聚乙二醇化鋅鐵氧磁性納米顆粒對咪喹莫特的載藥性能及細(xì)胞毒性研究

劉慶祖，劉建恒，王潤生,2，劉義灝，楊慧愷，毛克亞

1 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心，北京 100853；2 柳州市中醫(yī)院，廣西柳州 545001

磁性納米顆粒由于比表面積大、磁響應(yīng)性高、生物相容性好而廣泛應(yīng)用于熱療、生物分離、靶向給藥、核磁共振成像的研究[1-4]。但在液態(tài)環(huán)境中納米顆粒容易聚合，導(dǎo)致其生物相容性降低[5]。因此，研究人員對磁性納米顆粒表面進(jìn)行修飾，將納米顆粒系統(tǒng)設(shè)計(jì)成不同的殼核結(jié)構(gòu)[6]。理想的修飾材料為兩親性，疏水端對顆粒親和力較高，親水端可提高磁性納米顆粒在液態(tài)介質(zhì)中的分散性和水溶性[7]；且修飾材料所攜帶的氨基、羥基可作為與抗體、氨基酸、葉酸、小分子藥物等的結(jié)合位點(diǎn)[8-12]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是呈線性或分支狀聚醚的親水性聚合物，其水溶性高、生物相容性高、幾乎無免疫原性，可在搭載藥物的周圍產(chǎn)生空間屏障，降低搭載藥物的酶解，提高藥物利用度[13-14]。咪喹莫特(R837)是一種強(qiáng)效的Toll樣受體7興奮劑，可以有效激活免疫反應(yīng)[15]，可搭載至磁性納米顆粒表面以增強(qiáng)磁熱療后的免疫反應(yīng)。葉酸是一種無免疫原性且價格低廉的小分子，其受體在腫瘤表面大量表達(dá)，在正常細(xì)胞表面低表達(dá)[16]。利用這一特性將葉酸耦連至磁性納米顆粒-聚乙二醇(polyethylene glycol-magnetic nanoparticles，PEGMNPs)表面，可使PEG-MNPs磁流體具有較好的腫瘤靶向性。本研究以乙酰丙酮鋅、乙酰丙酮鐵、油酸和油酸鈉為原料合成Zn0.3Fe2.7O4MNPs，并對其進(jìn)行PEG、R837的表面修飾構(gòu)建MNPs-PEG-R837系統(tǒng)，進(jìn)一步對系統(tǒng)表面搭載葉酸，制備MNPs-PEG-R837-FA系統(tǒng)，對其性能進(jìn)行檢測及表征，使用CCK-8法檢測該復(fù)合物細(xì)胞毒性。為后期對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63進(jìn)行內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)磁熱療實(shí)驗(yàn)、激活免疫系統(tǒng)奠定研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1 試劑與儀器 乙酰丙酮鋅、乙酰丙酮鐵、油酸鈉(中國Alfa aesar公司)；EDC偶聯(lián)劑，油酸，二芐醚(德國Sigma Aldrich公司)；DSPE-mPEG，DSPE-PEG-NH2(瑞禧生物)；咪喹莫特(麥克林生物)；PEG化葉酸(碳水科技)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；青霉素、鏈霉素、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶(美國Gibico公司)；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)、人骨肉瘤細(xì)胞MG-63(上海通派生物公司)；細(xì)胞活性檢測試劑盒(CCK-8，日本株式會社同仁化學(xué)研究所)；通風(fēng)櫥(北京蝴蝶實(shí)驗(yàn)室家具有限公司)；電子分析天平(BSA124S，德國SartoriusAG公司)；超聲震蕩儀(SW1H，瑞士SONOSWISS公司)；光纖測溫系統(tǒng)(34722，加拿大Nepotix公司)；振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(3473-70，新西蘭GMW公司)；透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本電子株式會社JEOL)；高速冷凍離心機(jī)(3K15，德國Sigma Aldrich公司)；動態(tài)激光光散射儀(Zeta Plus，美國Brookhaven Instruments公司)；高效液相色譜儀(LC-15C，日本島津公司)；X線衍射分析儀(X'Pert PRO MPD，日本理學(xué)公司)；熱失重分析儀(美國PerKinElmer公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet IS 10，美國Thermo公司)。全自動酶標(biāo)儀(Infinited M2000 PRO，瑞士TECAN公司)。

