩周的后續(xù)隨訪期（第11周、第12周）。觀察期的目的是讓患者自查IBS-D癥狀。在干預(yù)期中，各組患者都被要求每天服用相應(yīng)的研究產(chǎn)品（2 g）。在隨訪觀察期間，患者停止服用益生菌，但被要求報(bào)告任何不良健康狀況。

此外，在整個(gè)研究過程中，患者被要求不能服用抗生素；不能服用任何胃腸道藥物；不能服用其他益生菌、益生菌飲料、酸奶、微生態(tài)制劑或膳食補(bǔ)充劑。此外，患者被要求不能顯著改變飲食習(xí)慣，也不能參加其他臨床試驗(yàn)。

2.5.問券調(diào)查

參照Niv等[25]的研究，本研究采用了IBS癥狀嚴(yán)重程度量表（IBS-SSS）和IBS生活質(zhì)量量表（IBS-QOL）對(duì)IBS-D患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量進(jìn)行調(diào)查與評(píng)估。在醫(yī)生的幫助下，患者在第3、7和11周報(bào)道了他們的IBS-SSS評(píng)分和IBS-QOL評(píng)分。

2.6.糞便樣品收集與腸道菌群分析

本研究在第11周安排了一次糞便樣本采集。收集患者的新鮮糞便樣本并保存在–80 °C下。按照FastDNA?Spin試劑盒（安倍醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司）的說明書提取糞便DNA。并按照Wang等[26]描述的方法進(jìn)行腸道菌群的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和測序。采用主成分分析（PCA）和線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size, LEFSE）對(duì)腸道菌群組成進(jìn)行分析。

2.7.統(tǒng)計(jì)分析

本研究中符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)表示為平均值與標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation, SD）。使用單因素方差分析（analysis of variance, ANOVA）分析結(jié)果，然后使用Tukey多重比較檢驗(yàn)確定其統(tǒng)計(jì)顯著性。

本研究中不符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)與四分位距離。使用非參數(shù)檢驗(yàn)來分析結(jié)果。由于IBSSSS和IBS-QOL問卷數(shù)據(jù)樣本的配對(duì)特性，因此使用弗里德曼（Friedman）秩和檢驗(yàn)來確定其統(tǒng)計(jì)顯著性。由于腸道菌群數(shù)據(jù)樣本的獨(dú)立性，使用克魯斯卡爾-沃利斯（Kruskal-Wallis）方差分析確定了其統(tǒng)計(jì)顯著性。

本研究中計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)直接表示為數(shù)字。以卡方檢驗(yàn)分析患者年齡、體重等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。以曼-惠特尼（Mann-Whitney）U檢驗(yàn)分析不同組中IBS嚴(yán)重程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。p值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1.患者和基線特征

63名患者最終完成了這項(xiàng)研究。12名患者因?yàn)槭ヂ?lián)絡(luò)，被排除（圖1）。每組患者基線的數(shù)據(jù)如表1所示。各組患者的基線特征沒有顯著差異。

圖1.臨床試驗(yàn)流程圖。

表1 各組患者基線特征

3.2.植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D臨床癥狀及嚴(yán)重程度的影響

經(jīng)過8周的干預(yù)期后，各組患者的IBS-SSS問卷評(píng)分發(fā)生了顯著變化（表2）。服用安慰劑的患者報(bào)道他們的排便滿意度有顯著改善（p< 0.05）。然而這種改善只發(fā)生在干預(yù)期的前4周，后4周并未發(fā)現(xiàn)顯著變化。同時(shí)，在8周的干預(yù)期內(nèi)，本組患者的IBS-SSS總分無明顯變化（p> 0.05）。植物乳桿菌CCFM8610組患者在攝入植物乳桿菌CCFM8610后，腹脹癥狀、排便滿意度和生活困擾評(píng)分均有改善，且在整個(gè)干預(yù)期內(nèi)均有體現(xiàn)（p< 0.05）。此外，植物乳桿菌CCFM8610組患者的IBSSSS總分呈現(xiàn)明顯的下降（p< 0.05）。低聚糖組患者的癥狀改善不明顯（p> 0.05）。

