溫正旺陳益平任迪索胡玲瓏石海礬陳潔

1溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童感染科，浙江溫州325000；2溫州醫(yī)科大學仁濟學院，浙江溫州325000

人巨細胞病毒（HCMV）是引起嬰幼兒肝炎常見的病原體[1]。HCMV肝炎占嬰幼兒肝炎綜合征的30%～40%，臨床表現(xiàn)多樣（無癥狀感染、膽汁淤積肝炎甚至膽道閉鎖），尤其是亞臨床型肝炎最為常見，嚴重危害嬰幼兒的健康及生長發(fā)育。人群普遍感染HCMV，其特異性IgG抗體陽性率可高達90%。國內流行病學調查發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒HCMV-IgG抗體陽性率高達70%～90%[2]。HCMV感染臨床表現(xiàn)差異巨大，考慮與基因相關，HCMV中含有數(shù)百個基因型，其中UL144基因型與HCMV的毒力密切相關，在部分HCMV感染肝功能正常患兒體內表達陰性，是導致嬰幼兒HCMV肝炎的潛在重要因素，但其具體的病理、生理機制尚不明確。近期本課題組臨床研究證實嬰幼兒HCMV肝炎與caspase系列蛋白介導的細胞信號凋亡通路密切相關[3]。本文通過建立動物模型，并檢測各組中UL144 RNA，caspase-8、caspase-12及Toll樣受體4（TLR4）的蛋白和肝臟細胞的凋亡情況，探索UL144在HCMV感染肝臟損傷中的內在分子機制。

材料與方法

一、動物及分組

取體重為80～100 g健康雄性SD幼鼠 （3～4周齡）24只，均由溫州醫(yī)學院試驗動物中心提供，合格證號為[SYXK（浙）2016-0061]。按隨機數(shù)字表法分為空白組、空載組和實驗組3組，每組各8只?？瞻捉M不作特別處理；空載組尾靜脈注入100μL的空載腺病毒；將344μL病毒原液用0.9%生理鹽水稀釋成1.2 mL，然后每只尾靜脈注入100 mL UL144，滴度為2.0×1012，建立UL144動物模型，建立后飼養(yǎng)1周，使藥物效果穩(wěn)定。

二、主要試劑

原位缺口末端標記（TUNEL）試劑盒（羅氏公司）；鼠濃縮型免疫組化試劑盒 （北京中杉金橋公司）；RT-PCR試劑盒 （Fermentas公司）；Trizol抽提試劑（北京普利萊基因技術有限公司），幼鼠UL144基因AAV9型號：200μL*5（唯真生物科技有限公司）。

三、研究方法

1.取材

實驗結束次日，SD幼鼠迅速斷頭處死，取出肝臟右葉，生理鹽水將血液沖洗干凈，每組共得8個肝臟右葉樣本，每組1～4號用4%多聚甲醛固定12 h后，石蠟包埋，分別連續(xù)切片，待測HE、TUNEL；其余均置液氮保存，每組5～8號用于RT-PCR法檢測UL144 RNA，ELISA檢 測caspase-8、caspase-12和TLR4的蛋白表達。

2.肝臟右葉細胞HE染色和凋亡檢測

采用HE染色觀察肝臟右葉細胞病理改變；采用TUNEL法，按試劑盒提供方法操作。鏡檢細胞核中綠色熒光者為凋亡細胞，隨機計算5個高倍視野（×400）下的凋亡細胞數(shù)。凋亡指數(shù)（AI）以凋亡細胞/100個細胞（%）表示。

3.RT-PCR法測定SD幼鼠UL144 RNA的表達

按照Trizol提取試劑說明書抽提RNA，并測定RNA濃度，按RNA逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）說明書進行逆轉錄，按實時熒光定量PCR操作要求在96孔中加入引物 （由上?；瞪锕こ逃邢薰竞铣桑YBR GreenⅠ、模板、水總體積為20μL，混勻后在羅氏LightCycler480進行實時定量PCR分析，用Lightcycler480 15.0軟件處理實驗結果。

4.ELISA方法檢測肝臟組織中caspase-8、caspase-12及TLR4的表達水平

ELISA試劑盒為美國PeproTech公司制造；抗caspase-8、caspase-12及TLR4抗體由Abcom公司生產。caspase-8、caspase-12及TLR4的酶聯(lián)免疫試劑盒室溫下放置30 min，每孔加50μL勻漿或標準樣品，留兩孔空白對照；薄膜蓋住微孔板，孵育2 h；洗板4次，將酶標板反轉，將洗滌液輕甩干；每孔加50μL抗caspase-8、caspase-12及TLR4抗體并封板，孵育2 h；洗板4次，酶標板反轉，洗滌液徹底甩干；每孔先后滴入顯色劑A及B，遮光下常溫靜置30 min；滴終止液100μL，在450 nm處檢測吸光度值（OD）；以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據OD值計算其濃度。

四、統(tǒng)計學方法

本研究采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計處理。各組呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料應用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、HE染色

光鏡下形態(tài)學變化：實驗組肝臟細胞出現(xiàn)變性，細胞核濃縮，深染增加，空白組和空載組基本正常（詳見圖1）。

圖1 三組幼鼠肝臟的HE染色(HE染色，×100)

