袁海娜，武美琳，林金鵬，姜澳華，閻鈺，陳唐超，龔金炎，趙廣生，肖功年

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心（2011計劃），杭州310023）

0 引 言

乳清蛋白占總?cè)榈鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)的20%，是牛乳的重要組成成分[1]。在奶酪生產(chǎn)中，乳清蛋白是牛乳凝結(jié)后余留的主要蛋白質(zhì)。分離乳清蛋白是重要的功能食品配料[2]及膳食補充劑，可用于改善調(diào)制食品的營養(yǎng)價值和功能特性[3]。有研究表明，乳清蛋白氧化產(chǎn)物可抑制DNA的氧化損傷及低密度脂蛋白（LDL）的氧化。乳清蛋白氧化產(chǎn)物還可延緩脂質(zhì)氧化[4]。

乳制品加工過程中產(chǎn)生的活性氧和活性氮易引起乳蛋白氧化。乳蛋白質(zhì)的氧化會改變其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性[5]。羰基、巰基和二聚酪氨酸等蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)分子二、三級結(jié)構(gòu)改變相關(guān)[6-7]。進而影響蛋白質(zhì)的溶解性、疏水性等[8]。同時，已有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)氧化與阿爾斯海默癥等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[9]。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的活性醛，其分子內(nèi)羰基可與蛋白質(zhì)通過共價交聯(lián)，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能[10-11]。但目前MDA對乳清蛋白結(jié)構(gòu)及功能方面的研究仍不多見。因此，本文研究M DA氧化對乳清蛋白體外抗氧化活性及其空間結(jié)構(gòu)的影響，以期為揭示乳清蛋白的構(gòu)效關(guān)系及氧化機制提供必要的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%），貝因美嬰童食品股份有限公司；1,1,3,3-四乙氧基丙烷（TCI＞95%），東京仁成工業(yè)株式會社；MDA測試試劑盒、巰基測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；2，4-二硝基苯肼(DNPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH＞97%)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；卵磷脂（＞98%）、牛血清白蛋白(BR)，上海麥克林生化科技有限公司；5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸(DTNB，BR，98%)，上海源葉生物科技有限公司；2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）(ABTS≥98.5%)，合肥巴斯夫生物科技有限公司；維生素C(VC≥99%)，上海長哲生物科技有限公司；蛋白上樣緩沖液（Loading Buffer，5×）、電泳緩沖液（10×）、三色蛋白預(yù)染Marker,上海生工生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 MDA的制備

采用水解1,1,3,3-四乙氧基丙烷的方法制備M DA儲液[12]。將1 100 mg 1,1,3,3-四乙氧基丙烷溶解于50 mL 0.1 mol/L HCl中，并在磁力攪拌下于50℃水浴中避光反應(yīng)60 min，進行水解。水解結(jié)束后立即用6 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值至7.0，即得MDA儲液。為了保證M DA的氧化活性，MDA儲液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。MDA濃度采用MDA濃度檢測試劑盒測定。

1.2.2 MDA氧化乳清蛋白的制備[12]

準(zhǔn)確稱取乳清蛋白粉，于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中充分溶解，蛋白質(zhì)濃度為10 mg/m L（w/v），另加入0.5 mg/mL的NaN3以防止蛋白質(zhì)腐敗變質(zhì)。分別采用0、0.5、5.0、50、150、300、500 mmol/L等不同濃度新鮮制備的MDA儲液氧化乳清蛋白。于25±1℃恒溫避光條件下，震蕩氧化24 h。然后將反應(yīng)液迅速進行冰浴冷卻處理，并于4℃去離子水中透析72 h，以除去未參與反應(yīng)的MDA。透析后樣品進行冷凍干燥，得MDA氧化乳清蛋白，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 乳清蛋白氧化程度分析