經(jīng)過對(duì)IBS-D嚴(yán)重程度的分析后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干預(yù)8周后，安慰劑組中具有嚴(yán)重IBS癥狀的患者數(shù)量增加了（表2）。但這種變化并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的改變（p> 0.05）。同樣地，低聚糖組中，各個(gè)嚴(yán)重程度的IBS-D患者數(shù)量也未出現(xiàn)顯著改變（p> 0.05）。然而，經(jīng)過8周的干預(yù)后，許多服用植物乳桿菌CCFM8610的中度IBS-D癥狀患者報(bào)告說他們的癥狀轉(zhuǎn)化為輕度癥狀。此外，在植物乳桿菌CCFM8610組中，所有嚴(yán)重癥狀的患者均出現(xiàn)了癥狀的改善。這說明植物乳桿菌CCFM8610可以有效緩解IBS的整體癥狀（p< 0.05）。

表2 患者在第3、7、11周時(shí)的IBS-SSS問卷得分與IBS-QOL得分

3.3.植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D患者生活質(zhì)量的影響

IBS-QOL調(diào)查問券的評(píng)分結(jié)果顯示，不同實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品對(duì)患者生活質(zhì)量的影響具有顯著差異（表2）。安慰劑組的患者報(bào)告他們的IBSQOL總分未出現(xiàn)任何顯著變化。然而，這些患者報(bào)告說，服用安慰劑后他們對(duì)自己健康的擔(dān)憂有所減少（p< 0.05）。同樣的結(jié)論也出現(xiàn)在了低聚糖組的評(píng)分報(bào)告中（p<0.05）。此外，低聚糖組的患者也報(bào)道了他們對(duì)人際關(guān)系的擔(dān)憂顯著減少（p< 0.05）。然而，低聚糖組患者的IBS-QOL總分、情緒變化評(píng)分、日常活動(dòng)干預(yù)評(píng)分和飲食限制評(píng)分，均在第7周時(shí)顯著增加了（p< 0.05）。在安慰劑組的一些子評(píng)分項(xiàng)目中（情緒變化評(píng)分、個(gè)人形象擔(dān)憂評(píng)分及人際關(guān)系擔(dān)憂評(píng)分等）也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，但這些變化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。這些上升的項(xiàng)目評(píng)分，均在第11周時(shí)評(píng)分恢復(fù)到基線水平。這表明在干預(yù)期間IBS-D癥狀對(duì)患者的生活質(zhì)量具有顯著影響。與安慰劑和低聚糖相比，植物乳桿菌CCFM8610顯著提高了IBS-D患者的生活質(zhì)量。植物乳桿菌CCFM8610組患者在情緒控制、飲食限制、社會(huì)印象擔(dān)憂方面均有顯著改善（p< 0.05）。

3.4.植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D患者腸道菌群多樣性和組成的影響

植物乳桿菌CCFM8610組患者的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)明顯高于安慰劑組[圖2（a）、（b）]。這表明，植物乳桿菌CCFM8610的干預(yù)確實(shí)增加了腸道菌群的多樣性。然而，低聚糖的效果不明顯。

此外，各組腸道菌群屬水平上的相對(duì)豐度是具有顯著差異的[圖2（c）]。安慰劑組中普氏菌屬（Prevotella）的相對(duì)豐度是所有組中最高的。然而，益生菌或低聚糖的攝入顯著改變了患者的腸道菌群。與其他組相比，低聚糖組患者腸道中數(shù)個(gè)屬的相對(duì)豐度有顯著增加。植物乳桿菌CCFM8610組患者的雙歧桿菌屬等多個(gè)屬的相對(duì)豐度也提高了。PCA分析結(jié)果進(jìn)一步表明，添加低聚糖或益生菌可以改變腸道菌群的組成[圖3（a）]。然而，腸道菌群的變化在不同組之間具有差異。與安慰劑組相比，益生菌和低聚糖的攝入顯著增加了擬桿菌屬（Bacteroides）的相對(duì)豐度，降低了普氏菌屬的相對(duì)豐度[圖3（b）～（d）]。此外，在植物乳桿菌CCFM8610組患者腸道中，瘤胃球菌屬和Parabacteroides的相對(duì)豐度有顯著增加。同時(shí)，一些丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度也發(fā)生了顯著變化[圖3（c）]。

3.5.植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D患者丁酸生產(chǎn)種屬相對(duì)豐度及腹脹相關(guān)種屬相對(duì)豐度的影響