二、肝細胞凋亡情況

圖2可見，各組間幼鼠離體肝組織細胞凋亡差異均有統(tǒng)計學意義（F=158.427，P<0.05）；實驗組肝細胞的凋亡指數(shù)為7.68±0.37，明顯高于空載組的2.26±0.24及空白組的2.38±0.16（P<0.05），空白組和空載組兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖2 三組幼鼠肝臟的TUNEL檢測結果(TUNEL法和DAPI核染檢測，×400)

三、 肝 臟 組 織 UL144、caspase-8、TLR4 和caspase-12的表達量

表1可見，三組間幼鼠肝臟內的UL144 RNA、caspase-8和TLR4蛋白表達量的差異有統(tǒng)計學意義（F=156.166、97.287和67.624，P均<0.05），其中實驗組的表達量分別為1.823±0.080、0.305±0.004和0.880±0.068，高于空載組及對照組（P均<0.05）；空載組的表達量分別為1.000±0.040、0.104±0.003和0.308±0.004，均高于空白組（P均<0.05）。 三組間幼鼠肝臟組織中caspase-12蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（F=2.156，P>0.05）。

表1 各組幼鼠肝臟組織UL144 RNA、caspase-8、TLR4、caspase-12表達量的比較

討 論

HCMV是一種廣泛分布的機會致病性病毒，具有潛伏性感染特點。HCMV含有免疫逃避基因，可干擾宿主自身的細胞因子系統(tǒng)，影響APC的抗原提呈功能。HCMV感染易引起機體宿主細胞凋亡，而HCMV具有許多抗凋亡的機制和CTL殺傷機制，使感染細胞長期存活[4]。上述方式相互作用使病毒感染后處于靜息平衡狀態(tài)，當機體免疫功能低下時，病毒大量復制發(fā)生顯性感染。臨床發(fā)現(xiàn)，當HCMV感染時，一部分表現(xiàn)為亞臨床型肝炎、黃疸型肝炎、無黃疸型肝炎、膽汁淤積性肝炎和膽汁淤積癥，大部分僅提示存在HCMV感染[5]；HCMV感染臨床癥狀差異巨大，原因是HCMV中存在與病毒毒力相關的親嗜性基因，而親嗜性基因如何誘導肝細胞損傷目前尚未完全明確。

早期研究發(fā)現(xiàn)，巨細胞病毒ULβ區(qū)基因與巨細胞病毒的毒力和感染力相關，但UL144和UL146作用最明顯，如何相關目前尚未明確[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)當給予幼鼠腹腔注射，HCMV UL144蛋白時，SD幼鼠肝臟細胞HE染色提示出現(xiàn)不同程度的變性，TUNEL法檢測出現(xiàn)不同程度的凋亡，提示HCMV UL144基因片段可以導致幼鼠肝細胞損傷乃至凋亡。先前的研究提示，HCMV感染導致肝功能損傷與caspase系列蛋白密切相關，caspase系列蛋白成分復雜，介導的信號通路很多，例如caspase-9參與介導的線粒體途徑誘導的細胞凋亡，caspase-8參與傳遞的細胞外信號凋亡通路，caspase-12參與誘導的內質網應激細胞凋亡信號通路[7]。研究提示，HCMV感染可激活內質網應激信號通路，內質網應激信號通路的激活參與了HCMV感染肝功能的損傷[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)，UL144蛋白進入SD幼鼠體內導致肝細胞的損傷乃至凋亡，但是caspase系列蛋白中介導內質網應激信號通路激活的caspase-12的表達與空白組的比較無明顯差異，提示它與HCMV UL144的感染力與毒力之間不存在相關性，但不能認定UL144與內質網應激之間無相關性。本研究還發(fā)現(xiàn)，實驗組的caspase-8明顯高于另外兩組，差異具有統(tǒng)計學意義，且caspase-8是caspase系類蛋白中直接參與細胞凋亡的，UL144可能通過激活caspase-8效應分子誘導肝細胞凋亡。有研究揭示，HCMV感染誘導細胞凋亡的整個過程中，細胞內TLR家族蛋白作為炎癥啟動器起到重要作用，尤其是TLR4，研究發(fā)現(xiàn)TLR4主要通過caspase系列蛋白酶的激活起作用[9]。本研究中顯示，相較于其他兩組，實驗組的TLR4表達明顯升高，提示在病毒感染后，TLR4被激活，介導的caspase-8效應分子參與了HCMV感染導致肝細胞損傷乃至凋亡的病理生理過程。

綜上所述，關于HCMV感染導致肝臟損傷，傳統(tǒng)的一些靶點已經滿足不了臨床的需要，亟需尋找確實可行的研究方向及靶點。本研究從基因片段入手，將炎癥啟動因子TLR4以及凋亡效應分子caspase-8引入HCMV感染導致肝功能損傷的研究中，并確實發(fā)現(xiàn)HCMV UL144感染后幼鼠體內TLR4和caspase-8表達出現(xiàn)明顯上升，提示UL144可能通過激活TLR4并介導caspase-8參與了HCMV感染肝細胞損傷的病理生理過程，將為HCMV感染肝損傷提供一個全新的靶點及理論依據。但是本文在小鼠體內注入UL144后雖然發(fā)現(xiàn)體內一些與細胞凋亡相關的細胞因子表達出現(xiàn)顯著變化，但未通過抑制劑對TLR4與caspase-8之間的相關性進行深入研究，將在今后予以觀察。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突