方 琰， 胡莎莎， 張冬群， 呂 婕， 李 銳， 卿人韋， 蘭利瓊

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065)

1 引 言

輪藻(Charophytes)是一種廣布全球的大型水生藻類(lèi)，形態(tài)高度分化，擁有與陸地植物最近的親緣關(guān)系，兩者共同構(gòu)成鏈型植物門(mén)[1](Streptophytes).由于輪藻在植物進(jìn)化史中的特殊分類(lèi)地位，其可將其作為植物從水生到陸生環(huán)境的一種過(guò)渡適應(yīng)機(jī)制模型[2]，輪藻對(duì)生境水質(zhì)要求較高，可作為一種生物指示劑[3].近年來(lái)，由于環(huán)境污染問(wèn)題日益加劇，輪藻被許多國(guó)家納入瀕危物種名錄[4-5]，然而我國(guó)對(duì)輪藻的研究和保護(hù)還未得到充分重視.

現(xiàn)生輪藻科(Characeae)分為輪藻族(Chareae)和麗藻族(Nitelleae).如今基于形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育分析的分類(lèi)矛盾爭(zhēng)議點(diǎn)大多集中在種屬間，如通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察只能根據(jù)雌雄同株或異株來(lái)區(qū)分球狀輪藻(Charaglobularis)和弧枝輪藻(Characonnivens)兩個(gè)種.Schneider等人[6]在系統(tǒng)分類(lèi)研究中均發(fā)現(xiàn)利用單一葉綠體基因matK對(duì)二者無(wú)法進(jìn)行有效區(qū)分；Nowak等人[7]通過(guò)2個(gè)核基因18S rDNA, ITS1和3個(gè)葉綠體基因rbcL,atpB,matK的聯(lián)合數(shù)據(jù)對(duì)瑞典14種輪藻屬植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，并結(jié)合形態(tài)學(xué)分類(lèi)對(duì)比分析表明，種間遺傳分化程度較低，物種的界定非常不明確，形態(tài)分類(lèi)和分子分類(lèi)結(jié)果存在沖突；Wood的傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)認(rèn)為燈枝藻屬是輪藻屬和麗枝藻屬的姐妹群，擬麗藻屬與前三者相比關(guān)系較遠(yuǎn)，但任玲萱等人通過(guò)對(duì)輪藻科植物18S rDNA、rbcL、atpB聯(lián)合聚類(lèi)分析表明，燈枝藻屬與擬麗藻屬具有很強(qiáng)的親緣關(guān)系，與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)觀點(diǎn)存在分歧[8].現(xiàn)今基于幾個(gè)常用分子片段聯(lián)合分析的輪藻科部分系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果較為混亂，無(wú)法較好的解決輪藻科植物內(nèi)部分類(lèi)結(jié)構(gòu)不清晰等問(wèn)題，所以擴(kuò)大數(shù)據(jù)量并利用基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究已成為大勢(shì)所趨.

葉綠體是一種重要的植物細(xì)胞器，其DNA一般為雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)約120～180 kb，在光合作用等多種代謝途徑中起到關(guān)鍵作用[9].葉綠體起源于藍(lán)藻的內(nèi)共生學(xué)說(shuō)，因其具有母系遺傳的特性使其較核基因組和線粒體基因組更為保守[10].葉綠體基因組含有大量變異速率適中的功能基因，可用作DNA條形碼廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育、種群分析等方面的研究[11-12].大多數(shù)葉綠體基因組具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)大的單拷貝(LSC)區(qū)，一個(gè)小的單拷貝(SSC)區(qū)和兩個(gè)反向重復(fù)序列(IRa和IRb).自從煙草(Nicotianatabacum)[13]和地錢(qián)(Marchantiapolymorpha)[14]葉綠體基因組序列公布以來(lái)，科研工作者們對(duì)葉綠體基因組的關(guān)注度不斷增加.Rochaix[15]于1978年得到了第一個(gè)衣藻葉綠體全基因組圖譜.此后藻類(lèi)葉綠體基因組數(shù)據(jù)不斷增長(zhǎng).藻類(lèi)葉綠體基因組大小差別較大，最小的刺松藻(Codiumfragile)僅為86 kb，最大的傘藻(Acetabularia)可達(dá)到2 000 kb[16].

