秦皮乙素對SKOV3細胞增殖、干樣特性及凋亡的作用

王姣，裴麗鵬，徐斌，趙博，沈素巖

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū)，遼寧沈陽 110000）

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其中以卵巢上皮癌較為多見且嚴重威脅女性健康［1］。目前卵巢癌的病因尚不明確，但已有研究報道卵巢癌的發(fā)生與遺傳［2］、內分泌失調［3］等因素存在密切關聯(lián)。由于卵巢位于盆腔深處，且體積較小，發(fā)生癌變時沒有明顯癥狀，因此卵巢癌隱匿性極強，導致患者耽誤治療時機［4］。針對卵巢癌的治療手段仍然是以手術配合放化療，但隨著中醫(yī)的發(fā)展，中西結合的治療手段日益完善［5-6］。秦皮乙素（esculetin，Esc）又稱為6，7二羥基香豆素，是香豆素的衍生物，其分子式為C9H6O4。近年來，Esc已被報道具有抗炎［7］、抗菌［8］、抗氧化［9］等多種生物活性作用。Esc具有較強的抗腫瘤作用，包括肺癌、結腸癌和胰腺癌等［10-12］，因此推測Esc對卵巢癌腫瘤同樣能發(fā)揮出積極的抑癌作用。本研究旨在探究Esc對卵巢癌SKOV3細胞增殖、凋亡和腫瘤干細胞樣特性的影響，以期為卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人卵巢癌SKOV3細胞系購買于中科院上海生科院細胞庫。

1.2 試劑

Esc購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110741-201708，純度≥99.9%）；鹽酸阿霉素購自汕頭經濟特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶和F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購于日本DOJINDO公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自上海碧云天生物技術研究所；Matrigel膠和Transwell小室購于Corning公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶公司；兔抗CD44、CD133、Oct4、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Acitn單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器

1658001垂直電泳槽，購自美國Bio-Rad公司；Heracell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱，購自美國Thermo公司；SIGMA 3K15離心機，購自美國Sigma公司；Epics·XL流式細胞儀，購自Beckman公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將人卵巢癌SKOV3細胞株接種于含10%（φ）胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)于含5%（φ）CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱，每2天換液1次，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)試驗。

1.4.2 CCK-8檢測細胞增殖 調整SKOV3細胞密度調整至5×104個/mL，接種于96孔板內，每孔加100μL細胞懸液。采用隨機數(shù)字表法將細胞隨機分為不同藥物處理組（0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、2、4、8、16μmol/L），共11個組，每組3個復孔。待細胞貼壁后，按分組加入對應劑量Esc處理細胞24 h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，避光溫育4 h，于450 nm波長處用酶標儀測定吸光度（A）。

1.4.3 細胞處理及分組 根據(jù)“1.4.2 ”結果，計算Esc對SKOV3細胞IC50值，選擇無顯著毒性的0、0.2、0.4、0.8μmol/L劑量Esc和阿霉素0.5μmol/L處理SKOV3細胞，將細胞隨機分為5組：Control組、Esc 0.2μmol/L組、Esc 0.4μmol/L組、Esc 0.8μmol/L組和ADM 0.5μmol/L組。

1.4.4 克隆形成試驗 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)SKOV3細胞至大約30%匯合度，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吹散為單個細胞，用6孔板培養(yǎng)，約500個細胞每孔，培養(yǎng)14 d，棄掉培養(yǎng)基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，形成肉眼可見克隆形成集落后，固定、染色后進行拍照、計數(shù)。

1.4.5 細胞成球試驗 分別取各組SKOV3細胞各100個接種于超低吸附24孔板中，每孔100μL F12成球培養(yǎng)基，含10個活細胞，各鋪10個復孔。靜置培養(yǎng)14 d后倒置顯微鏡下觀察成球直徑和成球數(shù)目。

1.4.6 Western blot檢測 收集各組細胞用BCA試劑盒進行總蛋白提取并測定蛋白質含量。提取等量的蛋白質樣品，在100℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，在4℃條件下加入相應一抗（1∶1 000）并孵育過夜，清洗，然后在4℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 500），孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。以Actin作為內參，ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。

