朱子鵬，劉 娜，李 影，王 辰,2，張 璇,2，顧 斌

1 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 口腔科，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 骨科研究所，北京 100853

牙 髓干細 胞(dental pulp stem cells，DPSCs)于2000年由Gronthos等[1]在人恒牙牙髓組織中分離培養(yǎng)出，其可多向分化、高度增殖，并且能形成牙髓-牙本質復合體。還能夠分化為脂肪、肌肉、軟骨、神經等細胞類型。由于其獲取方便、易于保存，逐漸成為組織細胞工程中的研究熱點。牙髓干細胞可以通過誘導活化T細胞參與機體的免疫調節(jié)，是一種理想的干細胞來源，為神經損傷和神經退行性疾病的治療提供了一種新思路[2]。目前認為牙髓干細胞作為種子細胞參與組織工程有一定優(yōu)勢，但其免疫學特性及作用機制尚不明確。研究發(fā)現研究腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)可以通 過 核 轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路促進DPSCs向成骨細胞分化[3]。另有研究發(fā)現DPSCs可使調節(jié)性T細胞顯著增加，輔助性T17細胞減少[4]。CD3+T細胞是主要的免疫效應細胞。所以在本實驗中，我們用TNF-α刺激細胞模擬炎癥微環(huán)境，初步探索在炎癥微環(huán)境中DPSCs與CD3+T細胞共培養(yǎng)后成骨細胞相關因子、炎性因子和Wnt經典通路因子的mRNA表達情況。

材料和方法

1 材料 α-MEM培養(yǎng)基，胎牛血清(Gibco美國)；PBS緩沖液(HyClone美國)、Ⅰ型膠原酶(Sigma美國)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco美國)、青鏈霉素(Gibco美國)。人牙髓干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基、人牙髓干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)基(Cyagen美國)、外周淋巴細胞分離液(天津灝洋)、RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco美國)。CCK8試劑盒(日本同仁)；實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國)；RNA提取和逆轉錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；引物(華大基因)，超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)。CO2恒溫孵箱(Thermo，美國)。

2 樣本收集 2020年8月于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心口腔頜面外科門診獲得離體阻生齒8顆，來源于18～35歲成年男性。所有阻生齒要求無齲壞、牙周組織健康、無牙髓炎及根尖周炎；所有患者無系統(tǒng)性疾病，血常規(guī)指標正常，無吸煙史，半年內無用藥史。另從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心輸血科獲取人外周血白膜層細胞濃縮樣本4份，來源于20～40歲成年男性，捐獻者身體健康，近半年無服藥史。以上樣本獲取均經解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準并征得捐獻者的知情同意。

3 牙髓干細胞的分離培養(yǎng) 拔牙前充分消毒，將脫落下來的牙放入含1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，在無菌操作臺中使用大量PBS溶液對離體磨牙進行表面沖洗，劈冠法取出牙髓并剪碎，裝入含有Ⅰ型膠原酶的EP管中，放入37℃恒溫箱1 h，期間每隔20 min震蕩一下。2 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸混勻后加入培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)7～10 d。當細胞生長融合至90%時使用胰蛋白酶-EDTA進行消化，標記為第1代。使用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙髓干細胞，并使用第3～5代進行實驗。

4 CD3+T細胞的分離培養(yǎng) 將取得的外周血放入抗凝管中。取10 mL全血加入等體積的PBS溶液混合均勻，向其中先加入20 mL人淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心30 min。取出離心后的液體分為三層，用吸管緩慢吸取中間的白膜層，主要包括淋巴細胞和單核細胞，即外周血單個核細胞。將細胞吸入到15 mL離心管中，加入少量Buffer緩沖液，然后在溶液中加入5 μL CD3+免疫磁珠并混勻，避光孵育20 min，300 g離心10 min，在磁力分選架上分選獲得CD3+T細胞。將CD3/CD28免疫磁珠預先洗滌后與CD3+T細胞1∶1混合培養(yǎng)用來細胞激活，3 d后將細胞和磁珠分離，獲得的細胞加入含有白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的RPMI 1640培養(yǎng)液中刺激生長，于37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d換液，當細胞密度達到2 × 106/mL傳代培養(yǎng)。