1.2.3.1 乳清蛋白羰基含量測定采用DNPH比色法測定乳清蛋白羰基含量[13-14]。準(zhǔn)確量取0.1 mL以0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解的氧化乳清蛋白（氧化乳清蛋白濃度為3.0 mg/m L），置于離心管中。實驗分測定組和對照組。測定組加入0.40 mL 10 mol/L DNPH（以2.0 mol/L HCl溶解），對照組加入0.40 mL 2.0 mol/L HCl，于25±1℃室溫下避光反應(yīng)1 h，后加入0.50 m L質(zhì)量濃度20%的三氯乙酸，然后在4℃、10 000 rpm下離心10 min。棄去上清液，將沉淀中加入體積比1∶1的乙醇-乙酸乙酯混合溶液，在4℃、10 000 rpm下離心10 min洗滌沉淀3次（除去未反應(yīng)的DNPH）。向沉淀中加入1.25 m L 6 mol/L鹽酸胍溶液，并于37℃金屬浴中恒溫加熱20 min溶解沉淀。然后4℃、10 000 rpm下離心10 min。取上清液，在紫外可見分光光度計370 nm下測定其吸光度。以摩爾消光系數(shù)22 L/（mmol·cm）計算每毫克蛋白質(zhì)中羰基含量。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍比色法測定[15]。所有實驗重復(fù)3次。計算公式如下：

羰基濃度（nmol/mg）=A/C×1/(k·b)×1000（1）

式中：A為370 nm波長下吸光度值；k為摩爾消光系數(shù)；b為光徑；c為蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

1.2.3.2 乳清蛋白總巰基和游離巰基含量測定

采用DTNB比色法測定乳清蛋白中的游離巰基[13-14]。將乳清蛋白溶解于p H 8.0的Tris－甘氨酸緩沖液中（內(nèi)含0.090 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸和8 mol/L尿素）（控制蛋白質(zhì)濃度為4.0 mg/mL）。取3.0 mL乳清蛋白溶液加入0.02 mL Ellman's試劑（內(nèi)含4.00 mg/mL DTNB的p H 8.0Tris－甘氨酸緩沖液），充分混勻，于室溫下靜置30 min。以不加DTNB的蛋白質(zhì)樣品為對照。測定反應(yīng)液于412 nm波長下的吸光度值。以摩爾消光系數(shù)13 600 L（mol·cm）計算游離巰基含量?？値€基通過試劑盒測定（南京建成生物工程）。所有實驗重復(fù)3次。計算公式如下：

游離巰基含量（μmol/L/g)=A412×73.53×D/C （2）

式中：A412為反應(yīng)液在412 nm波長下的吸光度值；73.53為通過106/（1.36×104）計算所得，D為稀釋度（3.02）；C為反應(yīng)液中的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

1.2.3.3 乳清蛋白二聚酪氨酸含量[9]測定

準(zhǔn)確稱取10 mg氧化乳清蛋白樣品溶解于10 m L p H 6.0的磷酸鹽緩沖液中，其中含有20 mmol/mL的KCl。應(yīng)用熒光分光光度計（F4500，日立高新技術(shù)公司）在325 nm激發(fā)波長、410 nm發(fā)射波長、5 nm狹縫寬度下測定樣品的吸光度。二聚酪氨酸含量以每毫克蛋白質(zhì)的吸光度來表示。所有實驗重復(fù)3次。

1.2.4 乳清蛋白體外抗氧化活性分析

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

根據(jù)Shen等人[16]的方法，于0.5 m L適宜濃度的乳清蛋白中加入等體積50μg/mL DPPH的二甲基亞砜溶液，震蕩混勻，并于室溫下避光反應(yīng)30 min。以去離子水代替乳清蛋白為空白樣品，于517 nm波長下測定各反應(yīng)液吸光度值。平行實驗3次。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Ai為DPPH和乳清蛋白樣品反應(yīng)后的溶液吸光度；Aj為二甲基亞砜溶液與乳清蛋白樣品溶液混合后的吸光度；A0為去離子水代替乳清蛋白樣品與DPPH混合后的吸光度。

