滕淑 蔣茂瑩 祁正紅 趙仕勇 陳海哨 林先耀

1杭州市兒童醫(yī)院感染肝病科 310014；2杭州市兒童醫(yī)院兒童保健科 310014

腸道病毒71型（EV71）是引起兒童手足口病的常見病毒之一，其臨床表現(xiàn)輕重不一，重癥病例進(jìn)展迅速，病死率高[1-2]。早期識(shí)別重癥患兒具有重要的臨床意義，但目前手足口病輕重癥病例的鑒別主要依賴于臨床特征，尚缺乏有效可靠的早期生物學(xué)標(biāo)志物。研究表明，機(jī)體在EV71感染后所出現(xiàn)的免疫紊亂以及炎癥反應(yīng)過度激活可加重手足口病患兒病情[3-4]，趨化因子所介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞向炎癥病灶的遷移和運(yùn)動(dòng)發(fā)揮重要作用[5]，故檢測趨化因子有可能成為預(yù)測手足口病患兒病情的潛在指標(biāo)。本研究通過檢測EV71型手足口病患兒的血清趨化因子水平，探討其與病情輕重程度的關(guān)系及其臨床應(yīng)用價(jià)值。

對象與方法

一、研究對象

收集2017年6月至2019年10月杭州市兒童醫(yī)院收治的EV71感染手足口病患兒102例為研究對象。男72例，女30例；發(fā)病年齡0.50～6.67歲，其中發(fā)病年齡＜2歲35例 （34.3%），2～5歲65例（63.7%），＞5歲2例（2.0%）。 參考《手足口病診療指南（2018年版）》中的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)[6]，將患兒分為普通組（42例）、重癥組（60例）。同時(shí)采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取同期在外科病房住院的非感染、擇期手術(shù)的腹股溝疝患兒79例作為對照組，均在其手術(shù)前完成靜脈血樣本的采集。EV71手足口病普通組、重癥組及對照組患兒在年齡、性別上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=3.107，χ2=3.178，P＞0.05）。 本研究已通過杭州市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［倫理審批號(hào)：（2019）年倫理（臨研）第（5）號(hào)］。 所有研究對象的監(jiān)護(hù)人均充分知情，并簽署知情同意書。

研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)符合國家衛(wèi)健委頒布的 《手足口病診療指南 （2018年版）》[6]；（2）實(shí)驗(yàn)室檢測咽拭子EV71核酸陽性；（3）入院時(shí)病程≤3 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時(shí)存在其他腸道病毒感染者；（2）合并有結(jié)核、腫瘤等引起免疫異常疾病的患者；（3）應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑者。

二、樣本采集

102例手足口病患兒在入院24 h內(nèi)采集咽拭子樣本，置于-20℃冰箱保存。所有咽拭子樣本均在24 h內(nèi)完成EV71核酸檢測。

所有EV71型手足口病患兒及對照組患兒均于入院24 h內(nèi)采集靜脈血樣本2 mL。42例普通組患兒中，18例在其疾病恢復(fù)期（即病程第7天）采集第2次靜脈血樣本2 mL；而60例重癥組手足口病患兒中，有24例患兒在其疾病恢復(fù)期（即病程第10天）采集第2次靜脈血樣本2 mL。將靜脈血樣本離心，取其上清液，將血清樣本置于-80℃冰箱中保存待檢。

三、病毒核酸檢測

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測定：使用手足口腸道病毒RNA檢測試劑盒 （中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，廣州），在ABI 7500熒光定量PCR儀（AppliedBiology公司，美國）上進(jìn)行EV71核酸、柯薩奇病毒A組16型（CA16）核酸、腸道病毒通用型核酸載量測定。以107、106、105、104、103拷貝/mL等5個(gè)滴度作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以107和103拷貝/mL兩個(gè)滴度作為質(zhì)控。檢測結(jié)果≥103拷貝/mL為陽性，＜103拷貝/mL為陰性。操作按說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件為：42℃25 min，1個(gè)循環(huán)；94℃3 min，1個(gè)循環(huán)；93℃30 s，55℃45 s，40個(gè)循環(huán)。當(dāng)EV71核酸及腸道病毒通用型核酸檢測陽性，CA16核酸檢測陰性；且腸道病毒通用型病毒載量值和EV71載量值相等時(shí)，則可確定為單純EV71感染。

四、趨化因子檢測

采用高通量多因子液相懸浮芯片技術(shù)（Luminex xMAP） 及Human Cytokine/Chemokine Panel（Merck Cat No.HCYTMAG-60K-PX41）檢測試劑盒檢測血清樣本中趨化因子水平：Fractalkine、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP）-1α、MIP-1β、MCP-3、巨噬細(xì)胞衍生趨化因子（MDC）、IL-8和IFN誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）。操作按照說明書進(jìn)行。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（QR）］表示。計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比及率表示。多組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；多組間計(jì)量資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)（非正態(tài)分布），兩組間計(jì)量資料的比較采用秩和檢驗(yàn)（非正態(tài)分布）；使用受試者工作特征（ROC）曲線分析趨化因子指標(biāo)的診斷效能，選擇預(yù)警重癥EV71手足口病的截?cái)嘀?，比較AUC（ROC曲線下的面積）、靈敏度、特異性和約登指數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EV71型手足口病普通組、重癥組咽拭子病毒載量的比較