5 TNF-α刺激DPSC后CCK8檢測細胞增殖能力 選擇P3代的DPSCs以1 × 105/mL的密度接種于4個96孔板中，每板共接種4組，其中3組為實驗組，實驗組中的細胞分別用TNF-α濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL的細胞培養(yǎng)液預刺激24 h；1組為對照組，對照組中加入不含有TNF-α的細胞培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)。待細胞生長融合至80%時開始計時實驗。培養(yǎng)細胞1 d、3 d、5 d、7 d后每孔分別加入10 μL CCK8溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。

6 DPSCs向成骨細胞誘導分化實驗 將P3代細胞接種到兩個6孔板中，兩個板分別標記為正常組和刺激組，以2 × 105/mL的細胞密度接種，其中刺激組的細胞用10 ng/mL TNF-α提前刺激24 h。每孔加入含有1%青鏈霉素、10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。當細胞密度匯合至60%時去掉細胞培養(yǎng)液，并用PBS沖洗，換成2 mL成骨培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，21 d時用PBS溶液沖洗細胞板，用多聚甲醛固定細胞30 min，加入茜素紅染色液染10 min，然后洗去染色液，并在顯微鏡下觀察后拍照。

7 DPSCs向成脂細胞誘導分化實驗 將P3代細胞以2 × 105/mL的細胞密度接種，每孔加入含有1%青鏈霉素、10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)，當細胞密度匯合至60%時去掉細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗，改為2 mL成脂培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，直到24 d后棄液，PBS溶液沖洗細胞板，用多聚甲醛固定細胞30 min，加入油紅O染色液染10 min，洗去染色液，顯微鏡下觀察后拍照。

8 DPSCs與CD3+T細胞直接共培養(yǎng) 將DPSCs消化接種到48孔板中，接種密度為1 × 104/mL，每孔補液至500 μL，待24 h后細胞貼壁，計數CD3+T細胞混懸液密度為2 × 106/mL。按照上述計 數 將DPSCs：CD3+T細 胞 按1∶0、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100比例混合共培養(yǎng)。加入前每組先吸出細胞液0 μL、25 μL、50 μL、125 μL、250 μL，再向每組分別加入0 μL、25 μL、50 μL、125 μL、250 μL CD3+T細胞混懸液，每個濃度設4個副孔，培養(yǎng)48 h，正常組細胞接種后用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，TNF-α刺激組需要將接種后的DPSCs用10 ng/mL TNF-α的培養(yǎng)液刺激培養(yǎng)24 h。

9 qPCR檢測DPSCs的炎性因子、Wnt通路相關因子的mRNA表達 48 h后吸出CD3+T細胞懸液，向孔板內用PBS緩沖液沖洗兩次，留下貼壁生長的DPSCs。每孔加入Trizol裂解細胞，提取RNA，測濃度后反轉錄為cDNA，采用Sybr Green試劑盒進行定量PCR檢測，反應體系為20 μL。引物序列如表1。反應條件：95℃變性20 min，95℃退火30 s，60℃延伸1 min，40個循環(huán)。本實驗重復3次，得到的結果取均值。

表1 qPCR引物Tab. 1 Primers of qPCR

10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件對數據進行分析。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞形態(tài)觀察 分離原代DPSCs，體外培養(yǎng)24 h后可見到少量組織塊貼壁于培養(yǎng)皿上(圖1A)，3 d后明顯可見有貼壁細胞長出，呈集落樣的不規(guī)則形態(tài)(圖1B)。10 d后細胞數量明顯增多，細胞密度生長匯合至80%開始傳代，且生長速度明顯加快，傳代后第1代細胞呈紡錘狀和長條狀，并呈漩渦狀生長(圖1C)。