Monique等人[17]對(duì)普生輪藻(Charavulgaris)進(jìn)行了測(cè)序并得到了完整的葉綠體全基因組序列，研究分析表明，在迄今為止測(cè)定的所有鏈型植物門(mén)葉綠體基因組數(shù)據(jù)中，輪藻具有最大的葉綠體基因組，最長(zhǎng)的單拷貝區(qū)和最高的A+T含量，造成這種情況的主要原因是葉綠體基因組內(nèi)基因間隔區(qū)的擴(kuò)張和內(nèi)含子長(zhǎng)度的增加.普生輪藻葉綠體基因組結(jié)構(gòu)也與陸生植物有較大不同.Orton等人[18]利用三種輪藻植物并結(jié)合其他綠藻植物和有胚植物的葉綠體全基因組探究了葉綠體基因的保留和/或丟失模式，以了解陸地植物的祖先是如何進(jìn)化出適應(yīng)陸地的生存機(jī)制.

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，植物葉綠體全基因組的測(cè)序變得越來(lái)越容易[12].在眾多輪藻科植物研究中，基于葉綠體全基因組的研究十分匱乏.在這里，我們對(duì)球狀輪藻葉綠體全基因組進(jìn)行了測(cè)序、組裝和拼接，旨在揭示球狀輪藻葉綠體全基因組結(jié)構(gòu)特征，豐富其葉綠體基因組信息，并為后續(xù)探究輪藻科植物物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本文所用的球狀輪藻藻體采集于四川省成都市五鳳溪.將長(zhǎng)勢(shì)較好的新鮮藻體用流水洗凈，清理表面雜質(zhì)雜藻，去除假根及較老的結(jié)，再用雙蒸水反復(fù)沖洗后液氮速凍并于-80 ℃冷藏保存待用.

2.2 方 法

2.2.1 DNA提取及測(cè)序 采用植物基因組提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd，Beijing，PA，China)提取上述處理好的球狀輪藻樣品DNA，送至北京諾和致源生物信息科技有限公司，檢測(cè)合格后，利用Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷葉綠體DNA生成300～500 bp的DNA小片段，在序列末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭，再經(jīng)過(guò)純化、PCR擴(kuò)增等一系列操作構(gòu)建好整個(gè)球狀輪藻文庫(kù)，之后用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，并稀釋文庫(kù)，再用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)大小符合預(yù)期后，采用Q-PCR法對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析以保證文庫(kù)質(zhì)量.文庫(kù)經(jīng)檢測(cè)合格后，根據(jù)目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求和有效濃度把不同文庫(kù)pooling至flowcell后使用Ⅱllumina novaseq 6000進(jìn)行雙末端測(cè)序，得到測(cè)序的原始讀序(Raw Reads)，最后使用FastQC v0.11.7軟件評(píng)估并過(guò)濾掉低質(zhì)量reads得到純凈讀序(Clean Reads)，從NCBI(National Center for Biotechnology Information)上下載普生輪藻(Charavulgaris)葉綠體全基因組作為參考序列，并將所有reads映射其上進(jìn)行最后質(zhì)量分析.

2.2.2 葉綠體全基因組的組裝、注釋及物理圖譜構(gòu)建 我們采用GetOrganelle軟件[19]對(duì)Clean Reads進(jìn)行組裝，經(jīng)過(guò)嘗試，最終設(shè)定word size值為101，其他參數(shù)值默認(rèn)，利用軟件Geneious11.0.4將結(jié)果與Charavulgaris進(jìn)行比較，驗(yàn)證其組裝效果并進(jìn)行下一步注釋[20]，之后對(duì)輸出文件進(jìn)行手動(dòng)修正后將最終注釋結(jié)果上傳至在線網(wǎng)站OGDRAW(http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de)得到球狀輪藻葉綠體全基因組完整圖譜[21].