2 Zn0.3Fe2.7O4MNPs的合成 采用高溫有機(jī)溶劑法合成。首先將乙酰丙酮鋅(0.3 mmol)、乙酰丙酮鐵(2.7 mmol)、油酸鈉(2 mmol)、油酸(4 mL)以及二芐醚(20 mL)在通氬氣的環(huán)境中混合，采用磁力攪拌器充分混合，并在通氬氣的環(huán)境中加熱至393 K，保溫1 h。然后加熱至573 K，保溫1 h后退熱至室溫。

3 MNPs-PEG-R837的制備 采用逆向蒸發(fā)法合成MNPs-PEG-R837。將150 mg DSPE-mPEG、50 mg DSPE-PEG-NH2和1 mg咪喹莫特加至4 mL氯仿中超聲溶解；向上述溶液中加入20 mg Zn0.3Fe2.7O4超聲混勻，再加入4 mL水，超聲使水和氯仿混勻；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法將氯仿除去得到PEG/R837包裹的MNPs-PEG-R837。

4 MNPS-PEG-R837-FA的制備 將5 mg FA-PEGCOOH、溶于5 mL NaHCO3溶液中(15 mmol/L，pH=9)，pH調(diào)節(jié)至7；加入10 mg MNPS-PEG-R837，用PB溶液(0.02 mmol/L，pH=7.4)定容至6.5 mL，混勻震蕩在26℃下孵育30 min；再加入10 mg EDC，混勻震蕩，26℃下孵育過夜，取出溶液進(jìn)行超濾純化得到最終的產(chǎn)物。

5 評估Zn0.3Fe2.7O4MNPs-PEG-R83載藥率、包封率 載藥率是載藥納米系統(tǒng)復(fù)合體搭載藥物的質(zhì)量占復(fù)合物系統(tǒng)總質(zhì)量的百分比，反映該載藥納米系統(tǒng)復(fù)合體搭載藥物的能力，載藥率的計(jì)算公式：

載藥率=復(fù)合體搭載藥物的質(zhì)量/載藥納米系統(tǒng)復(fù)合體總質(zhì)量×100%，

包封率=(投入藥物總量-下清液剩余藥物量)/投入藥物總量

6 Zn0.3Fe2.7O4MNPs-PEG-R837藥物釋放率檢測 分別取1 mL樣品溶液加入透析袋(截留分子量8 000～14 000 U)，放入盛有5 mL PBS緩沖液(pH=5.8)的15 mL離心管中；將離心管置于37℃或43℃的恒溫?fù)u床上，200 r/min震蕩；分別在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h和24 h時從離心管中取1 mL釋放液裝到樣品管中待測濃度，隨機(jī)取同等溫度下的PBS緩沖液加入離心管中繼續(xù)震蕩；通過HPLC測試每個時間點(diǎn)取出的釋放液的咪喹莫特含量。

7 細(xì)胞培養(yǎng) 1)細(xì)胞復(fù)蘇：取MEF細(xì)胞凍存管，水浴解凍后用75%乙醇消毒頂部備用，配用10 mL高糖培養(yǎng)基 + 15%胎牛血清，將細(xì)胞凍存管內(nèi)的細(xì)胞重懸于離心管內(nèi)，并加入青霉素/鏈霉素雙抗預(yù)防細(xì)胞污染。取2 mL重懸細(xì)胞，移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加適量培養(yǎng)基，在操作臺緩慢輕柔以“∞”形晃動培養(yǎng)瓶，直至在顯微鏡下觀察細(xì)胞懸浮良好，分散均勻，消毒后放置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后觀察細(xì)胞生長貼壁情況。2)每日觀察細(xì)胞生長情況，待培養(yǎng)基由淺淡紅色變成淡棕黃色時準(zhǔn)備換液。3)取指數(shù)增長期MEF細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 104/mL，實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、Blank組均設(shè)置5個復(fù)孔，各孔加樣量100 μL，96孔板四周孔加無菌磷酸鹽緩沖液，放置于37℃、5% CO2、100%濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱24～48 h。