厭氧棒狀菌屬（Anaerostipes）、Anaerotruncus、雙歧桿菌屬、丁酸弧菌屬（Butyricimonas）及Odoribacter是植物乳桿菌CCFM8610干預(yù)后，相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化的丁酸生產(chǎn)種屬[圖4（a）～（e）]。與安慰劑組相比，植物乳桿菌CCFM8610顯著提高了這些丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度（p< 0.05）。甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）的相對(duì)豐度與腸道中氣體的生產(chǎn)有關(guān)?？诜参锶闂U菌CCFM8610可顯著降低其相對(duì)豐度[圖4（f）；p< 0.05]。低聚糖干預(yù)可以調(diào)節(jié)某些種屬的相對(duì)豐度，但與安慰劑組沒有顯著差異（p> 0.05）。

圖2.不同組別患者腸道菌群α多樣性與主要種屬的相對(duì)豐度。（a）Simpson指數(shù)；（b）Shannon指數(shù)；（c）各組中相對(duì)豐度大于0.001的屬。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)。字母a和b表示具有顯著性差異（p < 0.05）。

4.討論

本研究旨在探究前期篩選出的一株具有多種保健功能的益生菌——植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D的緩解作用。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了這項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的先導(dǎo)性臨床試驗(yàn)，并分析了植物乳桿菌CCFM8610緩解IBS-D臨床癥狀、提高患者生活質(zhì)量、緩解患者腸道菌群失調(diào)的能力。

在本臨床研究中，患者被隨機(jī)分成三組，并給予了三種研究產(chǎn)品。其中，在植物乳桿菌CCFM8610產(chǎn)品中，添加了低聚糖作為佐劑。這是由于部分研究報(bào)道低聚糖可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，并促進(jìn)腸道中有益微生物的增殖[27,28]。然而，低聚糖是否具有緩解IBS-D的功效是一直存在爭議的[29,30]。所以，我們?cè)O(shè)立了一個(gè)單獨(dú)分組以探討低聚糖對(duì)IBS-D的影響。結(jié)果表明，低聚糖對(duì)IBS-D不存在顯著的緩解作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明植物乳桿菌CCFM8610產(chǎn)品對(duì)IBS-D的緩解作用，均來自于益生植物乳桿菌CCFM8610。

圖3.不同組患者腸道菌群組成的主成分分析和LEfSe分析。（a）腸道菌群的主成分分析；（b）安慰劑組和低聚糖組屬水平上的LDA（最小判別分析）得分；（c）安慰劑組和植物乳桿菌CCFM8610組屬水平上的LDA得分；（d）分類分支圖。

IBS-D是IBS的亞型之一，其嚴(yán)重程度受患者的生理狀態(tài)、心理狀態(tài)、飲食習(xí)慣和環(huán)境因素的影響[4]。與IBS的其他亞型相比，IBS-D患者通常會(huì)遭受頻繁的腹痛與腹脹、不適的排便習(xí)慣、嚴(yán)重的活動(dòng)障礙、嚴(yán)苛的飲食限制和高昂的治療費(fèi)用[31]。此外，IBS-D的臨床癥狀也嚴(yán)重影響了患者的工作效率[32]。由于這些不便，IBS-D患者的生活質(zhì)量普遍也較低[5]。因此，為了探討植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D患者臨床癥狀及生活質(zhì)量的改善作用，我們?cè)谘芯窟^程中設(shè)置了兩份問卷調(diào)查，以調(diào)查及評(píng)價(jià)患者的真實(shí)感受。

圖4.不同組患者腸道中丁酸生產(chǎn)種屬及腹脹相關(guān)種屬的相對(duì)豐度。（a）厭氧棒狀菌屬（Anaerostipes）；（b）Anaerotruncus；（c）雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）；（d）丁酸弧菌屬（Butyricimonas）；（e）Odoribacter；（f）甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）。所有數(shù)據(jù)均采用Kruskal-Wallis方差分析，以中位數(shù)±四分位范圍表示。字母a和b表示具有顯著性差異（p < 0.05）。

