5 種蒿屬植物提取物對(duì)馬鈴薯晚疫病的抑菌活性研究

何彥儀 羅雨薇 許美瀅 竺永金 鄭紅宇 胡世俊 閆曉慧

（1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233）

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophtora infestans）引起、對(duì)馬鈴薯（Solanum tuberosum）具有毀滅性的疾病[1]。馬鈴薯晚疫病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播、危害大、難防控，已經(jīng)超過(guò)水稻稻瘟病和小麥銹病，被視為國(guó)際第1 大作物病害[2-3]。馬鈴薯晚疫病的防治措施均以化學(xué)防治為主，輔以簡(jiǎn)易的生物防治與物理防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用次數(shù)和劑量的增加在一定程度上促使致病菌株產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染與農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，導(dǎo)致防治效果降低[4]。植物源農(nóng)藥具有對(duì)生態(tài)環(huán)境安全、非靶標(biāo)生物影響較小、原材料來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，因此從植物中尋找新的殺菌抑菌活性物質(zhì)、研制開(kāi)發(fā)新型植物源農(nóng)藥是當(dāng)下的熱點(diǎn)[5]。

牛尾蒿（Artemisia dubia）隸屬菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia），為中國(guó)特有種，生于海拔3500 m 以下的山坡、草原、疏林及林緣地，主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、四川、云南、西藏等省份[6]。研究表明，蒿屬植物及其活性化合物被認(rèn)為具有抗瘧、抗氧化、驅(qū)蟲(chóng)、神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗微生物等作用[7]。牛尾蒿為我國(guó)傳統(tǒng)藏藥，可作牲畜飼養(yǎng)材料；結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，牛尾蒿具有多種生物活性，如對(duì)煙草甲（Lasioderma serricorne）具趨避活性、抗豬流行性腹瀉病毒等[8–10]；目前牛尾蒿在應(yīng)用研究上大多為藥用上的研究，有研究指出牛尾蒿提取物對(duì)人體致病菌，如白色念珠菌（Candida albicans）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和大腸桿菌（Escherichia coli）均有不同程度的抑制活性[11]。

本研究以5 種蒿屬植物的乙醇提取物為供試材料，對(duì)2 株馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定并進(jìn)行活性成分篩選，為深入研究其抑菌活性成分、防治馬鈴薯晚疫病提供了新思路，也為植物源新農(nóng)藥的先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)[12-13]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

植物材料于2018 年5—8 月份采自云南昆明（102°10′～103°40′E，24°23′～26°22′N）、遼寧喀左（119°24′～120°23′E，40°47′～41°33′N）（表1），由西南林業(yè)大學(xué)胡世俊副教授鑒定，植物樣品保存于云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 供試植物名錄Table 1 List of tested plants

1.1.2 供試菌株

馬鈴薯晚疫病菌pn5502 和pn7604 菌株，由云南省農(nóng)科院趙志堅(jiān)研究員提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用黑麥培養(yǎng)基。按照黑麥60 g、瓊脂18 g、白砂糖15 g、水1000 mL 的比例制作黑麥培養(yǎng)基。

1.2 儀器與試劑

N?1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司，中國(guó)）、柱層析硅膠及GF254 薄層層析硅膠板（青島海洋化工廠，中國(guó)）；72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑（上海杜邦農(nóng)化有限公司，中國(guó)），試劑甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿及二甲基亞砜（云南楊林汕滇藥業(yè)有限公司，中國(guó)）等試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 植物提取物及牛尾蒿提取物不同餾分的制備

植物材料風(fēng)干粉碎，采用乙醇回流提取法[14]，分別提取3 次，每次4 h。合并3 次提取液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀，得到乙醇提取物備用。牛尾蒿提取物經(jīng)常壓硅膠柱層析，以石油醚、石油醚?丙酮（V石油醚∶V乙酸乙酯=30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1）、氯仿?甲醇（V氯仿∶V甲醇=1∶1）等溶劑系統(tǒng)依次進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層層析檢測(cè)，合并相同組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收溶劑，得到Fr1～Fr1010 個(gè)不同餾分。

1.3.2 抑菌活性測(cè)定方法

已純化的馬鈴薯晚疫病菌在無(wú)菌環(huán)境下挑取菌絲接到黑麥培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每4～5 d進(jìn)行1 次，直至病菌長(zhǎng)滿平板，在菌落邊緣打菌餅備用[15]。采用帶毒平板法[16-17]測(cè)定5 種蒿屬植物粗提物抑菌活性，將植物提取物用二甲基亞砜（DMSO）配置成100 mg/mL 的母液并采用巴氏消毒法對(duì)母液進(jìn)行滅菌備用，無(wú)菌條件下將一定量的母液加入即將冷卻的已滅菌黑麥培養(yǎng)基中并充分混勻，使提取物最終濃度為1 mg/mL，以含等量DMSO 溶劑的黑麥培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（CK），陽(yáng)性對(duì)照為同濃度的霜脲·錳鋅。待培養(yǎng)基凝固后，每皿中央接入1 個(gè)菌餅（Φ=5 mm），每個(gè)處理重復(fù)3 次；28 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用十字交叉法對(duì)菌落進(jìn)行測(cè)量，記錄其平均直徑。按公式（1）～（2）計(jì)算抑制率。

