魏 健，張欣欣，劉 坤，陳南翔

1 解放軍總醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853；2 國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100853

全世界范圍內(nèi)約4.5%的腫瘤與人乳頭瘤狀病毒(human papilloma virus，HPV)相關(guān)[1-2]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，口咽癌的發(fā)生與HPV感染相關(guān)[3-5]。最新版美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)腫瘤TNM分期已將HPV陽性口咽癌進行單獨分期[6]。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)頭頸腫瘤臨床指南更增加了針對HPV陽性口咽癌的規(guī)范化診療原則[7]。然而HPV對扁桃體癌的致癌機制尚不明確。在宮頸癌中，HPV的致癌作用已經(jīng)被證實主要是通過其癌基因表達的相關(guān)癌蛋白E6和E7實現(xiàn)的[8-11]。Akagi等[12]提出了一種“環(huán)”模型，通過該模型，發(fā)現(xiàn)HPV整合引起的DNA復(fù)制和重組可能導(dǎo)致病毒-細胞DNA連接體形成，破壞了抑制腫瘤發(fā)生的基因，并擴增HPV癌基因E6和E7，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。因此，病毒基因組整合是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵一步。基于上述認知，本研究選擇口咽癌中HPV感染率最高的扁桃體癌為研究對象。通過HPV基因捕獲和二代測序技術(shù)，分析扁桃體癌患者HPV的感染情況以及HPV DNA整合到人類基因組中的位點，揭示HPV相關(guān)扁桃體癌的致病機制。

材料和方法

1 樣本來源 收集2015年10月- 2020年7月解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治的扁桃體鱗癌患者的臨床資料，共收集32例樣本，包括19例扁桃體癌新鮮冷凍標本和13例扁桃體癌石蠟包埋組織標本。本研究經(jīng)過解放軍總醫(yī)院倫理委員會審批(倫審第S2019-056-01號)。

2 主要儀器與試劑 NanoDrop 1000分光光度計(v3.7.1)、全自動基因擴增儀(PCR System 9700)、Illumina HiSeq 2000測序儀、高速臺式離心機(Centrifuge 5424R)、微孔洗板機(Elx50)、Rotor Gene 6000熒光定量PCR儀、光學(xué)顯微鏡、恒溫可調(diào)節(jié)式烤片機(HI1220)、恒溫可調(diào)節(jié)式撈片機(HI1210)、石蠟切片機(RM2245)；Proteinase K溶液、DNA提取試劑盒(康為世紀、Qiagen)、GA緩沖液。

3 DNA的提取 1)石蠟包埋組織樣本DNA的提?。菏紫葘⑶泻玫氖炃衅?至少5個切片)放入1.5 mL EP管，EP管中加入二甲苯進行脫蠟，搖晃20 s。然后將EP管離心2 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min。加入1 mL無水乙醇，混合均勻；再次離心2 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min。接著向a管中加入20 μL Proteinase K溶液和200 μL GA緩沖液混勻配制成的溶液，依次56℃水浴1 h，90℃水浴1 h；最后采用DNA提取試劑盒(康為世紀、Qiagen)提取DNA。2)新鮮組織標本DNA的提?。菏紫葘吮颈砻娴馁A存液吸干，倒入液氮，用研缽將其研磨成粉末，加入1 mg Proteinase K，37℃水浴2 h。加入1 mL 5 mol/L NaCl溶液，搖勻后離心1 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min；然后取上清置于新的無菌離心管，加入酚、氯仿、異戊醇混勻配制成的溶液，待分層后離心5 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min；接著將上清移至15 mL離心管，在通風(fēng)櫥中加入乙醚進行抽提，吸除上層乙醚；加入3 mol/L的NaAc，再加入無水乙醇，混勻后在室溫下靜置20 min，沉淀DNA。最后用玻璃棒鉤取白色絮狀DNA沉淀，用70%乙醇進行漂洗，溶解于1 mL TE，置于-20℃冰箱保存。