IBS-SSS量表是IBS臨床研究中常用的調(diào)查問券之一，用于確定患者IBS的嚴(yán)重程度。分析IBS-SSS量表數(shù)據(jù)后，我們發(fā)現(xiàn)在本研究實(shí)行的三種干預(yù)策略中，只有植物乳桿菌CCFM8610降低了患者的IBS-SSS總分（表2）。該結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM8610可以緩解患者IBS-D的臨床癥狀。進(jìn)一步對(duì)IBS-SSS量表的各個(gè)評(píng)分項(xiàng)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8610可以顯著緩解患者的腹脹癥狀，提高患者的排便習(xí)慣滿意度。腹脹是IBS-D的主要臨床癥狀之一，通常與患者內(nèi)臟超敏有關(guān)[33]。對(duì)于IBS-D患者來說，內(nèi)臟超敏的特征表現(xiàn)為腸道痛覺的增強(qiáng)，這本質(zhì)上是一種外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂[34]。這種神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂降低了胃腸道刺激閾值，因此IBS-D患者經(jīng)常遭受腹痛、腹脹癥狀的困擾[33]。在動(dòng)物模型中，乳桿菌（Lactobacillus）已被證明可通過提高疼痛閾值、降低結(jié)腸平滑肌的收縮反應(yīng)、抑制血清皮質(zhì)酮和脊髓神經(jīng)遞質(zhì)的濃度、調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸來抑制內(nèi)臟超敏反應(yīng)[35,36]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些結(jié)論具有相似性。因此，我們推測植物乳桿菌CCFM8610株可能具有類似的機(jī)制，從而減輕了患者的IBS-D臨床癥狀。

除了內(nèi)臟超敏外，IBS-D患者還具有典型的乳糖、果糖吸收不良癥狀。這阻礙了碳水化合物在小腸的充分吸收。這些未被吸收的碳水化合物在結(jié)腸中被微生物發(fā)酵，產(chǎn)生了大量氣體，進(jìn)而導(dǎo)致了嚴(yán)重的腹脹癥狀[37]。植物乳桿菌通常在結(jié)腸中發(fā)揮益生作用。由于植物乳桿菌極強(qiáng)的黏附性和糖類發(fā)酵能力，飲食中未被發(fā)酵的糖類可以在結(jié)腸中被植物乳桿菌完全發(fā)酵，從而減少產(chǎn)氣量[38,39]。因此，我們認(rèn)為，植物乳桿菌CCFM8610除了抑制內(nèi)臟超敏反應(yīng)外，還可能通過減少結(jié)腸中氣體的產(chǎn)生來抑制腹脹癥狀。

除去對(duì)腹脹癥狀的效果，我們發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8610和安慰劑治療都能提高患者的排便滿意度。然而，安慰劑的效果只出現(xiàn)在干預(yù)期的前四周，而植物乳桿菌CCFM8610的效果在整個(gè)干預(yù)期內(nèi)持續(xù)改善。在先前的研究中，植物乳桿菌CCFM8610被證明可以改善腸蠕動(dòng)[40]。而安慰劑（麥芽糊精）未曾有類似效果的報(bào)道。因此，有理由推測，安慰劑組患者排便的改善可能是由于安慰劑效應(yīng)導(dǎo)致的[41]。此外，植物乳桿菌CCFM8610還顯著減少了重度和中度癥狀I(lǐng)BS-D患者數(shù)量，但安慰劑組出現(xiàn)各癥狀的患者數(shù)量沒有明顯變化（表2）。

對(duì)于患者的生活質(zhì)量，我們使用了IBS-QOL量表進(jìn)行了量化評(píng)估。在分析IBS-QOL量表的結(jié)果后，我們發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8610干預(yù)顯著改善了患者的IBSQOL評(píng)分、飲食限制、社會(huì)印象擔(dān)憂與情緒波動(dòng)（表2）。部分飲食成分會(huì)導(dǎo)致IBS-D患者的腹痛和腹脹，因此這些患者往往在飲食上具有諸多限制[4]。此外，IBS-D急迫的臨床癥狀經(jīng)常使患者避免社交活動(dòng)和團(tuán)體旅行，因此這些患者通常會(huì)擔(dān)心自己的社會(huì)印象[32,42]。這種飲食和社交活動(dòng)的不便進(jìn)一步導(dǎo)致了IBS-D患者的情緒變化。腸道與大腦可以通過腦腸軸進(jìn)行雙向交流[43]。腸道刺激和不適可導(dǎo)致患者情緒變化，然而這些情緒變化也可通過迷走神經(jīng)引起腸道內(nèi)臟超敏癥狀與腸道應(yīng)激反應(yīng)[44]?；颊叩慕箲]、抑郁、強(qiáng)迫等情緒也可能加重IBS-D的癥狀，降低生活質(zhì)量[44,45]。Liu等[46]關(guān)于焦慮、抑郁臨床試驗(yàn)的薈萃分析表明，乳桿菌具有改善焦慮和抑郁情緒的作用，而安慰劑與低聚糖則沒有。這個(gè)證據(jù)支持了植物乳桿菌CCFM8610調(diào)節(jié)IBS-D患者情緒的作用。此外，由于植物乳桿菌CCFM8610良好的碳水化合物發(fā)酵特性，患者的腹脹癥狀得以改善，繼而改善了患者的飲食限制。因此，我們認(rèn)為植物乳桿菌CCFM8610具有改善患者的飲食限制與情緒變化的功效，從而提高了IBS-D患者的生活質(zhì)量。