2.2.3 簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析 使用MISA (MIcroSAtellite identification tool)軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)球狀輪藻葉綠體全基因組進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析，重復(fù)單元參數(shù)設(shè)置為單堿基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)、六堿基重復(fù)分別為10、6、4、3、3、3.設(shè)置2個(gè)SSR之間最小距離值為100 bp[22].

2.2.4 密碼子偏好性分析 根據(jù)注釋結(jié)果提取球狀輪藻葉綠體全基因組所有的CDS序列，并依次寫(xiě)入fasta文件，使用EMBOSS 6.4.0 (http://emboss.open-bio.org/)在線軟件分析密碼子使用率，使用軟件CodonW 1.4.2計(jì)算同義密碼子使用度[23]，所有參數(shù)均設(shè)定為默認(rèn)值.

2.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 選取從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的輪藻族普生輪藻(Charavulgaris)和麗藻族無(wú)色麗藻(Nitellahyalina)葉綠體全基因組數(shù)據(jù)，并以鞘毛藻科的Chaetosphaeridiumglobosum和雙星藻科的Zygnemacircumcarinatum作為外類(lèi)群，與本研究所得到的球狀輪藻葉綠體全基因組共5個(gè)一起提取共有CDS基因，并使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，自展值(Bootstrap, BS)重復(fù)抽樣1 000次.

3 結(jié)果與分析

3.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

本實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果中，Clean Reads占Raw Reads的99.55%，該值大于90%表明數(shù)據(jù)質(zhì)量較為理想，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析.組裝拼接得到的球狀輪藻葉綠體基因組全長(zhǎng)180 652 bp，GC含量26.6%，其具有高度保守的典型四分體結(jié)構(gòu)，其中LSC(large single copy)區(qū)長(zhǎng)131 709 bp，GC含量為25.14%、SSC(small single copy)區(qū)長(zhǎng)27123 bp，GC含量為23.6%，IR(inverted repeat)區(qū)長(zhǎng)10 910 bp，GC含量為39.0% (表1).

球狀輪藻葉綠體基因組序列共注釋出包括9對(duì)重復(fù)基因在內(nèi)的137個(gè)基因，其中包括94個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、37個(gè)tRNA基因和6個(gè)rRNA基因(表2).LSC區(qū)包括78個(gè)CDS和26個(gè)tRNA；SSC區(qū)包括14個(gè)CDs和1個(gè)tRNA；而IR區(qū)則只有2個(gè)CDS，5個(gè)tRNA和3個(gè)rRNA.并且ndhF基因橫跨IRB區(qū)和SSC區(qū)(圖1).

球狀輪藻葉綠體基因組共有17個(gè)基因含有內(nèi)含子，包括10個(gè)CDS，6個(gè)tRNA和1個(gè)rRNA.其中ycf3基因有兩個(gè)內(nèi)含子，ndhB、atpF、rps16、trnK(uuu)、trnV(uac)、trnG(ucc)、trnL(uaa)、clpP、petB、rpl16、rpl2、trnI(gau)、trnA(ugc)、rrl、ndhA基因均只具有一個(gè)內(nèi)含子，基因matK位于基因trnK(uuu)的內(nèi)含子區(qū)域，rps12基因有一個(gè)反式剪接內(nèi)含子.