1.3.3 抑制中濃度（EC50）測(cè)定方法

將牛尾蒿乙醇提取物餾分Fr1制成0.25、0.125、0.0625、0.03125、0 mg/mL 5 個(gè)濃度的帶毒平板，觀察2 株馬鈴薯晚疫病菌的生長(zhǎng)情況，根據(jù)Fr1在不同濃度下對(duì)2 株菌的抑制效果，分別針對(duì)2 株菌設(shè)定濃度梯度進(jìn)行毒力測(cè)定：1）對(duì)菌株pn7604 濃度為62.5、31.25、15.625、7.8125、0 μg/mL；2）對(duì)菌株pn5502 濃度為1、5、2.5、1.25、0 μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，分別求出各供試組分的毒力回歸方程、EC50值、95%置信區(qū)間和決定系數(shù)（R2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種植物粗提物的抑菌活性

由表2 可知，5 種植物提取物在1 mg/mL 下對(duì)2 株供試病原菌有不同程度的抑菌作用，抑菌率為28.08%～89.04%，不同提取物抑菌作用存在極顯著差異（P<0.01），其中牛尾蒿提取物對(duì)供試菌株pn5502、pn7604 的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率分別為89.04%和71.38%。

表2 5 種植物粗提物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌菌株pn5502、pn7604 的抑制率Table 2 Results of the antifungal activities of 5 plant crude extracts against pn5502 and pn7604 strains of P. infestans

2.2 牛尾蒿各餾分對(duì)供試菌株的抑菌活性篩選

由表3 可知，餾分Fr1在0.5 mg/mL 下對(duì)2 株供試菌有顯著抑菌活性，抑制率均高達(dá)100%，此外餾分Fr2、Fr5、Fr6也顯示出較高的抑菌效果，抑菌率均在50%以上。

表3 牛尾蒿的不同餾分對(duì)馬鈴薯晚疫病菌菌株pn5502 的抑制率Table 3 Antifungal activity of different fractions of A.dubia against pn5502 of P. infestans

根據(jù)表4 的活性測(cè)定結(jié)果，擬合出各提取物的毒力方程見(jiàn)表5；陽(yáng)性對(duì)照對(duì)pn5502、pn7604 的EC50分別為273.8000、155.0000 μg/mL；Fr1對(duì)pn5502、pn7604 的EC50分別為7.4733、9.4634 μg/mL，明顯高于陽(yáng)性對(duì)照。

表4 牛尾蒿餾分Fr1 濃度梯度活性篩選Table 4 Concentration gradient activity screening of A.dubia Fr1

表5 Fr1、霜脲·錳鋅對(duì)pn5502、pn7604 抑制的回歸分析Table 5 The concentration for 50% of maximal effect of Fr1,cymoxanil·mancozeb on pn5502 and pn7604

2.3 牛尾蒿提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響

由圖1 可知，牛尾蒿Fr1餾分處理后的2 株馬鈴薯晚疫病菌與CK 有明顯差異。正常生長(zhǎng)的pn5502、pn7604 菌絲體粗細(xì)均勻、表面光滑、分枝較少、發(fā)育正常、內(nèi)含物豐富且均勻分布，受抑制的菌絲均產(chǎn)生明顯的畸變，F(xiàn)r1（31.25 μg/mL）處理的pn5502、pn7604 菌絲變得粗大分枝較多，且分枝間距密集，菌絲體內(nèi)含物聚集，細(xì)胞壁不光滑，出現(xiàn)明顯畸形。霜脲·錳鋅（250 μg/mL）處理的pn7604 菌絲形態(tài)與Fr1（31.25 μg/mL）處理相似，表明餾分Fr1對(duì)pn5502、pn7604 菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，且活性明顯高于陽(yáng)性對(duì)照。

圖1 pn5502、pn7604 菌絲生長(zhǎng)情況顯微圖Fig.1 Micrograph of mycelium growth of pn5502 and pn7604