4 文庫構(gòu)建及目的基因捕獲 運用Covaris打斷法，將樣品DNA打碎為100～700 bp范圍的片段；對片段進行末端修復(fù)、加poly‘A’尾及產(chǎn)物磁珠純化；運用PCR進行文庫擴增并對產(chǎn)物磁珠純化；使用Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳對文庫進行質(zhì)檢；使用根據(jù)17種HPV型(6、11、16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、69、82)的全基因組設(shè)計的HPV探針，與文庫DNA液相雜交；用鏈霉親和素修飾的磁珠共價結(jié)合生物素標記的探針，抓取目的基因；磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠，洗脫純化，富集目的基因。

5 上機測序 采用Illumina獨特的“橋式”擴增反應(yīng)，Illumina HiSeq 2000測序儀將文庫加載到測序芯片F(xiàn)lowcell。測序策略PE150，測序深度為500 ×。

6 生物信息分析 對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)；使用BWA程序?qū)⒌玫降母哔|(zhì)量數(shù)據(jù)與每個HPV參考基因組匹配分析，并使用GATK軟件包重新校準。若一對讀碼的一端是唯一映射到一個人類染色體和HPV參考基因組的，則這對讀碼被確定為不一致的讀碼對。如一個特定的位置有3個以上的不一致的讀碼對，其將被認為是一個潛在的HPV整合位點，整合位點的斷點使用Break Dancer程序進行識別。整合位點的注釋依據(jù)人類基因組hg19和HPV基因組注釋信息。如一個配對端讀碼不能匹配到人類基因組，但能匹配到HPV基因組，其將被標記為HPV DNA信號，供后續(xù)分析。根據(jù)這些數(shù)據(jù)計算HPV基因組的覆蓋范圍、深度和匹配度。當平均測序深度大于10，且超過50%病毒基因組總長度至少覆蓋4倍時，該樣本被認為是HPV DNA陽性。

7 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料的組間比較采用Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 扁桃體癌患者的臨床資料 32例扁桃體癌患者中，男性28例，女性4例，年齡43～78歲，中位年齡57歲；1例為臨床Ⅱ期，8例臨床Ⅲ期，23例臨床Ⅳ期。

2 HPV捕獲類型 捕獲的所有DNA樣品主要有5種HPV類型(HPV16、18、33、53、67)。在這32例樣本中，有22例樣本HPV16 DNA表達陽性，見圖1。除了HPV16，在這32例樣本中還檢測出HPV18、33、53、67，分別檢測出1次。此外分別在3例樣本中檢出兩種類型以上的HPV，在T22中包含HPV33和HPV16，在T24中包含HPV53、HPV58和HPV18，在T26中包含HPV16和HPV31。但在T22中，HPV33的測序深度比HPV16大152倍；在T24中，HPV53的測序深度比HPV58大52倍，比HPV18大35倍；在T26中，HPV16的測序深度比HPV31大26倍。因此，在隨后的分析中僅分析了T22中的HPV33、T24中的HPV53和T26中的HPV16。

圖1 HPV亞型在32例扁桃體癌樣本中的分布Fig.1 Distribution of HPV subtypes in 32 samples of tonsil carcinoma

3 HPV整合位點 在26例HPV DNA陽性病例中，共發(fā)現(xiàn)218個潛在的HPV整合位點，其中包括20例HPV16，1例HPV18，1例HPV53，1例HPV67。HPV16 DNA整合率為91%(20/22)。此外，在2例HPV16和1例HPV33 DNA陽性樣本中未檢測到HPV整合。對于這218個潛在的HPV整合位點，根據(jù)其在HPV基因組和人染色體上所處的位置，對其進行篩選，剔除重復(fù)的整合位點，共獲得173個整合位點。其中HPV16中有155個整合位點，HPV67中有12個整合位點，HPV18和HPV53中各有3個整合位點。