1.2.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

根據(jù)唐思頡等人[17]的方法，將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀按1∶2體積比混勻，得ABTS儲液備用。ABTS儲液置于黑暗條件下反應(yīng)16 h，使用前以無水乙醇稀釋ABTS儲液得ABTS工作液，至其734 nm處吸光度值為0.70±0.02，得到ABTS工作液。分別將1.0 mL濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的乳清蛋白溶液，與3.9 mL ABTS工作液混合均勻，于室溫下反應(yīng)6 min。以VC為陽性對照，以無水乙醇代替乳清蛋白為空白樣品，于734 nm處測定各反應(yīng)樣品吸光度值。ABTS陽離子自由基清除率計算公式如下，平行實驗3次。

式中：A1為乳清蛋白樣品與ABTS反應(yīng)后的吸光度值；A0為無水乙醇代替乳清蛋白與ABTS反應(yīng)后的吸光度值。

1.2.4.3 抑制脂質(zhì)過氧化能力[18]測定

于1.5 mL質(zhì)量濃度2%卵磷脂中加入1.0 mL 4 mg/mL氧化乳清蛋白溶液，充分混勻?；旌弦褐糜?0℃水浴中磁力攪拌1 h，再分別于各反應(yīng)樣品中加入1.0 mL質(zhì)量濃度10%的三氯乙酸和1.0 mL質(zhì)量濃度0.8%硫代巴比妥酸，混勻。置于沸水浴中煮沸15 min。冷卻后將各反應(yīng)樣品于5 000 rpm離心10 min，取上清液。于532 nm處測定各樣品吸光值。以去離子水為空白對照，平行實驗3次。脂質(zhì)過氧化抑制率計算公式如下：

式中：A1為乳清蛋白反應(yīng)樣品在532 nm處的吸光值；A0為空白樣品于532 nm處的吸光值。

1.2.4.4 還原力的測定[19]

準(zhǔn)確量取0.5 mL 4.0 mg/mL乳清蛋白溶液，與2.5 mL 0.2 mol/L p H 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL質(zhì)量濃度1%鐵氰化鉀溶液充分混勻。混合液于50℃水浴中保溫20 min，隨后加入2.5 mL質(zhì)量濃度10%三氯乙酸，混勻。于3 000 rpm離心10 min，取上清液，加入2.5 mL去離子水和1.0 mL質(zhì)量濃度1%FeCl3，混勻并靜置10 min。以去離子水為空白對照，于700 nm波長處測定各樣品吸光值，吸光值高低表征還原力大小。平行實驗3次。

1.2.5 乳清蛋白SDS-PAGE分析[20-21]

將40μL適宜濃度乳清蛋白溶液與10μL 5×的Loading Buffer混勻，混合液置于100℃金屬浴中保溫5 min，于10 000 rpm離心5 min，取上清液。配制質(zhì)量濃度5%濃縮膠與質(zhì)量濃度12%分離膠，乳清蛋白上樣量為10μL。采用穩(wěn)壓電泳，考馬斯亮藍R-250染色。以5~245 ku三色預(yù)染Marker作為參比標(biāo)準(zhǔn)，采用ZF-288全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行譜圖分析。

1.2.6 乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)分析（CD）

根據(jù)Kr?mer A C等人的方法[22]。配制0.1 mg/mL氧化乳清蛋白溶液，采用日本分光JASCO J-815圓二色譜儀，在室溫條件下，測定各乳清蛋白樣品在190~250 nm范圍內(nèi)的遠紫外CD光譜。以溶解乳清蛋白的溶劑為空白，以10 nm/min的掃描速率、0.25 s時間間隔、1.0 nm掃描寬度和0.2 nm最小間隔度，掃描5次取平均值得各樣品CD光譜圖。