3 結(jié)論與討論

目前防治馬鈴薯晚疫病主要依靠培育抗病品種和施用化學(xué)藥劑，由于致病疫霉遺傳變異迅速，已出現(xiàn)能克服現(xiàn)有全部抗病基因的菌株，且致病疫霉屬于卵菌，無(wú)細(xì)胞甲殼素和麥角固醇，單獨(dú)使用殺菌劑防治效果差，難以完全有效地控制該病，且單純依靠傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治具有局限性[18-20]，因此尋找新的安全的防治方法勢(shì)在必行。近年來(lái)，生物防治已成為研究熱點(diǎn)，利用植物源提取物和微生物農(nóng)藥防治馬鈴薯晚疫病受到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注。已有研究表明知母水提取物、九里香乙醇粗提物對(duì)致病疫霉的生長(zhǎng)和游動(dòng)孢子釋放有顯著的抑制作用，且提取物的抑制作用與濃度呈正相關(guān)，EC50值分別為1.91 mg/mL和6.51 mg/mL，地果甲醇提取物濃度為1 mg/mL時(shí)抑菌率達(dá)90%[21-24]。本研究篩選了5 種蒿屬植物提取物對(duì)2 株馬鈴薯晚疫病菌的抑制活性，結(jié)果表明5 種提取物在濃度為1 mg/mL 的濃度下均對(duì)供試菌株具有一定的抑菌活性，其中牛尾蒿提取物對(duì)馬鈴薯晚疫病病菌pn5502 和pn7604 的抑菌活性均為最高，青蒿提取物次之；進(jìn)一步對(duì)牛尾蒿提取物的抑菌活性成分進(jìn)行了追蹤，發(fā)現(xiàn)餾分Fr1具有顯著抑菌活性，在濃度為0.5 mg/mL對(duì)2 株供試菌株的抑菌率均高達(dá)100%，并且呈顯著的劑量效應(yīng)，經(jīng)不同濃度梯度測(cè)定餾分Fr1對(duì)pn5502、pn7604 的EC50值分別為7.4733 μg/mL、9.4634 μg/mL 顯著高于陽(yáng)性對(duì)照藥劑霜脲·錳鋅，其對(duì)2 株菌的EC50分別為273.8 μg/mL 和169 μg/mL，顯微觀察發(fā)現(xiàn)被餾分Fr1處理后的菌絲會(huì)出現(xiàn)明顯的畸形，因此有必要進(jìn)一步闡明其抑菌活性成分，及其作用機(jī)制。楊立賓等[25]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉發(fā)酵液乙酸乙酯提取物降低了致病疫霉菌體可溶性蛋白含量，降低菌體保護(hù)酶活性，使菌體丙二醛含量升高，提高菌體電導(dǎo)率，降低菌體呼吸速率，致病疫霉系統(tǒng)清除自由基出現(xiàn)障礙、細(xì)胞膜被破壞、電解質(zhì)外露，對(duì)致病疫霉有直接抑制作用。林敏等[26]研究發(fā)現(xiàn)亞磷酸鹽作為新型植物誘抗劑，除直接作用于致病疫霉菌絲的生長(zhǎng)和游動(dòng)孢子的釋放外，還可以通過(guò)刺激植物體內(nèi)抗病物質(zhì)的產(chǎn)生和積累等起到間接防病作用。本研究發(fā)現(xiàn)正常生長(zhǎng)的致病疫霉菌絲體粗細(xì)均勻、表面光滑、分枝較少、發(fā)育正常、內(nèi)含物豐富且均勻分布，而牛尾蒿餾分Fr1處理后病原菌菌絲體出現(xiàn)分枝增多、表面粗糙、內(nèi)含物聚集等現(xiàn)象，與陽(yáng)性對(duì)照藥劑霜脲·錳鋅處理的癥狀類似，表明致病疫霉處于明顯的脅迫條件。上述異常癥狀的出現(xiàn)可能與牛尾蒿餾分Fr1中存在的活性成分破化了菌體的正常代謝，使得菌體細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)大量積累，嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致菌絲出現(xiàn)畸形。牛尾蒿是我國(guó)傳統(tǒng)的藏藥，具有很高的藥用價(jià)值[27]。牛尾蒿農(nóng)用研究多為飼喂牲畜、精油化學(xué)成分研究、生物多樣性研究、土壤重金屬修復(fù)；目前對(duì)牛尾蒿生物活性的篩選和評(píng)價(jià)大多停留在其精油的殺蟲(chóng)活性[28-31]，而對(duì)其化學(xué)成分在殺蟲(chóng)、抑菌等生物農(nóng)藥活性方面報(bào)道相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)了牛尾蒿提取物在離體條件下對(duì)馬鈴薯晚疫病菌良好的抑菌活性，豐富了牛尾蒿生物活性的范疇，后續(xù)我們可以進(jìn)一步進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其在田間防治馬鈴薯晚疫病的實(shí)際防效，闡明具體的活性成分及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)綠色無(wú)公害、環(huán)境友好型植物源農(nóng)藥[32]提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。