圖1 DPSCs體外分離培養(yǎng)光鏡下觀察(100×) A：原代細胞培養(yǎng)24 h；B：原代細胞培養(yǎng)3 d；C：P1代細胞Fig.1 Observation of DPSCs isolated and cultured in vitro under light microscope (100×) A: Primary cells were cultured for 24 h; B:Primary cells were cultured for 3 d; C: Passage one cells

2 CCK8法測細胞生長曲線 0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL濃度TNF-α刺激下的DPSCs培養(yǎng)7 d，用分光光度計檢測細胞生長曲線，在1 d、3 d、5 d時生長曲線基本重合，7 d時可見10 ng/mL TNF-α刺激下的細胞增殖效果明顯，而對照組的細胞增殖相對變慢(圖2)。

圖2 CCK8法檢測不同處理組DPSCs細胞增殖Fig.2 CCK8 assay showing the growth of DPSCs in different groups

3 DPSCs的多向分化能力觀察 經過21 d的成骨誘導分化后，鏡下可以見到鈣結節(jié)，并且在10 ng/mL TNF-α的刺激下有更為明顯的鈣沉積，同時染色更深(圖3A ～ 圖3D)；經過24 d的成脂誘導，鏡下可以見到脂滴的形成(圖3E)。說明DPSCs具有間充質干細胞的多項分化誘導能力，且TNF-α刺激下其成骨能力也明顯增強。

圖3 正常組DPSCs成骨分化誘導21 d，茜素紅染色(A、C，200×)；TNF-α刺激組DPSCs成骨分化誘導21 d，茜素紅染色(B、D，200×)；正常組DPSCs成脂分化誘導24 d，油紅O染色(E，200×)Fig.3 Osteogenic differentiation of DPSCs at 21 days after induction in the normal group by alizarin red staining (A, C, 200×).Osteogenic differentiation of DPSCs in TNF-α stimulation group at 21 days after induction by alizarin red staining (B, D,200×). Adipogenic differentiation of DPSCs in the normal group at 24 days after induction by oil red O staining (E,200×)

4 正常組及TNF-α刺激組DPSCs成骨因子和炎性因子表達水平 成骨誘導液培養(yǎng)7 d，qPCR結果顯示，10 ng/mL TNF-α刺激組的Runx2表達是正常成骨誘導培養(yǎng)條件的1.674倍(P＜0.05)，10 ng/mL TNF-α刺激組的ALP表達是正常成骨誘導培養(yǎng)條件的1.515倍(P＜0.05)(圖4)。說明在10 ng/mL TNF-α刺激作用下，DPSCs向成骨細胞分化能力明顯增強。正常及TNF-α刺激組DPSCs接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)7 d，qPCR結果顯示，10 ng/mL TNF-α刺激組的IL-1β表達是正常組的2.314倍(P＜0.05)，10 ng/mL TNF-α刺 激 組 的TNF-α表達是正常組的1.947倍(P＜0.05)(圖5)。說明在10 ng/mL TNF-α刺激作用下，DPSCs炎癥相關因子的表達水平明顯增加。

圖4 qPCR檢測經過常規(guī)培養(yǎng)(Undiff)和成骨細胞誘導培養(yǎng)(Diff) 7 d后正常組DPSCs和TNF-α刺激組DPSCs的Runx2和ALP的mRNA表達水平Fig.4 mRNA expression levels of Runx2 and ALP detected by qPCR after 7 days of routine culture (Undiff) and osteoblast induction culture (Diff) in the normal group and the TNF-α stimulation group

圖5 正常組DPSCs和TNF-α刺激組DPSCs常規(guī)培養(yǎng)后IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平Fig.5 mRNA expression levels of IL-1 β and TNF- α in the normal group and the TNF-α stimulation group after routine culture

5 CD3+T細胞分離共培養(yǎng)觀察 人外周血加入等量淋巴分離液，離心后取中間白膜層，利用磁珠分選得到CD3+T細胞，刺激活化后得到生長良好、活性正常的懸浮狀球形細胞。然后選擇直接共培養(yǎng)的方法將DPSCs和CD3+T細胞直接混合，共同生長(圖6)。