圖1 球狀輪藻葉綠體基因組圖譜Fig.1 The gene map of C. globularis

表2 球狀輪藻葉綠體全基因組基因信息

3.2 球狀輪藻簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)又稱(chēng)微衛(wèi)星序列(Microsatellite DNA)，是基因組中由一到六個(gè)堿基重復(fù)組成的基本單位重復(fù)多次所構(gòu)成的一段DNA，普遍存在于真核生物的核、線粒體及葉綠體基因組中，因其具有良好的通用性而被廣泛應(yīng)用于物種鑒定及遺傳差異性分析.本研究根據(jù)所選參數(shù)，從球狀輪藻葉綠體基因組中共檢測(cè)出87個(gè)SSR位點(diǎn)，其中單堿基重復(fù)最多，有24個(gè)，占比27.59%且均為A/T型；二堿基重復(fù)有21個(gè)，占比24.14%；三堿基重復(fù)最少，只有2個(gè)，占比13.5%；四堿基重復(fù)有20個(gè)，占比22.99%；五堿基重復(fù)有6個(gè)，占比6.90 %；六堿基重復(fù)有3個(gè)，占比均為3.45%；球狀輪藻SSR類(lèi)型中有11個(gè)復(fù)合型SSR，占比12.64%(表3).分析可知球狀輪藻基因組中的SSR絕大部分由A和T構(gòu)成.

在球狀輪藻所有的SSR序列中，最長(zhǎng)可達(dá)117 bp，最短只有10 bp，平均長(zhǎng)度為19.56 bp，其中單堿基重復(fù)的平均長(zhǎng)度為9.23 bp，二堿基重復(fù)的平均長(zhǎng)度為15.33 bp，三堿基重復(fù)的平均長(zhǎng)度為13.5 bp，四堿基重復(fù)的平均長(zhǎng)度為14 bp，五堿基重復(fù)的平均長(zhǎng)度為15 bp，六堿基重復(fù)的平均長(zhǎng)度為18 bp，復(fù)合型SSR的平均長(zhǎng)度為23.44 bp，重復(fù)序列長(zhǎng)度為10～20 bp的最多，有72個(gè)(占82.75%)，重復(fù)序列長(zhǎng)度為21～40 bp的有5個(gè)(占5.75%)，重復(fù)序列長(zhǎng)度大于40 bp的有9個(gè)(占10.34%).SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)為3～15次(不計(jì)算復(fù)合型SSR)，其中重復(fù)次數(shù)為3～10次的有68個(gè)(占比78.16%)，重復(fù)次數(shù)為11～15次的有19個(gè)(占比21.84%)(表4).

表3 球狀輪藻葉綠體基因組SSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表4 球狀輪藻葉綠體基因組SSR預(yù)測(cè)

表5 球狀輪藻葉綠體基因組密碼子使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表6 球狀輪藻葉綠體基因組密碼子使用率

3.3 球狀輪藻密碼子使用偏好性分析

密碼子由mRNA中3個(gè)相鄰的核苷酸組成，在翻譯時(shí)代表一種氨基酸.由于密碼子存在簡(jiǎn)并性，即不同的密碼子可以編碼相同的氨基酸，同義密碼子出現(xiàn)頻率的高低反應(yīng)了密碼子使用的偏好情況.同義密碼子使用度(RSCU)是衡量密碼子偏好性的重要指標(biāo)，如果密碼子使用沒(méi)有偏好，則該密碼子的RSCU值等于1.當(dāng)某一密碼子的RSCU值大于1，則表明其的使用頻率相對(duì)較高，具有偏好性.

在組裝得到的球狀輪藻葉綠體全基因組編碼序列中，去除掉ycf20基因的一個(gè)重復(fù)序列后利用CodonW1.4.2對(duì)剩下的93條CDS序列進(jìn)行密碼子組成和偏好性分析，球狀輪藻葉綠體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因全長(zhǎng)741 967 bp，共包含24 989個(gè)密碼子.密碼子編碼氨基酸最多的是亮氨酸(Leu)，有2 776個(gè)(占11.1%)，密碼子編碼氨基酸最少的是半胱氨酸(Cys)，有309個(gè)(占1.2%).這些密碼子中使用使用最多的是AAA，編碼賴(lài)氨酸(Lys)并出現(xiàn)了1 312次，使用最少的是CGG，編碼精氨酸(Arg)并出現(xiàn)了41次(表5).除色氨酸(Trp)只有一個(gè)密碼子外，其余的氨基酸均有2～6個(gè)密碼子.此外，起始密碼子AUG沒(méi)有偏性(RSCU=1)；在終止密碼子中，TAA的使用最為頻繁(RSCU>1)，占終止密碼子總數(shù)的64.52%.通過(guò)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，球狀輪藻葉綠體基因組密碼子偏好A和T，編碼同義密碼子使用度(RSCU)大于1的密碼子均以A/U結(jié)尾.