EV71型手足口病普通組EV71載量7×103（5×103～50×103）拷貝/mL， 與重癥組患兒的咽拭子病毒載量35×103（5.5×103～90×103）拷貝/mL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.478，P＞0.05），提示EV71手足口病患兒的病情輕重程度與咽拭子病毒載量無關(guān)。

二、EV71型手足口病普通組、重癥組與對照組入組時(shí)血清趨化因子水平

血清MCP-1、MIP-1α、MDC、IL-8和IP-10水平在三組患兒之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=130.635、68.018、66.712、126.166和79.337，P均＜0.05）；血清Fractalkine、MIP-1β、MCP-3水平在三組患兒之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。EV71型手足口病普通組、 重癥組的血清MCP-1、MIP-1α、MDC、IL-8和IP-10水平均高于對照組 （普通組：Z=8.973，5.910，6.742，8.580和6.161； 重 癥 組 ：Z=9.981，7.464，7.799，9.624和8.428，P均＜0.05）。EV71型手足口病重癥組與普通組進(jìn)行比較，EV71型手足口病重癥組的血清MIP-1α和IL-8水平高于普通組（Z=2.207和4.168，P均＜0.05）。EV71型手足口病重癥組與普通組間的血清MCP-1、MDC、IP-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。詳見表1。

表1 EV71手足口病普通組、重癥組和對照組入組時(shí)血清趨化因子水平比較

三、血清趨化因子IL-8、MIP-1α預(yù)警重癥EV71手足口病的ROC曲線分析

EV71型手足口病重癥組與普通組間的血清MIP-1α、IL-8水平有顯著差異，進(jìn)一步繪制ROC曲線顯示：IL-8的AUC為0.743，MIP-1α的AUC為0.629，提示IL-8對重癥EV71手足口病的預(yù)警價(jià)值高于MIP-1α。IL-8的最佳截?cái)嘀担╟ut off）為1 740 pg/mL，此時(shí)約登指數(shù)最大 （0.614），其對應(yīng)的靈敏度為90.0%，特異性為71.4%。詳見圖1和表2。

圖1 趨化因子IL-8、MIP-1α預(yù)警重癥EV71手足口病ROC曲線圖

表2 IL-8、MIP-1α預(yù)警重癥EV71手足口病的ROC曲線分析

四、EV71型手足口病患兒急性期與恢復(fù)期的血清趨化因子水平比較

24例重癥EV71型手足口病患兒恢復(fù)期血清MIP-1α、MDC、IL-8、IP-10水平低于急性期， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。18例普通型EV71型手足口病患兒恢復(fù)期血清MCP-1、MDC、IL-8、IP-10水平較急性期有顯著下降（P＜0.05）。詳見表3。

表3 重癥組EV71型手足口病患兒急性期與恢復(fù)期血清趨化因子水平的比較

討 論

迄今為止，EV71型手足口病患兒出現(xiàn)重癥并發(fā)癥的機(jī)制尚未完全闡明。近年來人們逐漸認(rèn)識(shí)到炎癥反應(yīng)在EV71感染患兒疾病發(fā)展過程中的重要作用[7]。Fractalkine是趨化因子CX3C亞家族的唯一成員，它可介導(dǎo)趨化，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，參與炎癥免疫應(yīng)答[8]。MCP-1、MIP-1α、MIP-1β 和MCP-3均屬于趨化因子CC亞家族成員，主要趨化和激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等炎癥相關(guān)細(xì)胞至炎癥部位，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)展[9]。MDC是CC亞家族的一種趨化因子，主要促使Th2細(xì)胞遷移至炎癥部位，從而引起Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[10]。IL-8和IP-10均屬于CXC亞族成員。IL-8生物學(xué)活性主要是趨化T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答[11]。IP-10可促使Th1細(xì)胞定向遷移至特定的組織中從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[12]。

本研究顯示，EV71型手足口病普通型組、重癥組的血清MCP-1、MIP-1α、MDC、IL-8和IP-10水平均高于對照組，且重癥組血清MIP-1α和IL-8水平顯著高于普通型組，進(jìn)一步的ROC曲線分析表明，IL-8對重癥EV71型手足口病的預(yù)警價(jià)值優(yōu)于MIP-1α，且具有較高的靈敏度和特異性，建議血清IL-8可作為早期預(yù)警EV71型手足口病重癥化的一個(gè)較好指標(biāo)。當(dāng)EV71型手足口病患兒早期血清IL-8>1 740 pg/mL時(shí)，要高度警惕該患兒為重癥病例的可能，需密切觀察病情變化，予以積極的診治。諸多研究表明，IL-8與EV71型手足口病患兒病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4，13]。本研究結(jié)果顯示，無論是重癥還是普通型EV71型手足口病患兒，隨著患兒病情的好轉(zhuǎn)，血清IL-8表達(dá)水平均明顯下降，提示IL-8參與了EV71型手足口病的疾病發(fā)生發(fā)展的過程。

綜上所述，血清IL-8水平與EV71型手足口病患兒病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其可作為重癥EV71型手足口病的一個(gè)較好的預(yù)警指標(biāo)。但本研究樣本量偏小，結(jié)果可能具有一定局限性，也未能連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察趨化因子變化趨勢，有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突