4 HPV整合位點在病毒基因組上的位置 HPV16整合陽性的20例樣本中155個整合位點廣泛分布于整個HPV基因組中，具有獨特的分布特征，包 括E1(n=41)、E2(n=13)、E2/E4(n=6)、E5(n=2)、E6(n=4)、E6/E7/E1(n=2)、L1(n=49)、L2(n=26)、L2/E2/E4/E5(n=2)、L2/L1(n=7)、LCR(n=3)，見圖2A。整合位點出現(xiàn)頻率最高的區(qū)域是E1和L1，其次是E2和L2，最稀疏的是LCR和E5。此外，HPV16整合位點在每個樣本出現(xiàn)的頻率范圍為1～43，在75%(16/20)的HPV16 DNA整合陽性樣本中發(fā)現(xiàn)2個及2個以上的整合位點，見圖2B。

圖2 整合位點的分布，根據(jù)HPV基因組中的位置，A顯示了在20個HPV16整合陽性病例中確定的153個整合斷點，B顯示了20個HPV16整合陽性扁桃體癌樣本中155個整合位點的頻率Fig.2 Distribution of integration sites. According to the position in the HPV genome, 153 integration breakpoints were identified among the 20 HPV16 integration positive cases (A); The frequency of 155 integration sites in 20 HPV16 integration positive tonsil carcinoma samples (B)

5 HPV整合位點在染色體上的位置 將HPV整合位點定位到染色體，發(fā)現(xiàn)整合位點幾乎位于除Y染色體之外的所有染色體上(圖3)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)幾個整合位點聚集在某些染色體區(qū)域中，如17q12(0.26 M，CDK12)，14q32.32(0.05 M，EXOC 3L4)，Xp11.3(0.12 M，KDM6A)，2p11.2(0.005 M，LOC101927050)，14q32.2(0.11 M，LINC01550)，1q21.3(0.27 M，HRNR)，14q13.3(0.15 M，MIPOL1)和3q28(0.02 M，TP63)。將處在同一基因片段上的3個或3個以上的HPV整合位點定義為“簇”，其跨度介于0.005 ～ 0.27 Mb。通過分析這些簇的詳細特征，將它們分為三組。在第一組中，每個樣本在同一個基因帶存在3個或3個以上的HPV整合位點，并且有可能將它們整合在一個串聯(lián)的陣列中，這與Akagi等[12]提出的“環(huán)”模型一致。如HPV整合簇在T12(n=5)中映射為17q12，在T20(n=10)中映射為14q32.32，在T6(n=3)中映射為14q32.2，在T30(n=12)中映射為1q21.3。在第二組中，HPV整合簇至少在3個樣本中出現(xiàn)，這可能代表真實的熱點，例T12(n=1)中的14q13.3，該整合位點同樣也在T13(n=2)、T14(n=2)和T17(n=2)中出現(xiàn)。在最后一組中，HPV整合簇同時具有上述兩組特性，如T12中的17q12(n=1)、T14(n=1)和T19(n=3)。見圖3。

圖3 23例中173個HPV整合位點的染色體定位Fig.3 Chromosomal location of 173 HPV integration sites in 23 cases

6 HPV16陽性且整合數(shù)大于1組與HPV16陰性或無HPV整合組比較 將32例患者分為HPV16陽性且整合數(shù)大于1組與HPV16陰性或無HPV整合組，分別對性別、年齡、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分化程度進行Fisher精確檢驗，發(fā)現(xiàn)兩組間除有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002)，其他臨床資料均無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 32例扁桃體癌患者的臨床資料(n)Tab. 1 Clinical data about 32 patients with tonsil carcinoma (n)

討 論

目前在檢測人類基因組中HPV整合位點的研究中，大多數(shù)采用PCR的方法[13-15]，這些檢測方法的敏感度可能會受到HPV狀態(tài)(游離或整合)、病毒的拷貝數(shù)以及整合形式(單拷貝或串聯(lián)形式)的影響[16]。本研究將HPV捕獲與二代測序相結(jié)合，能夠以高特異性和高敏感度在單次運行中檢測出不同分型的病毒，還具有能區(qū)分多種背景的能力，主要是附加型或串聯(lián)型，整合形式的數(shù)量，并進一步確定病毒和細胞連接之間的序列。