圖2 基于葉綠體全基因組82個(gè)共有CDS構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(“100”表示支持率為100%)Fig.2 Neighbor Joining phylogenetic tree constructed by 82 common CDS of complete chloroplast genomes("100" means the bootstrap values is 100%)

3.4 球狀輪藻系統(tǒng)發(fā)育分析

選取包括球狀輪藻在內(nèi)的輪藻科三個(gè)種，并以鞘毛藻科的Chaetosphaeridiumglobosum和雙星藻科的Zygnemacircumcarinatum作為外類(lèi)群，提取出五個(gè)葉綠體全基因組共有CDS序列82個(gè)，采用鄰接(NJ)法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建(圖2).結(jié)果顯示進(jìn)化樹(shù)的置信度均為100%，置信度大于90%則表明聚類(lèi)結(jié)果可信度較高.在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，球狀輪藻與普生輪藻聚在一起成為輪藻族，表明二者的親緣關(guān)系更近，與同源性可達(dá)100%；麗藻族的無(wú)色麗藻單獨(dú)成為一個(gè)分支，輪藻族與麗藻族聚在一起成為姐妹群.

4 討 論

輪藻植物因其獨(dú)特的進(jìn)化地位一直備受學(xué)者關(guān)注，但僅僅基于形態(tài)學(xué)和部分分子片段的分類(lèi)學(xué)研究仍不能很好的解決部分種屬間分類(lèi)混亂的現(xiàn)象，葉綠體基因組具有母系遺傳、序列保守和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，相比于幾個(gè)分子片段，葉綠體全基因組可以反應(yīng)更多的遺傳信息.

本文首次揭示了球狀輪藻葉綠體全基因組的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明球狀輪藻與大部分植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相似，具有高度保守的四個(gè)區(qū)域結(jié)構(gòu)，與已經(jīng)報(bào)道的普生輪葉綠體藻基因組的結(jié)構(gòu)、大小十分相似.球狀輪藻共注釋出了137個(gè)基因，包括94個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，37個(gè)tRNA和6個(gè)rRNA，有17個(gè)基因具有內(nèi)含子，其中matK基因位于trnK(uuu)的內(nèi)含子區(qū)域，rps12基因有一個(gè)反式剪接內(nèi)含子，球狀輪藻與其他鏈型植物葉綠體基因組在總體結(jié)構(gòu)、基因數(shù)量和內(nèi)含子含量上存在差別，例如Staurastrum和Zygnema的葉綠體基因組僅僅具有8和13個(gè)內(nèi)含子，Spirogyramaxima葉綠體基因組則丟失了一個(gè)IR區(qū)域[18].與已報(bào)道的無(wú)色麗藻葉綠體全基因組相比，球狀輪藻具有2個(gè)特殊蛋白質(zhì)編碼基因psaM、matK，3個(gè)tRNA基因包括trnK(uuu)、trnG(ucc)和trnL(uaa)，但全長(zhǎng)卻比無(wú)色麗藻小21 148 bp，主要是由于葉綠體基因組內(nèi)基因間隔區(qū)的擴(kuò)張?jiān)斐傻?球狀輪藻具有其他鏈型植物門(mén)植物所不具有的rpl12、trnL(gag)、rpl19、ycf20四個(gè)基因，rpl12和rpl19分別編碼50S核糖蛋白體CL12和50S核糖蛋白體CL19；輪藻植物也是第一個(gè)報(bào)道rpl12基因的鏈型植物[19].該基因是一個(gè)特殊的反式剪切基因，3’端和5’端均位于LSC區(qū)域內(nèi)，未知功能基因ycf20在IR區(qū)有2個(gè)拷貝，ndhF基因橫跨IRB和SSC區(qū).因輪藻具有特殊的進(jìn)化地位和基因特點(diǎn)，后續(xù)可以加大樣本量，從特殊基因入手進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，探究其對(duì)輪藻植物的影響.