8 檢測Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837對MEF、MG63兩種細(xì)胞系的生物毒性 將Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837納米顆粒載藥配置成磁流體，按照實(shí)驗(yàn)組濃度梯度分為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL，共7組，直接加入含細(xì)胞的96孔板中，陰性對照組加等量完全培養(yǎng)基，空白對照組無細(xì)胞只加入等量含10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，每組均設(shè)置5個復(fù)孔，利用全自動酶標(biāo)儀在450 nm處測定各復(fù)孔的細(xì)胞活性，并計(jì)算細(xì)胞相對增殖率。檢測時間點(diǎn)為孵育24 h、48 h。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，細(xì)胞相對增殖率以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒X射線衍射(XDR)結(jié)果 Zn0.3Fe2.7O4納米顆粒XDR圖中出現(xiàn)6個主要的衍射峰，并且各衍射峰的位置和相對強(qiáng)度均與鋅鐵氧體的XRD標(biāo)準(zhǔn)圖譜(JCPDS-74-2397)一致，對應(yīng)的衍射晶面分別為(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)，所得產(chǎn)物是立方體尖晶石結(jié)構(gòu)的Zn0.3Fe2.7O4納米顆粒。圖中沒有其他雜峰，表明所得產(chǎn)物具有高純度，且衍射峰出現(xiàn)明顯的變化。見圖1。

圖1 Zn0.3Fe2.7O4納米顆粒XDR圖Fig.1 XDR of Zn0.3Fe2.7O4 nanoparticles

2 Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒、MNPs-PEG-R837、MNPs-PEG-R837-FA傅里葉紅外光譜(FT-IR) 圖2中a、b、c分別為MNPs、MNPs-PEG-R837、MNPs-PEG-R837-FA的紅外光譜譜圖。a中2 918 cm-1和2 852 cm-1處的吸收峰為C-H伸縮振動，1 597 cm-1和1 407 cm-1處的吸收峰為羧酸鹽-COOM(M為金屬離子)耦合反對稱和對稱伸縮振動，1 112 cm-1處的吸收峰為C-O-C伸縮振動，580 cm-1處的吸收峰是典型的M-O(M為金屬離子)的伸縮振動。在b中除了a所有的特征峰外，3 337 cm-1處的吸收峰為-NH2伸縮振動，而且C-H和C-O-C伸縮振動峰的強(qiáng)度增強(qiáng)表明DSPE-PEG-NH2的成功修飾。此外1 652 cm-1處的吸收峰為N-H彎曲振動，苯環(huán)上的C-N伸縮振動發(fā)生在1 281 cm-1處，C-N的彎曲振動在964 cm-1和842 cm-1處，表明咪喹莫特成功負(fù)載。c中除了a和b中的所有特征峰外，在1 741 cm-1處出現(xiàn)了-COOH中C=O的伸縮振動峰，說明葉酸的成功修飾。

圖2 Zn0.3Fe2.7O4 MNPs、MNPs-PEG-R837、MNPS-PEG-R837-FA的FT-IR傅里葉紅外光譜Fig.2 FT-RI results of Zn0.3Fe2.7O4 MNPs, MNPs-PEG-R837,MNPs-PEG-R837-FA

3 透射電鏡(TEM)形態(tài)表征 圖3A為Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒包覆PEG前的檢測結(jié)果，提示磁性納米顆粒呈多面體結(jié)構(gòu)，所制備的顆粒粒徑為(25.1 ± 3.4) nm，呈單分散性，顆粒的粒徑均勻。圖3B為Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837檢測結(jié)果可以明顯看出制備復(fù)合納米顆粒系統(tǒng)為典型的殼核結(jié)構(gòu)，說明PEG以及R837成功包覆在Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒，將油性Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒轉(zhuǎn)變成水溶性顆粒。

圖3 Zn0.3Fe2.7O4(A)和Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837(B)的透射電鏡圖Fig.3 TEM images of Zn0.3Fe2.7O4 (A) and Zn0.3Fe2.7O4-PEGR837 (B)

4 磁流體膠體的穩(wěn)定性檢測 將Zn0.3Fe2.7O4-PEGR837溶于超純水(1 mg/mL)靜置0 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h后磁流體分散均勻，未出現(xiàn)沉淀、團(tuán)聚現(xiàn)象(圖4)。表明PEG化后的Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒具有良好的膠體穩(wěn)定性，適合生物應(yīng)用。