1.2.7 乳清蛋白傅里葉紅外光譜分析

根據(jù)藍蔚青等人[23]的研究方法。準(zhǔn)確稱取1.0 mg冷凍干燥氧化乳清蛋白粉與100 mg溴化鉀充分混合、研磨，并于15 MPa下抽真空壓片30 s，除去背景，使用德國布魯克V70 IR Spertrometer型傅里葉紅外變換光譜儀，在4 000~400 cm-1波長范圍內(nèi)進行掃描。考察乳清蛋白肽鏈酰胺Ⅰ帶（1 700~1 600 cm-1）和蛋白質(zhì)特征峰變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 MDA濃度對乳清蛋白氧化程度的影響

蛋白質(zhì)氧化過程中，蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的NH-或NH2-基團極易受到MDA的攻擊而生成羰基基團[10]。巰基會被氧化生成分子間或分子內(nèi)二硫鍵，從而進一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)和聚集；二聚酪氨酸形成是由于酪氨酸殘基易受自由基分子攻擊，和空間位置相鄰的酪氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)，通過兩個苯環(huán)之間的碳碳單鍵形成二聚酪氨酸[24]。羰基、巰基及二聚酪氨酸等蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物，可以表征乳清蛋白的氧化程度[25]。

2.1.1 MDA濃度對乳清蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)羰基含量是目前最為廣泛的表征蛋白質(zhì)氧化程度的關(guān)鍵指標(biāo)[26]。本研究分析了不同濃度的MDA氧化乳清蛋白所產(chǎn)生的羰基含量變化，結(jié)果如圖1所示。分析圖1發(fā)現(xiàn)：在0.5~500 mmol/L濃度范圍內(nèi)，MDA氧化均提高了乳清蛋白羰基含量。且在50~300 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著MDA濃度的提高，乳清蛋白羰基氧化產(chǎn)物含量顯著升高（P<0.01）。300 mmol/L M DA使乳清蛋白羰基氧化產(chǎn)物較氧化前提高了3.2倍。說明MDA對乳清蛋白質(zhì)的氧化作用存在顯著的量-效關(guān)系。這與前人的研究結(jié)果一致[10]。然而，較氧化前，5、0.5、500 mmol/L MDA并未顯著提高乳清蛋白羰基氧化產(chǎn)物含量（P>0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，M DA與蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基結(jié)合，隨著MDA濃度升高促使蛋白質(zhì)解折疊[27]，氧化敏感位點暴露，如賴氨酸、脯氨酸、精氨酸和組氨酸等氨基酸殘基，可以通過蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基直接氧化生成羰基衍生物；同時還可以通過α-酰胺化和β-分裂途徑的蛋白質(zhì)碳骨架斷裂進行羰基化修飾[28]。如MDA分子的活性羰基可與蛋白質(zhì)分子中的伯胺反應(yīng)形成烯胺化合物而引入羰基。同時，MDA也會與蛋白質(zhì)游離氨基反應(yīng)生成席夫堿造成蛋白質(zhì)羰基化[12]。但是當(dāng)MDA濃度超過一定值時，蛋白質(zhì)會發(fā)生聚集，空間結(jié)構(gòu)變化，從而影響了MDA對蛋白質(zhì)羰基化修飾反應(yīng)[29]。這可能解釋了500 mmol/L MDA相較于300 mmol/L MDA作用于乳清蛋白，氧化產(chǎn)物含量的顯著差異性。

