凌琳 金秀萍 黃燕穎 孫愛(ài)華

1紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)共體總院藥劑科，浙江紹興312030；2紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)院醫(yī)共體總院檢驗(yàn)科，浙江紹興312030；3杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院病理科310003；4杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院310053

兒童肺炎支原體（MP）感染性肺炎的首選藥物是大環(huán)內(nèi)酯類，但近年MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥率有升高趨勢(shì)，既往研究多認(rèn)為靶基因點(diǎn)突變導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類藥物與菌株的親和力下降是耐藥的主要機(jī)制，但引起點(diǎn)突變的機(jī)制仍不明確[1]。魚(yú)腥草具有清熱解毒的功效，民間廣泛用于治療呼吸道感染，已有研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)白色念珠菌和肺炎鏈球菌等病原體具有抑制作用[2-3]。本文把魚(yú)腥草水提物和兒童MP感染常用藥紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素作為實(shí)驗(yàn)藥物，檢測(cè)亞抑制濃度下多步誘導(dǎo)后MP的耐藥情況及耐藥機(jī)制，為探討魚(yú)腥草水提物治療兒童支原體肺炎的可能效果提供依據(jù)，報(bào)道如下。

材料與方法

一、菌株及試劑來(lái)源

10株MP臨床菌株命名為MP1～MP10，對(duì)紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物全部敏感。質(zhì)控菌株M129購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

MP專用培養(yǎng)基配制：每100 mL含PPLO基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BD公司生產(chǎn)）70 mL、小牛血清（購(gòu)自杭州四季青生物制品有限公司）20 mL、50%的酵母提取液 （OXOID公司生產(chǎn)）5 mL、20%的葡萄糖2.5 mL、1%酚紅200μL、2.5%醋酸鉈1 mL、20萬(wàn)IU的青霉素鉀0.5 mL和2萬(wàn)IU的頭孢噻肟0.5 mL，調(diào)節(jié)pH至7.8，4℃保存?zhèn)溆?。MP專用培養(yǎng)基配制、藥敏試驗(yàn)所用抗菌藥物均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

二、方法

1.魚(yú)腥草水提物制備

魚(yú)腥草用自來(lái)水漂洗干凈脫水干燥后粉碎，過(guò)60目篩得魚(yú)腥草粉末；稱取魚(yú)腥草粉末200 g置燒杯中，加水1 500 mL，浸泡0.5 h，大火煮沸后換小火再煮1 h，過(guò)濾，再加1 000 mL水，中火煮沸后，再換小火煮0.5 h，后轉(zhuǎn)入1 000 mL燒杯中濃縮至400 mL；再轉(zhuǎn)到500 mL燒杯中濃縮至180 mL；換200 mL燒杯中濃縮為約100 mL藥液時(shí)，過(guò)濾，冷卻加雙蒸水至100 mL，每1 mL相當(dāng)于2 g生藥材，分裝，115℃高壓滅菌15 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.菌株濃度檢測(cè)

參考Waites等[4]建立的顏色改變單位（CCU）試驗(yàn)測(cè)定MP菌株濃度。CCU測(cè)定法：①取0.5 mL高壓滅菌EP管10個(gè)，每管加MP培養(yǎng)基180μL；②在第1管中加入待測(cè)菌液20μL，混勻后吸取20μL至第2管，如此順序作10倍遞增稀釋10-1～10-9；③置37℃、培養(yǎng)48～96 h；④以培養(yǎng)基顏色不繼續(xù)發(fā)生改變?yōu)榻Y(jié)果判定終點(diǎn)。發(fā)生顏色變化的最高稀釋度為CCU。

3.微量稀釋法測(cè)定MIC

96孔板每孔含一系列稀釋藥物濃度專用培養(yǎng)基90μL，魚(yú)腥草水提物最終濃度為62.5～2 000 mg/L，紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素為0.125～256 mg/L。溶解凍存于-20℃的MP臨床菌株和M129標(biāo)準(zhǔn)株于1.5 mL試管中用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)48～96 h至肉湯由紅變黃，根據(jù)CCU試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，明確待測(cè)菌株濃度，調(diào)節(jié)菌液濃度至105CFU/mL，各取10μL至96孔板中與含一系列稀釋藥物濃度專用培養(yǎng)基混勻，滴入無(wú)菌液體石蠟密封，蓋上板蓋，輕搖混勻，37℃培養(yǎng)48～96 h后觀察結(jié)果，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔發(fā)生顏色改變（即培養(yǎng)液中酚紅指示劑由紅色變?yōu)殚冱S色）且無(wú)混濁，加藥孔不再出現(xiàn)顏色變化的最小藥物濃度為最小有效抑制抑菌（MIC）。