圖4 磁流體膠體的穩(wěn)定性檢測Fig.4 Stability of magnetic fluid colloid

5 MNPs-PEG-R837、MNPS-PEG-R837-FA流 體動力學(xué)粒徑(DLS)和Zate電位 圖5為MNPs-PEG-R837偶聯(lián)FA前后的DLS和Zate檢測結(jié)果。MNPS-PEG-R837的流體動力學(xué)粒徑為(117 ±6) nm，Zate電位為(-24.5 ± 1.7) mV。表面偶聯(lián)FA后，水動力尺寸呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，Zeta也呈現(xiàn)下降的趨勢。MNPS-PEG-R837-FA流體動力學(xué)粒徑為(122 ± 5) nm，Zeta電位為(-27.9 ± 1.7) mV。上述結(jié)果表明PEG及R837成功包覆在Zn0.3Fe2.7O4磁性納米顆粒表面以及 FA的耦連。

圖5 MNPs-PEG-R837、MNPS-PEG-R837-FA的DLS和Zate電位Fig.5 DLS and Zate of MNPs-PEG-R837 and MNPS-PEG-R837-FA

6 MNPs-PEG-R837-FA的 熱 失 重 分 析(TGA)圖6為室溫加熱到800℃條件下測得最終產(chǎn)物的熱失重曲線，包括TGA(黑線)和DTG(藍(lán)線)。TGA呈現(xiàn)的是樣品的失重過程，DTG顯示的是最大失重速率所對應(yīng)的溫度?？梢钥闯鰳悠分话l(fā)生一步失重過程，開始失重溫度為330.1℃，終止失重溫度為478.5℃，最大失重速率溫度為378.2℃。由樣品的制備過程可以推斷，當(dāng)溫度上升到330℃時，樣品中負(fù)載的PEG、R837以及表面偶聯(lián)的葉酸等有機(jī)物發(fā)生了降解，導(dǎo)致質(zhì)量的損失，此時的質(zhì)量變化為78.66%。隨著溫度的進(jìn)一步升高，樣品的質(zhì)量不再發(fā)生變化，最終的殘留質(zhì)量為21.05%，為Zn0.3Fe2.7O4MNPs的質(zhì)量。

圖6 MNPs-PEG-R837-FA熱失重分析Fig.6 TGA of MNPs-PEG-R837-FA

7 R837的載藥率、包封率 采用高效液相色譜法(HPLC；WondaSil C18)測定咪喹莫特濃度標(biāo)曲線，流動相A為70%乙腈，流動相B為30%的0.02 mol/L磷酸氫二鉀緩沖液(磷酸調(diào)pH=8)(1.0 mL/min, 35℃，12 min)，得到R837峰面積/濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。MNPs-PEG-R837表面耦連FA完成后取10 mL下清液，通過計(jì)算得出咪喹莫特載藥率為87.90%、包封率為4.4%，見表1。

表1 R837的包封率和載藥率Tab. 1 Drug loading and encapsulation rate of R837

圖7 咪喹莫特的峰面積/濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard concentration curve of imiquimod

8 R837的釋放率 根據(jù)不同時間R837在透析袋中的釋放濃度計(jì)算其釋放率，以時間為橫坐標(biāo)，累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制累計(jì)釋放曲線。由R837的體外釋放曲線可知，在前6 h內(nèi)，兩種釋放溫度條件下，R837的釋放較慢；6 h時，在37℃條件下的釋放量達(dá)到了27.31%，而43℃條件下的釋放量達(dá)到了45.86%，說明該藥物載體系統(tǒng)在熱療所需的溫度下累積釋放率和釋放速率均有明顯升高；隨著時間的延長，R837的累計(jì)釋放量呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，12 h后R837在兩種溫度條件下的釋放已經(jīng)接近平衡，最大釋放量達(dá)到88%左右。藥物載體在藥物釋放方面符合要求，有望成為新型的藥物緩釋載體，為后期對MG-63細(xì)胞的磁熱療及熱療后免疫刺激奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。見圖8。

圖8 Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837在37℃和43℃條件下的體外釋放曲線Fig.8 Release curve of Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837 with the temperature of 37℃ and 43℃

9 振動樣品磁強(qiáng)計(jì)測定 圖9為Zn0.3Fe2.7O4-PEGR837在室溫下的磁滯回線：該樣品磁感應(yīng)強(qiáng)度在5000 Oe逐漸達(dá)到飽和，飽和磁化強(qiáng)度為43.1 emu/g，撤去外加磁場之后，剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力基本為0，表明該納米材料具有超順磁性。