腸道菌群失調(diào)是IBS-D的重要特征之一[47]。與健康人相比，IBS-D患者的腸道菌群組成發(fā)生了顯著變化，腸道菌群多樣性顯著降低[48]。目前有研究表明，腸道菌群失調(diào)可能是IBS-D的病因之一[49]。因此，為了探究本研究干預(yù)策略對(duì)IBS-D患者腸道菌群的影響，我們對(duì)患者糞便菌群進(jìn)行了測序，并分析了其多樣性與屬水平差異。結(jié)果表明，攝入植物乳桿菌CCFM8610顯著增加了腸道菌群多樣性，這為益生菌緩解腸道菌群失調(diào)提供了初步證據(jù)（圖2）。在進(jìn)一步分析了各組腸道菌群屬水平上的物種差異后，我們發(fā)現(xiàn)在安慰劑組中擬桿菌屬的相對(duì)豐度較低，而普氏菌屬的相對(duì)豐度較高。低聚糖或植物乳桿菌CCFM8610的干預(yù)可以提高擬桿菌屬的相對(duì)豐度，降低普氏菌屬的相對(duì)豐度。這種擬桿菌屬與普氏菌屬相對(duì)豐度的變化使IBS-D患者腸道菌群的組成更接近于健康人[50,51]。

此外，除了擬桿菌屬與普氏菌屬外，我們發(fā)現(xiàn)不同組間甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度存在顯著差異。甲烷短桿菌屬是一種厭氧細(xì)菌，可以利用氫氣將二氧化碳還原為甲烷。由于甲烷短桿菌屬的產(chǎn)氣特性，其相對(duì)豐度的增加往往會(huì)引起嚴(yán)重的胃腸脹氣，加重IBS-D的臨床癥狀[52,53]。我們發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8610的攝入降低了IBS-D患者腸道中甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度，這與之前植物乳桿菌CCFM8610顯著緩解IBS-D患者腹脹癥狀的結(jié)果是一致的。因此，我們認(rèn)為植物乳桿菌CCFM8610可以通過改善腸道菌群紊亂來緩解IBS-D的臨床癥狀。

與其他已報(bào)道的具有緩解IBS-D功效的益生菌相比，我們發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CCFM8610顯著提高了丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度。在屬水平上，厭氧棒狀菌屬、Anaerotruncus、雙歧桿菌屬、丁酸弧菌屬及Odoribacter等一系列丁酸生產(chǎn)種屬在植物乳桿菌CCFM8610組患者中具有較高的相對(duì)豐度水平。丁酸是一種短鏈脂肪酸，具有多種促進(jìn)健康的作用。在腸道內(nèi)，丁酸可以減少NF-κB的信號(hào)通路表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，激活腸上皮細(xì)胞的缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1），從而維持腸屏障的完整性，減輕腸道的炎癥反應(yīng)、急性神經(jīng)性疼痛和腹脹[54–56]。此外，丁酸也是一種重要的組蛋白脫乙酰酶抑制劑，可以促進(jìn)組蛋白乙?；瘡亩绊懘竽X功能，并抑制抑郁情緒[57,58]。有研究表明，IBS-D患者腸道中丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度顯著低于健康人[59]。因此，腸道內(nèi)丁酸濃度的升高可能實(shí)現(xiàn)對(duì)IBS-D患者臨床癥狀和情緒的雙重調(diào)節(jié)。腸道菌群發(fā)酵腸道中碳水化合物是腸道中丁酸的主要來源[60]。因此，一個(gè)可能的機(jī)制是攝入植物乳桿菌CCFM8610顯著增加了IBS-D患者腸道中丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度，從而促進(jìn)了腸道中丁酸濃度的提高，進(jìn)而緩解了IBS-D患者的臨床癥狀和負(fù)面情緒。植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D的改善作用與丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度增加有關(guān)。同時(shí)，研究表明，IBS-D患者較低的腸道菌群多樣性與腸道中丁酸生產(chǎn)種屬的低相對(duì)豐度是有關(guān)的[59]。因此，植物乳桿菌CCFM8610對(duì)丁酸生產(chǎn)種屬相對(duì)豐度的提升作用可能有助于IBS-D患者腸道菌群失調(diào)的恢復(fù)。在先前的益生菌緩解IBS-D的臨床研究中，沒有發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果報(bào)道。這表明提高丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度可能是植物乳桿菌CCFM8610所特有的功效。我們認(rèn)為這是植物乳桿菌CCFM8610菌株在緩解IBS-D方面的一個(gè)優(yōu)勢。