本研究采用17種HPV全基因組探針捕獲HPV目的基因，同時檢測32例扁桃體癌標本的HPV亞型和HPV DNA整合位點，其中HPV DNA陽性占81.3%(26/32)，包括HPV16(22/32，68.8%)、HPV18(1/32，3.1%)、HPV33(1/32，3.1%)、HPV53(1/32，3.1%)和HPV67(1/32，3.1%)。這與國際上報道的數(shù)據(jù)基本一致[17-18]。通過這種檢測方法，獲得了153個HPV整合位點。在22例HPV16 DNA陽性扁桃體癌樣本中，91%(20/22)存在HPV整合位點，表明HPV16陽性的扁桃體癌中存在大量整合病毒基因組。這與HPV16陽性子宮頸癌中存在大量整合的病毒基因組的報道類似，可能是扁桃體癌發(fā)生的機制之一。

在本研究中，有多個HPV整合位點在樣本中重復(fù)出現(xiàn)，包括MIPOL1、CDK12、EXOC3L4、TP53、LINC01550、KDM6A等基因。其中MIPOL1和CDK12分別在4例樣本和3例樣本中出現(xiàn)，極有可能是腫瘤發(fā)生的熱點基因。MIPOL1是Laurin-Sandrow綜合征的致病基因，Laurin-Sandrow綜合征是一種先天性多指畸形[19]。但MIPOL1在癌癥發(fā)展中的作用尚不明確。有研究報道MIPOL基因是一種抑癌基因，在抑制鼻咽癌的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移方面起關(guān)鍵作用[20]。HPV整合位點的插入可能導(dǎo)致該抑癌基因的失活，從而促進扁桃體癌的發(fā)生。CDK12是一種與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，CDK12的mRNA和蛋白表達在宮頸癌患者中均顯著上調(diào)。CDK12上調(diào)還與宮頸癌進展和預(yù)后不良密切相關(guān)[21]。HPV整合位點的插入可能導(dǎo)致該致癌基因表達上調(diào)，從而促進扁桃體癌的發(fā)生?？偠灾?，CDK12和MIPOL1是首次在扁桃體癌中發(fā)現(xiàn)的突變基因，可能與扁桃體癌的發(fā)生相關(guān)。

有研究報道HPV相關(guān)口咽癌患者通常為男性、較年輕，原發(fā)腫瘤常較小，容易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)常較大[7,22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)HPV16整合的扁桃體癌均出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時發(fā)現(xiàn)87.5%的患者為男性，與國際上的報道一致。由于本研究納入的病例數(shù)較少，未發(fā)現(xiàn)HPV感染與年齡之間的相關(guān)性。

綜上所述，本研究中扁桃體癌患者HPV的陽性率與國內(nèi)外研究結(jié)果整體一致，HPV陽性的扁桃體癌大多具有HPV整合。本研究發(fā)現(xiàn)MIPOL1和CDK12兩個熱點基因可能與HPV相關(guān)扁桃體癌的發(fā)生有關(guān)，在后續(xù)的研究中可以針對這兩個基因進行預(yù)后的判斷和靶向治療。此外HPV陽性與HPV陰性扁桃體癌的預(yù)后不同可能是由于致癌機制不同。由于基因捕獲測序只能檢測到HPV整合的情況，若無HPV感染，則檢測不到HPV整合。因此在接下來的研究中，我們將分別對HPV陽性與HPV陰性的扁桃體癌組織進行全外顯子測序，探索HPV陽性與HPV陰性扁桃體癌致癌機制不同之處，從而進一步剖析HPV相關(guān)扁桃體癌的致癌機制。