1.4.7 JC-1檢測線粒體膜電位 收集各組細胞，并將細胞密度調整至1×106個/mL，將各組細胞接種于6孔板后PBS清洗3次，孵育24 h，加入JC-1（5μg/mL）室溫避光反應30 min。用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強度。

1.4.8 統(tǒng)計學分析 實驗重復3次，所有實驗數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，實驗結果以均數(shù)±標準差（x±s）表示。組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Esc對SKOV3細胞活性的影響

通過CCK-8法檢測卵巢癌SKOV3細胞活性如圖1所示，當Esc濃度≥2μmol/L時，對細胞產生明顯毒性作用，細胞活性顯著降低（P<0.05）。因此，本研究選擇無顯著毒性Esc的3個劑量（0.2、0.4、0.8μmol/L）進行后續(xù)實驗。

圖1 Esc對SKOV3細胞活性的影響Figure 1 Effect of Esc on the activity of SKOV3 cells

2.2 Esc對SKOV3細胞克隆形成數(shù)的影響

通過克隆形成試驗檢測各組細胞增殖情況如圖2所示，Control組中SKOV3細胞形成大量細胞克隆，而隨Esc濃度的增加克隆形成數(shù)逐漸減少。

圖2 Esc對SKOV3細胞克隆形成的影響（HE染色，200×）Figure 2 Effect of Esc on the clone formation of SKOV3 cells(HEstaining,20×)

2.3 Esc對SKOV3細胞成球數(shù)目和成球直徑的影響

通過細胞成球實驗檢測各組細胞成球直徑、成球數(shù)目結果如圖3所示，與Control組比較，Esc 0.4、0.8μmol/L組和ADM 0.5μmol/L組細胞成球數(shù)和成球直徑顯著降低（P<0.05）。由此可見，Esc可抑制SKOV3細胞的成球能力。

圖3 Esc對SKOV3細胞成球能力的影響（200×）Figure 3 Effect of Esc on spheroidizing ability of SKOV3 cells(200×)

2.4 Esc對SKOV3細胞CD44、CD133、Oct4蛋白表達水平的影響

通過Western blot檢測干細胞樣標記物表達情況如圖4所示，與Control組比較，Esc 0.4、0.8μmol/L組和ADM 0.5μmol/L組中CD44、CD133、Oct4蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。提示，Esc可抑制SKOV3細胞干性。

圖4 Esc對SKOV3細胞CD44、CD133、Oct4蛋白表達水平的影響Figure 4 Effect of Esc on the expression of CD44,CD133 and Oct4 in SKOV3 cells

2.5 Esc對SKOV3細胞線粒體膜電位的影響

通過流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位變化如圖5所示，Control組中僅有少量細胞線粒體膜電位下降，而隨Esc濃度的增加，線粒體膜電位下降的細胞數(shù)量逐漸增加。提示，Esc可降低SKOV3線粒體膜電位。

圖5 Esc對SKOV3細胞線粒體膜電位的影響Figure 5 Effect of Esc on mitochondrial membrane potential of SKOV3 cells

2.6 Esc對SKOV3細胞cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9和Bcl-2/Bax比值的影響

通過Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白表達情況如圖6所示。與對照組相比，Esc中、高劑量組和阿霉素組與Control組比較，Esc 0.4、0.8μmol/L組和ADM 0.5μmol/L組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值顯著升高（P<0.05），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P<0.05）。提示，Esc促進SKOV3細胞凋亡。

圖6 Esc對SKOV3細胞凋亡相關蛋白表達的影響Figure 6 Effect of Esc on the expression of apoptosis-related proteinsin SKOV3 cells

3 討論

卵巢癌（ovarian cancer）是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，對女性生命造成嚴重威脅。放療和化療是卵巢癌腫瘤切除術后的標準治療方案，但存在明顯的副作用以及產生耐藥性等問題［13］。中藥具有生物活性廣泛且低毒副作用的特點，其中Esc是中藥秦皮的藥用成分之一，具有抗腫瘤的重要作用。