圖9 Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837在室溫下的磁滯回線Fig.9 Hysteresis loop of Zn0.3Fe2.7O4-PEG-R837

10 MNPs-PEG-R837對MEF、MG63細(xì)胞的生物毒性 MNPs-PEG-R837磁流體對于兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性隨濃度上升而增加，但兩組細(xì)胞在24 h內(nèi)，即使MNPs-PEG-R837濃度達(dá)到1 000 μg/mL也未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。MNPs-PEG-R837濃度增至800 μg/mL，與MEF細(xì)胞共孵育時間延長至48 h時，才出現(xiàn)細(xì)胞毒性；MNPs-PEG-R837濃度增至1 000 μg/mL，與MG-63細(xì)胞共孵育48 h時的細(xì)胞毒性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩組細(xì)胞在MNPs-PEG-R837濃度600 μg/mL以下孵育48 h仍未出現(xiàn)細(xì)胞毒性。表明該磁性納米顆粒復(fù)合載藥系統(tǒng)有較低的細(xì)胞毒性(圖10)。

圖10 MNPs-PEG-R837對MEF (圖A)、MG63(圖B)細(xì)胞的生物毒性(aP＜0.01 vs control)Fig.10 MG63 (panel A) and MEF (panel B) cytotoxicity of MNPs-PEG-R837 (aP＜0.01 vs control)

討 論

本文利用高溫有機(jī)溶劑法合成了平均粒徑為(25.1 ± 3.4) nm的Zn0.3Fe2.7O4鋅鐵氧體磁性納米顆粒，該顆粒在飽和磁化強(qiáng)度為5000 Oe下逐級達(dá)到飽和，撤去外加磁場之后，剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力基本為0，表明該納米材料具有超順磁性。利用逆向蒸發(fā)法將聚乙二醇和免疫佐劑咪喹莫特修飾至顆粒表面構(gòu)建了MNPs-PEG-R837磁性納米顆粒復(fù)合載藥系統(tǒng)，進(jìn)一步將葉酸修飾至該系統(tǒng)，改善鋅鐵氧磁性納米顆粒的生物相容性。腫瘤部位微環(huán)境pH為5.5左右[17]，咪喹莫特是一種弱堿性藥物，在pH＜6.5的溶液中溶解度明顯增加，在外加磁場的作用力下，可定向移動至腫瘤部位，在37℃條件下釋放量達(dá)到了27.31%，而43℃條件下釋放量達(dá)到了45.86%，這說明在該藥物載體系統(tǒng)在熱療所需的溫度下，累積釋放率和釋放速率均有明顯增加，隨著時間的延長，咪喹莫特的累計(jì)釋放量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，進(jìn)一步提高藥物利用率。隨著時間的延長，R837的累計(jì)釋放量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，12 h后R837在兩種溫度條件下的釋放已經(jīng)接近平衡，最大釋放量達(dá)到88%左右。藥物載體在藥物釋放方面符合要求，有望成為新型藥物緩釋載體。與Taratula等[18]的研究結(jié)果相比，本研究在藥物釋放方面更具優(yōu)勢。MNPs-PEG-R837-FA磁流體和MEF細(xì)胞共同孵育24 h后，MNPs-PEG-R837-FA磁流體的濃度升高，而細(xì)胞毒性未明顯增加，即使?jié)舛冗_(dá)到1 000 μg/mL，仍表現(xiàn)為無細(xì)胞毒性；MNPs-PEGR837-FA磁流體和MG-63細(xì)胞共同孵育24 h后，MNPs-PEG-R837-FA磁流體的濃度升高，而細(xì)胞毒性未明顯增加，MNPs-PEG-R837-FA磁流體的濃度增至1 000 μg/mL時，出現(xiàn)了輕度細(xì)胞毒性，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與Makridis等[19]的研究結(jié)果相比，本研究所使用磁性納米顆粒濃度更高、孵育時間更長，表明該磁性納米復(fù)合載藥系統(tǒng)具有較好的生物相容性。本研究顯示了磁性納米顆粒作為藥物載體的應(yīng)用前景，為磁性納米顆粒應(yīng)用于臨床提供了理論研究基礎(chǔ)。但本研究未進(jìn)行腫瘤動物模型的體內(nèi)相容性研究，這也是課題組下一步的研究方向。