葉綠體的簡(jiǎn)單重復(fù)序列既具有核基因組SSR的高多態(tài)性、多等位性、共顯性等特點(diǎn)[24]，又具有單親遺傳模式的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)保守等特點(diǎn)[25-26]，所以有較好的種間、種內(nèi)遺傳變異區(qū)分能力，已成為區(qū)分物種的重要分子標(biāo)記而被廣泛應(yīng)用[27].球狀輪藻葉綠體基因組中共檢測(cè)出87個(gè)SSR位點(diǎn)，且大部分SSR都位于非編碼區(qū)，只有少數(shù)位于編碼區(qū)，其中單堿基重復(fù)最多，有27.59%均以A/T單堿基重復(fù)，堿基偏好性明顯；其余所有的二堿基重復(fù)至六堿基重復(fù)中均含有AT，較多的SSR位點(diǎn)存在表明球狀輪藻葉綠體基因組可能更易發(fā)生重排.

對(duì)球狀輪藻的密碼子偏好性進(jìn)行分析得知，球狀輪藻包含24 989個(gè)密碼子.密碼子編碼氨基酸最多的是亮氨酸(Leu)，密碼子編碼氨基酸最少的是半胱氨酸(Cys).這些密碼子中使用使用最多的是AAA，編碼賴(lài)氨酸(Lys)，使用最少的是CGG，編碼精氨酸(Arg).此外，起始密碼子AUG沒(méi)有偏性，同義密碼子使用度(RSCU)為1，終止密碼子中只有UAA的同義密碼子使用度(RSCU)大于1，編碼同義密碼子使用度(RSCU)大于1的密碼子均以A/U結(jié)尾.

在輪藻科內(nèi)部研究物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系往往利用DNA條碼進(jìn)行單基因建樹(shù)，但由于其序列較短，信息位點(diǎn)較少，不同的基因建樹(shù)的結(jié)果往往不同，存在一定的局限性.葉綠體是高等植物共有的細(xì)胞器，含有足夠信息位點(diǎn)的葉綠體基因組已被證明可有效判斷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，甚至是在較低的分類(lèi)學(xué)水平下植物之間也有較強(qiáng)的分類(lèi)學(xué)意義，為物種間系統(tǒng)發(fā)育的研究提供了新的思路[28].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)球狀輪藻葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育研究表明，球狀輪藻與輪藻族的普生輪藻聚在一起成為一個(gè)姐妹群，表明二者的親緣關(guān)系更近，這與任玲萱等人基于18S rDNA、rbcL、atpB聯(lián)合聚類(lèi)分析的結(jié)果一致[8]，也符合球狀輪藻的傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)地位[29]，但由于輪藻科植物的葉綠體全基因組信息較少，現(xiàn)今具有詳細(xì)基因信息的葉綠體全基因組只有C.vulgaris和N.hyalina，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大輪藻科植物葉綠體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，以便更好的對(duì)其進(jìn)行深入研究.

球狀輪藻葉綠體全基因組結(jié)構(gòu)與序列信息的揭示，為其遺傳背景的研究和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的探索奠定了基礎(chǔ).利用葉綠體結(jié)構(gòu)基因組特征探究和驗(yàn)證輪藻系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系，為解決輪藻科部分物種分類(lèi)混亂的問(wèn)題提供了新的解決方案.后續(xù)作者將通過(guò)增加樣本容量、加入更多有效分子片段并結(jié)合形態(tài)學(xué)分類(lèi)特征等對(duì)輪藻科植物的分類(lèi)學(xué)地位進(jìn)行進(jìn)一步探究，以期解決輪藻植物部分分類(lèi)混亂的問(wèn)題.