4.體外誘導(dǎo)試驗(yàn)

將各臨床菌株分別接種在魚(yú)腥草和3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物濃度成倍增加的MP專用液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48～96 h，初始濃度為1/2 MIC，每個(gè)藥物濃度培養(yǎng)3～5代，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)不良時(shí)可降低濃度重復(fù)傳代培養(yǎng)，同時(shí)接種無(wú)藥平皿觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)誘導(dǎo)出的耐藥菌株在無(wú)菌培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3～5代，微量稀釋法測(cè)定MIC值，比較誘導(dǎo)前后MIC的變化，藥物誘導(dǎo)后MIC≥4倍誘導(dǎo)前MIC定義為誘導(dǎo)耐藥成功。同時(shí)做菌株自身對(duì)照試驗(yàn)：①將各臨床菌株和M129直接涂布于128 mg/L的阿奇霉素MP專用平板，于37℃培養(yǎng)48～96 h，觀察結(jié)果；②各臨床菌株和M129在無(wú)抗菌藥物的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)30代，檢測(cè)每代菌株MIC。

5.穩(wěn)定耐藥試驗(yàn)

將誘導(dǎo)后的耐藥株在無(wú)藥物液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每48～96小時(shí)轉(zhuǎn)種1次，10代后測(cè)定MIC，以判斷耐藥的穩(wěn)定性。

三、PCR及純化與測(cè)序

誘導(dǎo)前后各臨床菌株培養(yǎng)液各1 mL置1.5 mL離心管10 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑50 mm）離心10 min，取沉淀加入50μL裂解液，充分混勻后，100℃水浴10 min，12 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑50 mm）離心5 min，上清液即為DNA模板。參考M129菌株已報(bào)道序列23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)和核糖體蛋白L4、L22編碼基因rplD、rplV核苷酸序列（GenBank accession Number.：NC_000912）設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1，委托上海Invitrogen公司合成引物。PCR總體積為100μL，內(nèi)含2.5mmol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Ex-Taq DNA聚合酶 （TaKaRa）、5μLDNA提取物為模板、1×PCR緩沖液 （pH8.3）。PCR參數(shù)：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。采用溴乙錠預(yù)染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。采用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒提純PCR產(chǎn)物，委托上海Invitrogen測(cè)定PCR純化產(chǎn)物各目的基因片段的核苷酸序列。與Genbank已報(bào)道的MP129對(duì)應(yīng)該基因核苷酸序列進(jìn)行比較，以確定上述菌株誘導(dǎo)前后23SrRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)和rplD、rplV核苷酸序列突變情況。

表1 PCR擴(kuò)增肺炎支原體各目的基因引物及產(chǎn)物大小

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)結(jié)果

誘導(dǎo)前魚(yú)腥草水提物對(duì)10株臨床MP菌株的MIC為250～500 mg/L，紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素的MIC范圍分別為0.25～2、0.125～1和0.25～1 mg/L。詳見(jiàn)表2。魚(yú)腥草、紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC分別為250、1、0.25和0.25 mg/L。

二、誘導(dǎo)耐藥結(jié)果

各臨床菌株和M129直接涂布于含128μg/mL阿奇霉素的平板培養(yǎng)后，無(wú)一存活。各臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株在無(wú)抗菌藥物的培養(yǎng)基中傳代30代，檢測(cè)每代菌株MIC，各代之間及與原始菌株MIC差距≤2個(gè)稀釋度。10株MP臨床菌株經(jīng)紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素體外誘導(dǎo)后藥物的MIC分別提高了2～16倍。誘導(dǎo)后MIC≥4倍誘導(dǎo)前MIC為誘導(dǎo)耐藥標(biāo)準(zhǔn)，分別有8株、5株和3株成為紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素穩(wěn)定誘導(dǎo)耐藥株，紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素誘導(dǎo)MP耐藥率分別為80%、50%和30%。經(jīng)魚(yú)腥草誘導(dǎo)傳代30代后，各MP臨床菌株MIC變化不超過(guò)2倍，且無(wú)明顯耐藥性產(chǎn)生。詳見(jiàn)表2。