圖1 MDA濃度對乳清蛋白總羰基含量的影響

2.1.2 MDA濃度對乳清蛋白總巰基和游離巰基含量的影響

蛋白質(zhì)上的巰基含量通常被用來檢測蛋白質(zhì)的氧化程度[9]。半胱氨酸的巰基是是活性氧（ROS）攻擊的重要位點，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生氧化修飾[8,30]。本文研究了MDA濃度對乳清蛋白游離巰基（見圖2）和總巰基（見圖3）的影響。分析圖2結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未氧化樣品相比，較低濃度（0.5~150 mmol/L）MDA氧化乳清蛋白，顯著降低了蛋白分子中游離巰基的含量（P<0.01），平均下降了27.34%。而300 mmol/L MDA氧化乳清蛋白，則顯著提高了蛋白游離巰基的含量（P<0.01），這可能與MDA對乳清蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響，改變了巰基與DTNB的結(jié)合能力有關(guān)[27]。圖3中顯示：不同MDA濃度對乳清蛋白中總巰基含量影響顯著。與未氧化樣品相比較，0.5~150 mmol/L范圍內(nèi)MDA氧化提高了乳清蛋白中總巰基含量，考慮主要與MDA對乳清蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。另外，300 mmol/L和500 mmol/L的MDA氧化乳清蛋白，使其總巰基含量較未氧化前分別下降了34.18%和26.70%，說明乳清蛋白中半胱氨酸殘基的S原子被進一步氧化。綜合圖2和圖3實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：MDA對乳清蛋白的氧化作用與其濃度密切相關(guān)。一方面低濃度MDA可氧化游離巰基為二硫鍵，而高于300 mmol/L濃度的MDA可進一步氧化半胱氨酸殘基中的S原子，生成半胱氨酸次磺酸、亞磺酸和磺酸等[31]，從而使得乳清蛋白中總巰基含量下降。

2.1.3 MDA濃度對乳清蛋白二聚酪氨酸含量的影響

二聚酪氨酸是蛋白質(zhì)標(biāo)志性氧化產(chǎn)物之一。不同濃度MDA氧化乳清蛋白過程中，二聚酪氨酸產(chǎn)物的含量變化如圖4所示。分析發(fā)現(xiàn)：隨著MDA濃度的提高，其氧化乳清蛋白中二聚酪氨酸產(chǎn)物含量逐漸下降。當(dāng)MDA濃度高于50 mmol/L時，氧化乳清蛋白中的二聚酪氨酸含量較氧化前降低了約10.70%~94.94%，可見，二聚酪氨酸可能不是MDA作用于乳清蛋白的主要氧化產(chǎn)物。其原因在于MDA氧化過程中，可能并未產(chǎn)生自由基，無法形成兩個酪氨酸殘基苯環(huán)間的C-C共價交聯(lián)鍵，從而不產(chǎn)生二聚酪氨酸[32]。結(jié)合圖1~圖3實驗結(jié)果分析認為：隨著MDA濃度升高，以羰基和巰基表征的乳清蛋白氧化程度加強。酪氨酸殘基在蛋白質(zhì)氧化過程中是否生成了3,4-二羥基苯丙氨酸（DOPA）還需進一步分析[33]。因此，MDA對乳清蛋白氧化的主要產(chǎn)物還需進一步分析研究。

圖3 MDA濃度對乳清蛋白總巰基含量的影響

圖4 MDA濃度對乳清蛋白二聚酪氨酸含量的影響

2.2 MDA氧化對乳清蛋白體外抗氧化活性的影響

M DA氧化對乳清蛋白體外抗氧化性能，包括DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率、脂質(zhì)過氧化能力和還原力的影響，研究結(jié)果見圖5~圖8。圖5顯示與未氧化乳清蛋白相比，MDA氧化影響了乳清蛋白的體外DPPH自由基清除活性。300 mmol/L的MDA氧化促使乳清蛋白（0.4~1.0 mg/mL）DPPH自由基清除率提高19.81%~67.71%。以VC為陽性對照，0.8 mg/mL經(jīng)300 mmol/L MDA氧化乳清蛋白的DPPH自由基清除率相當(dāng)于約0.03 mg/mL VC。但同時，實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)150 mmol/L MDA氧化的乳清蛋白DPPH自由基清除能力較氧化前下降。分析其原因可能為不同濃度MDA改變了乳清蛋白空間結(jié)構(gòu)，影響了活性殘基位點的空間構(gòu)象，從而使其與DPPH自由基的相互作用不同[5]；另外，不同濃度MDA氧化乳清蛋白的氧化產(chǎn)物不同，也間接影響其對DPPH自由基的清除能力[34]。