圖6 CD3+ T細胞(A)光鏡下觀察(200×)及與DPSCs直接共培養(yǎng)后(B)光鏡下觀察(200×)Fig.6 Morphological images of CD3+ T cells (A, 200×) and CD3+ T cells co-cultured with DPSCs directly (B, 200×) under light microscope

6 正常組HDPSCs和TNF-α刺激組IDPSCs分別與CD3+T細胞共培養(yǎng)后炎癥和Wnt通路相關因子的表達 將DPSCs與CD3+T細胞按照1∶10～1∶100的比例共培養(yǎng)，發(fā)現正常組在1∶20時IL-1β、TNF-α和LEF-1表達分別是DPSCs單獨培養(yǎng)的0.314倍(P＜0.05)、0.247倍(P＜0.05)和0.680倍(P＜0.05)。而TNF-α刺激組在1∶20時IL-1β、TNF-α、β-catenin和 淋 巴 樣 增 強 因 子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF-1)表 達 分 別 是DPSCs單獨培養(yǎng)的0.174倍(P＜0.05)、0.321倍(P＜0.05)、1.416倍(P＜0.05)和1.33倍(P＜0.05)。正常組在1∶50時IL-1β、TNF-α和LEF-1表達分別是DPSCs單獨培養(yǎng)的0.213倍(P＜0.05)、0.383倍(P＜0.05)和0.490倍(P＜0.05，TNF-α刺激組在1∶50時IL-1β、TNF-α表達分別是對照組的0.255倍(P＜0.05)、0.446倍(P＜0.05)。說明在10 ng/mL TNF-α的刺激下，共培養(yǎng)比例為1∶20時CD3+T細胞能夠比較有效地抑制炎癥反應，且激活了Wnt/β-catenin經典通路，使β-catenin和LEF-1表達增加。見圖7。

圖7 正常組(aP＜0.05, vs HDPSCs)及TNF-α刺激組(aP＜0.05, vs IDPSCs)與CD3+ T細胞共培養(yǎng)后炎癥和Wnt通路因子的mRNA表達Fig.7 mRNA expression of inflammation and Wnt pathway factors in the normal group (aP＜0.05, vs HDPSCs) and the TNF-α stimulation group (aP＜0.05, vs IDPSCs) after co-culture with CD3+ T cells

討 論

DPSCs因其具有易獲取、成本低、多向分化能力等特點，成為當下組織工程種子細胞的研究熱點，在組織損傷、炎癥修復等方面具有越來越廣泛的應用前景。

在細胞水平上，DPSCs表達間充質干細胞標志物，其表現出較高的堿性磷酸酶活性水平。此外，DPSCs顯示出較高水平的成骨和成牙分化標志物，說明DPSCs接近成牙本質細胞的表型，為人牙組織源性間充質干細胞治療提供一種新思路[5]。Gong等[6]研究發(fā)現EPhinB2/EphB4信號在調節(jié)DPSCs誘導新生血管生成能力中有重要作用。Wang等[7]研究發(fā)現TNF-α參與炎癥發(fā)生和發(fā)展的全過程，是炎癥反應中最為關鍵的核心因子。TNF-α是一系列抗炎過程中的上游因子，有效減少Runx2的表達。已有文獻證明高濃度的TNFα通過Wnt/β-catenin信號轉導抑制了DPSCs中礦化及礦化相關基因的表達[8]。也有實驗結果顯示TNF-α可以抑制DPSCs的成骨和成牙本質的分化能力[9-10]。本實驗發(fā)現TNF-α濃度為10 ng/mL時對DPSCs的促進增殖效果最明顯，此時細胞活性較好。也有文獻證實該濃度條件下炎性因子的表達最為顯著[11]。因此本實驗選擇10 ng/mL TNFα作為刺激物模擬炎癥微環(huán)境。