三、誘導(dǎo)耐藥穩(wěn)定性

所有體外誘導(dǎo)耐藥的菌株在無(wú)藥物液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10代后，對(duì)所有藥物均未恢復(fù)敏感性，說(shuō)明體外獲得性耐藥具有較好的穩(wěn)定性。

四、目的基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

臨床菌株誘導(dǎo)后的核糖體蛋白L4、L22編碼基因PCR擴(kuò)增獲得預(yù)期大小的目的片段，rplD和rplV基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的M129對(duì)應(yīng)序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)突變菌株。紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素均誘導(dǎo)耐藥成功的3株臨床菌株（MP2、MP6和MP10）誘導(dǎo)后23SrRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)2063位均發(fā)生A→G突變；紅霉素和阿奇霉素誘導(dǎo)耐藥成功菌株的MP3和MP5株，其中MP5株發(fā)生2063位發(fā)生A→T突變；MP1、MP8和MP9株僅紅霉素誘導(dǎo)耐藥成功，MP1誘導(dǎo)后23SrRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)未檢測(cè)到突變，MP8和MP9株均發(fā)現(xiàn)2063位A→G突變。按誘導(dǎo)耐藥標(biāo)準(zhǔn)判斷MP4和MP7菌株誘導(dǎo)未成功、誘導(dǎo)前后23SrRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)均未檢測(cè)到突變。見(jiàn)表2。

表2 10株MP臨床菌株耐藥誘導(dǎo)前后MIC及目的基因突變情況

討 論

MP是兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）的重要病原，除了引起呼吸道感染外，也可能引起神經(jīng)、心血管等多系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[5]。臨床上治療MP感染推薦用大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類抗菌藥物[6-7]。兒童正處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，喹諾酮類和四環(huán)素類抗菌藥物在使用時(shí)受一定限制，因此大環(huán)內(nèi)酯類藥物是MP引起的CAP患兒治療首選藥物[8]。隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物廣泛使用，近年耐藥率有所升高[8-9]。

MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要是：①基因突變或甲基化導(dǎo)致靶位改變；②主動(dòng)外排；③藥物滅活。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物作用區(qū)域在基因23SrRNAⅡ區(qū)和Ⅴ區(qū)，點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物與之親和力下降而產(chǎn)生耐藥。已有MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度長(zhǎng)時(shí)間作用可誘導(dǎo)MP耐藥[10]。本研究中10株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感的MP臨床菌株用亞抑制濃度的魚(yú)腥草水提物和3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物多步誘導(dǎo)，結(jié)果魚(yú)腥草不產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥，而紅霉素、阿奇霉素和交沙霉素分別誘導(dǎo)80%、50%和30%的菌株產(chǎn)生穩(wěn)定耐藥。目的基因測(cè)序也發(fā)現(xiàn)8株誘導(dǎo)耐藥株6株存在23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)2063位A→G或A→T突變、未發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白L4和L22編碼基因突變，與目前多數(shù)研究認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥MP臨床菌株90%存在23SrRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)2063位突變相關(guān)一致[11-12]。魚(yú)腥草水提物對(duì)MP臨床菌株的MICs為250～500 mg/L，有較好的抑菌能力，且長(zhǎng)時(shí)間亞抑制濃度魚(yú)腥草水提物作用于MP后，其MICs改變沒(méi)有達(dá)到誘導(dǎo)耐藥標(biāo)準(zhǔn)。這一結(jié)果提示魚(yú)腥草水提物不易發(fā)生誘導(dǎo)耐藥，在治療MP感染中可能有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

同為亞抑制濃度大環(huán)內(nèi)酯類藥物誘導(dǎo)MP耐藥研究，唐愈菲等[10]2016年的研究報(bào)道結(jié)果與本研究明顯不同，其研究顯示11株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感的MP臨床菌株經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類藥物誘導(dǎo)后2株發(fā)生L4編碼基因C162A和A430G突變、2株發(fā)生L22編碼基因T279C和T508C突變、1株發(fā)生L22編碼基因A209T突變，但未檢測(cè)到23SrRNA 2063，這一差異有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突