圖5 MDA氧化對乳清蛋白DPPH自由基清除能力的影響

圖6 結(jié)果顯示，當(dāng)MDA濃度在150~500 mmol/L時，乳清蛋白ABTS陽離子自由基清除率顯著提高（P<0.01），其中300 mmol/L MDA清除效果最為明顯，較氧化前的ABTS清除率提高68.42%~115.39%。分析原因可能是：高濃度MDA氧化乳清蛋白，致使其肽鏈展開，包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的抗氧化活性位點暴露[5]。0.5~50 mmol/L MDA氧化使ABTS陽離子自由基清除能力平均降低了24.50%。其原因可能與低含量MDA致使乳清蛋白交聯(lián)，不利于內(nèi)部活性基團的暴露有關(guān)[10]。

圖6 MDA氧化對乳清蛋白ABTS陽離子自由基清除能力的影響

圖7 結(jié)果顯示，當(dāng)MDA濃度高于5 mmol/L時，氧化乳清蛋白的體外脂質(zhì)過氧化抑制能力顯著下降（P<0.01），且其抗氧化活性與MDA密切相關(guān)。5~500 mmol/L MDA氧化使乳清蛋白體外脂質(zhì)抗氧化能力平均下降了12.84%~64.01%。分析其原因，一方面，可能MDA破壞了乳清蛋白的脂質(zhì)過氧化活性位點，如色氨酸殘基位點、半胱氨酸等[10]；另外，M DA氧化改變了乳清蛋白溶解性能、疏水性能等，導(dǎo)致乳清蛋白抗氧化活性位點不易與脂質(zhì)分子相互作用，發(fā)揮其抗氧化抑制作用[10]。其中300~500 mmol/L MDA氧化的乳清蛋白體外脂質(zhì)過氧化抑制活性顯著高于50~150 mmol/L MDA氧化的乳清蛋白樣品（P<0.01），進一步說明，乳清蛋白氧化產(chǎn)物及空間結(jié)構(gòu)的變化對其體外脂質(zhì)抗氧化活性影響顯著。

圖7 MDA氧化對乳清蛋白脂質(zhì)過氧化能力的影響

圖8 中對MDA氧化乳清蛋白還原力的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高蛋白質(zhì)濃度（0.24 mg/mL）條件下，經(jīng)5~150 mmol/L M DA氧化的乳清蛋白的還原力均低于未氧化的乳清蛋白（P<0.01）。而300~500 mmol/L MDA氧化處理也不利于乳清蛋白還原力的發(fā)揮。這說明MDA的氧化作用改變了乳清蛋白抗氧化位點氨基酸殘基的供電/供氫能力[35]。

圖8 MDA氧化對乳清蛋白還原力的影響

2.3 MDA氧化對乳清蛋白分子量分布的影響

不同濃度MDA氧化對乳清蛋白分子量分布的影響見圖9。實驗中利用尿素對蛋白質(zhì)氫鍵的破壞作用，研究了乳清蛋白氧化前后分子聚集情況，結(jié)果分別顯示于圖9A和圖9B中。圖9A分析顯示，MAD氧化影響乳清蛋白分子的聚集程度，且與MDA濃度密切相關(guān)。當(dāng)MDA濃度在0.05~300 mmol/L范圍內(nèi)，氧化的乳清蛋白中β-乳球蛋白二聚體和三聚體的含量隨著MDA濃度的提高而增加。但與氧化前先比，當(dāng)MDA濃度高于50 mmol/L時，分子量為60~75 ku的乳清蛋白多聚物含量顯著降低。與β-乳球蛋白相比，α-乳白蛋白對MDA氧化作用的敏感性較弱，在本實驗條件下隨著MDA濃度的增加，α-乳白蛋白二聚體含量增加，但仍主要以單體形式存在。乳清蛋白中的BSA也受M DA影響，當(dāng)MAD濃度高于150 mmol/L時，BSA形成了多聚物，同時單體α-乳白蛋白含量明顯減少。當(dāng)MDA濃度達到500 mmol/L時，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及BSA均形成了多聚物。圖9B顯示，乳清蛋白樣品經(jīng)尿素處理前后，其蛋白質(zhì)組分組成無顯著差異。綜合分析發(fā)現(xiàn)：MDA氧化改變了β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及BSA分子的聚集狀況，如MDA的兩個醛基可以與蛋白質(zhì)中兩個不同賴氨酸殘基中的氨基形成共價交聯(lián)[12]。