除上述結(jié)果外，植物乳桿菌CCFM8610治療IBS-D的安全性也明顯優(yōu)于其他方法。IBS的治療選擇每天都在增加，但往往伴隨著更復(fù)雜的副作用。低FODMAP飲食（限制可發(fā)酵的低聚糖、雙糖、單糖和多元醇的飲食）僅對(duì)部分IBS-D患者有作用，并能引起結(jié)腸菌群的巨大變化[61]?；瘜W(xué)藥物如阿洛司瓊和伊盧多啉可緩解腹瀉，但也可引起嚴(yán)重的缺血性結(jié)腸炎、便秘、胰腺炎和括約肌痙攣[62,63]。一些研究支持使用心理療法來緩解IBS癥狀，但其療效還有待探索[4]。這些結(jié)論表明，大多數(shù)IBS-D治療方法仍存在嚴(yán)重缺陷。當(dāng)然，也有關(guān)于益生菌造成不良健康狀況的報(bào)道。這說明益生菌對(duì)某種疾病而言并不是一種絕對(duì)安全的飲食成分。因此，我們調(diào)查了以往有關(guān)益生菌引起的不良健康事件的文獻(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，益生菌不良健康事件的報(bào)道大多發(fā)生在特定人群中，如重癥監(jiān)護(hù)病房的患者[64]、免疫缺陷和營養(yǎng)不良的老年人[65]或者結(jié)構(gòu)性心臟病患者等[66]。對(duì)于輕癥患者，益生菌幾乎不會(huì)引起任何不良健康事件。本研究的疾病模型IBS-D不涉及器質(zhì)性損傷，是一種相對(duì)溫和的疾病。因此，發(fā)生不良健康事件的可能性很低。此外，益生菌的不良健康事件大多是由酵母菌（Saccharomyces）引起的，乳桿菌引起的不良健康事件極少[67]。而在有關(guān)乳桿菌不良健康事件的報(bào)道中，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）最為常見，這可能與其菌毛結(jié)構(gòu)和胞外多糖組成有關(guān)[68]。目前，還沒有關(guān)于植物乳桿菌引起的不良健康事件的報(bào)道。此外，在本研究進(jìn)行之前，我們的菌株植物乳桿菌CCFM8610已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[22,23,69]和一次臨床研究[24]，均未發(fā)生不良健康事件。因此，結(jié)合本研究中未發(fā)生不良健康事件的結(jié)果，我們初步得出結(jié)論，植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D的干預(yù)是一種健康的膳食策略。

5.結(jié)論

本研究旨在探究植物乳桿菌CCFM8610對(duì)IBS-D的緩解功效。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了這項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的先導(dǎo)性臨床試驗(yàn)。結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM8610能明顯恢復(fù)IBS-D患者腸道菌群組成和多樣性、減輕臨床癥狀和負(fù)面情緒。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8610對(duì)腸道菌群、IBS-D臨床癥狀和生活質(zhì)量的有益功效可能與增加的丁酸生產(chǎn)種屬的相對(duì)豐度有關(guān)。本研究結(jié)果驗(yàn)證了益生菌對(duì)IBS-D的緩解作用，并為探討緩解IBS-D的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

致謝

本研究得到了國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31871773）、國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)國際（地區(qū)）合作研究項(xiàng)目（31820103010）、“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2018YFC1604206）、新疆兵團(tuán)科技攻關(guān)項(xiàng)目課題（2018DB002）、國家一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目食品科學(xué)與工程（JUFSTR20180102）、英國生物技術(shù)與生物科學(xué)研究理事會(huì)（BBSRC）牛頓基金聯(lián)合研究中心項(xiàng)目及江蘇省食品安全與質(zhì)量協(xié)同創(chuàng)新中心的支持。

Compliance with ethics guidelines

Yang Liu, Xinjie Yu, Leilei Yu, Fengwei Tian, Jianxin Zhao, Hao Zhang, Long Qian, Qun Wang, Zhengqing Xue, Qixiao Zhai, and Wei Chen declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.