腫瘤細胞周期失調，且分裂與增殖是持續(xù)的，不受細胞生長調控系統(tǒng)控制。因此本研究首先篩選出無顯著毒性的Esc作用濃度，探究Esc對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響。此前已有相關研究報道稱，Esc可抑制非小細胞肺癌NCI-H358和NCIH1299細胞株的增殖，同時上調細胞周期抑制蛋白p27、p21表達量［10］。此外，Arora等［14］發(fā)現(xiàn)，Esc可抑制胰腺癌PANC-1，MIA PaCa-2和AsPC-1細胞株生長，誘導以上3種細胞周期阻滯在G1期，并上調Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達以促進細胞凋亡。王九龍等［15］發(fā)現(xiàn)，Esc經p70S6K/4E-BP1信號通路抑制結腸癌HCT116細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)Esc可抑制SKOV3細胞克隆形成，提示Esc對SKOV3細胞增殖具有抑制作用。

腫瘤干細胞是腫瘤內具有胚胎干細胞類似性質的細胞，具有無限增殖、更新的能力，因此與腫瘤生長和復發(fā)存在密不可分的關聯(lián)［16］。成球能力是單個癌細胞自我更新能力的重要表現(xiàn)，成球能力越強，細胞干性越強。CD133蛋白是卵巢癌干細胞標志物，可促使脈管系統(tǒng)產生，同時參與新生血管的生成，對卵巢癌細胞的生長、增殖和浸潤起到促進作用［17］；CD44黏附分子與惡性腫瘤發(fā)展關系密切［18］；OCT4是多能干細胞的標記物，也是胚胎干細胞的標記［19］。本研究參照以上3種干細胞標記物表達量以評估SKOV3細胞干性。此前已有研究顯示，中藥組方理沖生髓飲可降低CD+44、CD+117、CD+133、CD+44、CD+117細胞數(shù)，并下調ABCC1及其mRNA表達水平，影響卵巢癌干細胞特性和順鉑敏感性［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，Esc下調CD44、CD133、Oct4的表達量，抑制SKOV3細胞干性和成球能力。提示Esc抑制SKOV3細胞干樣特性。

細胞凋亡是細胞維持內環(huán)境穩(wěn)定的程序性死亡形式，涉及一系列基因的激活、表達以及調控。在惡性腫瘤中，細胞凋亡機制是調控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）可選擇性地切割某些蛋白質進而調控細胞凋亡［21］。B淋巴細胞瘤-2基因簡稱Bcl-2（B-cell lymphoma-2）是抗腫瘤細胞凋亡的重要基因之一，而bax基因是最主要的促凋亡基因，Bcl-2/Bax比值是決定細胞凋亡抑制作用強弱的重要指標［22］。線粒體在凋亡中起著決定性的作用，其中線粒體喪失電子轉移功能并減少能量的產生，跨膜電位的消失都是細胞通過線粒體途徑凋亡的標志［23］。有相關研究顯示，Esc可通過上調Caspase-3、Caspase-9活性和Bax表達量，下調Bcl-2表達量，同時通過IGF-1/PI3K/Akt通路調節(jié)線粒體功能障礙誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡［24］。秦皮乙素能抑制人肺癌H460細胞的體外增殖，并能誘導H460細胞的凋亡［25］。本文與上述結果研究一致，Esc可降低SKOV3細胞線粒體膜電位，上調Caspase-3、Caspase-9活性，并降低Bcl-2/Bax比值，與已有相關研究結果相符。提示，Esc可促進SKOV3細胞凋亡。

綜上所述，Esc具有抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖、細胞干性的作用，同時可促進SKOV3細胞凋亡，表現(xiàn)出對卵巢癌的積極治療作用。下一步的研究將構建卵巢癌小鼠模型，探究Esc對卵巢癌組織發(fā)生發(fā)展的影響作用。