圖9 MDA氧化對乳清蛋白分子量分布的影響

2.4 MDA氧化對乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

通過遠紫外CD光譜分析了MDA氧化后乳清蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成變化，結(jié)果見表1。分析發(fā)現(xiàn)，MDA與乳清蛋白的相互作用影響其二級結(jié)構(gòu)組成。但可能是由于乳清蛋白所含的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白等不同蛋白質(zhì)分子與MDA間相互作用的差異性，使本實驗中乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)組成的變化趨勢與MDA濃度見未呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。前人研究表明，由于β-乳球蛋白與α-乳白蛋白結(jié)構(gòu)的差異性，通過熱加工引起的蛋白質(zhì)氧化程度不同[20]。這與本文研究結(jié)果是一致的。與氧化前相比較，150~500 mmol/L MDA對乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響較顯著。其中，150 mmol/L和300 mmol/L MDA處理促使乳清蛋白中的α-螺旋和β結(jié)構(gòu)向無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，這種二級結(jié)構(gòu)無序性轉(zhuǎn)變，利于乳清蛋白的進一步氧化[36]。

表1 MDA對乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

2.5 MDA對乳清蛋白傅里葉紅外光譜的影響

傅里葉紅外光譜是反應(yīng)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的基本工具之一[37]。圖10顯示，乳清蛋白氧化前后在3 500~3 200 cm-1處均出現(xiàn)一個寬而強的羥基特征吸收峰，不同濃度MDA的氧化作用使乳清蛋白羥基特征吸收峰峰位較氧化前出現(xiàn)紅移1~2波數(shù)，這可能與MDA促使乳清蛋白分子氫鍵作用減弱有關(guān)[10]。

圖10 不同濃度MDA氧化乳清蛋白的紅外光譜

蛋白質(zhì)紅外光譜特征峰主要包括酰胺Ⅰ帶（1 700~1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ帶（1 600~1 500 cm-1）。這分別由C—N伸縮和N—H彎曲振動、羰基C=O和雙鍵伸縮振動、C—H伸縮振動、O—H伸縮振動引起的。其中，酰胺Ⅰ帶（1 700~1 600 cm-1）可以反映出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。對比不同濃度MDA氧化的乳清蛋白，MDA濃度為500 mmol/L時，該特征吸收峰最強。表明通過不同MDA濃度處理的乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)的改變。

3 結(jié) 論

本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著MDA濃度升高，乳清蛋白氧化程度加劇，羰基含量升高，巰基含量降低，且可能生成了二聚酪氨酸外的其他酪氨酸殘基氧化產(chǎn)物，如3,4-二羥基苯丙氨酸等，仍需進一步研究分析。MDA氧化后乳清蛋白的自由基清除能力提高，而脂質(zhì)過氧化抑制活性及還原力降低，其原因還有待進一步剖析；乳清蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β結(jié)構(gòu)向無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，以及乳清蛋白聚集狀況的變化，可能解釋了MDA對乳清蛋白氧化的分子機制。本文相關(guān)研究結(jié)果為乳及乳制品加工、貯藏穩(wěn)定性、乳營養(yǎng)等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，提供了有益參考。