在牙髓組織修復或再生的過程中，DPSCs與局部炎癥微環(huán)境相互作用，影響牙本質修復再生[12]。炎癥反應的過程中常有免疫細胞的參與。牙髓干細胞較骨髓干細胞具有更強的免疫調節(jié)活性，可以更好地用來治療免疫性疾病[13]。慢性牙周炎的早期病變期有大量的淋巴浸潤，主要為T淋巴細胞。在成熟的T細胞表面均會表達CD3分子[14]，CD3+T細胞是適應性免疫系統(tǒng)的主要效應細胞，其具有抗原特異性，同時也是同源免疫記憶的關鍵核心，因此更好地了解調節(jié)性免疫細胞，將有利于改進DPSCs的免疫調節(jié)治療策略[15]。這幾年最新的研究開發(fā)出一種無血清的人工胸腺器官系統(tǒng)，這為研究人類T細胞分化和未來以干細胞為基礎的工程T細胞療法的發(fā)展提供了強有力的工具[16]。本實驗中實時定量PCR結果顯示在DPSCs和CD3+T細胞共培養(yǎng)比例為1∶20時抑炎效果最好，同時也能夠激活Wnt經典通路，所以我們選擇此比例作為本實驗后續(xù)的實驗設計依據。

Wnt通路是由經典Wnt/β-catenin通路和非經典Wnt/Ca2+和Wnt/PCP信號通路組成。Wnt/βcatenin信號通路是機體各種信號中較為保守的一種，其可以調節(jié)多種生物生理過程，尤其是在骨細胞生物學中應用極廣，促進DPSCs的成骨向分化，而β-catenin的過度表達也足以抑制DPSCs的分化和礦化[17]。有研究表明炎癥微環(huán)境下間充質牙源性干細胞的生長以及分化過程中經典以及非經典通路之間存在著拮抗作用[18]。同時Wnt通路的主要作用靶點在轉錄因子LEF-1和TCF上，它們是Wnt信號通路的主要下游效應因子[19]。當前很多研究均表明Wnt通路與干細胞的干性相關。其中抑制Wnt信號的可以達到抑制DPSCs的遷移、堿性磷酸酶表達和礦化的目的[20]。Lu等[21]通過Wnt1/β-catenin信號轉導調控DPSCs的成牙本質細胞分化。因此可以推測在牙髓損傷的早期，可以通過改變Wnt信號通路恢復DPSCs的增殖能力，加快損傷修復的過程。Wu等[22]研究發(fā)現通過激活Wnt/β-catenin途徑可以使DPSCs促進成牙本質細胞分化，提示其未來可能有助于指導齲病的治療。Uribe-Etxebarria等[23]發(fā)現小分子和(或)重組蛋白對Wnt信號的短暫預處理激活了培養(yǎng)中DPSCs的干性，這為優(yōu)化其他組織特異性干細胞的治療用途提供了一種新的思路。另有研究發(fā)現，10 ng/mL TNF-α的刺激可增強Wnt信號通路激動劑SIRT1的表達，進而可以增強Wnt信號通路的表達，促進細胞成骨向分化[24]。

Wnt信號通路調節(jié)DPSCs的干性和多能性核心因子的表達[25]。本研究結果顯示，正常組 -1∶100共培養(yǎng)比例組β-catenin表達水平是正常組 -未共培養(yǎng)組的1.537倍(P＜0.05)，在10 ng/mL的TNF-α的刺激后1∶20的共培養(yǎng)比例組β-catenin表達水平是未共培養(yǎng)組的1.416倍(P＜0.05)，這是否可以說明在CD3+T細胞這類免疫細胞的參與下激活了Wnt/β-catenin經典通路，進一步調控著細胞的成骨、炎癥反應和組織的損傷修復？目前對于DPSCs的研究我們只是管中窺豹，許多未知的問題亟待了解和解決，盡管其中許多免疫機制我們還不盡了解，但許多研究已經讓我們能夠初步梳理出DPSCs在各種微環(huán)境中的生物學過程，感受到了其未來廣闊的應用前景。其在不同微環(huán)境下的免疫反應和狀態(tài)還有待我們進一步研究。