王釗，張雪，陳紫蘊，李玉江，張本尚，鄒建*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002）

牛肉由于味道醇美、蛋白質(zhì)含量豐富且其蛋白質(zhì)的組成與人體的必需氨基酸組成相似[1]，受到人們的普遍喜愛。 然而牛肉在加工后，隨著放置時間的延長，往往出現(xiàn)色澤劣化現(xiàn)象[2]，導(dǎo)致感官性狀變差，降低了商品價值。 為消除不良色澤對產(chǎn)品的影響，人們通常選擇添加抗氧化劑和發(fā)色劑來改善牛肉產(chǎn)品色澤，其中最常用的是亞硝酸鈉。 史料記載，早在宋代時亞硝酸鈉就被廣泛用于臘肉的防腐和發(fā)色[3]，并使肉制品呈現(xiàn)出誘人的色澤[4]，顯示出了優(yōu)秀的發(fā)色能力。

然而，亞硝酸鈉本身具有較強的毒性和潛在的致癌作用，過量攝入將對人體造成危害甚至危及生命[5-6]，因此， 低硝著色劑成為當(dāng)前肉制品加工的研究熱點。近年來，國內(nèi)外研究表明許多天然物質(zhì)提取物能夠部分替代亞硝酸鈉，從而有效降低亞硝酸鈉的使用量[7-11]。例如，周頔等[12]將海藻糖、乳酸鈉用于冷鮮牛肉護色保鮮，取得了良好效果；周鳳超等[13]研究發(fā)現(xiàn)花椒、丁香和桂皮提取物能夠有效清除亞硝酸鹽；張雪等[14]采用茶多酚、異抗壞血酸鈉、抗壞血酸復(fù)配著色劑，在獲得色澤良好牛肉產(chǎn)品的同時有效地降低了亞硝酸鈉的殘留量；郭紅珍等[15]將大蒜浸提液用于火腿當(dāng)中，顯示出了良好的亞硝酸鹽清除能力。 與此同時，天然可食用紅色素引起了人們的關(guān)注。 與其它天然產(chǎn)品提取物相比， 許多天然紅色素不但本身具有良好的著色效果，還兼具抗氧化、清除自由基及其它保健功能，將其用于肉制品低硝著色配方，往往顯示出良好效果[16]。例如，李星等[17]研究表明，紅曲紅色素、高粱紅色素在肉制品中具有良好的發(fā)色效果， 可以部分替代亞硝酸鹽。 姚波等[18]在臘腸中加入0.03 g/kg 的紅曲紅色素進行發(fā)色，結(jié)果表明紅曲紅的發(fā)色效果與亞硝酸鹽的發(fā)色效果接近。

鑒于亞硝酸鹽在肉制品生產(chǎn)中安全問題的重要性和廣泛性，以及天然可食用紅色素良好的著色能力和豐富的抗氧化保健功能， 本文以烹制牛肉為載體，選取安全可靠、 功能豐富的水溶性紅色素紅曲紅、胭脂蟲紅與脂溶性紅色素辣椒紅、番茄紅、甜椒紅，以牛肉的紅度值a*為指標，考察它們代替亞硝酸鹽的發(fā)色作用，并在此基礎(chǔ)上進行復(fù)配研究。 本文旨在探索天然紅色素作為著色劑替代亞硝酸鹽的可行性和著色效果，建立低硝著色方案，降低牛肉產(chǎn)品中的亞硝酸鹽殘留量，提升產(chǎn)品安全性和營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

冷鮮牛肉：河南伊塞牛肉股份有限公司，肉質(zhì)新鮮，月齡36 月，72 h 排酸成熟。

無水乙醇（分析純）：天津富宇精細化工有限公司；冰乙酸（分析純）、濃鹽酸（分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硼砂（分析純）：湖北盛天恒創(chuàng)生物科技有限責(zé)任公司；對氨基苯磺酸（分析純）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；鹽酸萘乙二胺（分析純）：天津市光復(fù)精細化工研究所；乙酸鋅（分析純）：湖北信康醫(yī)藥化工有限公司；亞鐵氰化鉀（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：四川金山制藥有限公司；紅曲紅色素：廣東天益生物科技有限公司；辣椒紅色素：佛山市禾大生物科技有限公司；胭脂蟲紅色素：佛山市康能生物科技有限公司；番茄紅色素和甜椒紅色素參照文獻[19-20]自行制備。

1.2 設(shè)備

HWCL-3 型集熱式恒溫磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Hei-VAP Precision HL 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道夫（heidolph）儀器公司；KQ5200E 型超聲波清洗器： 昆明市超聲儀器有限公司；FA3204B 型電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TU-1901 型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FreeZone 型真空冷凍干燥儀： 美國LABCONCO 儀器公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋： 方科儀器（常州）有限公司；CR-400 CHROMA METER 色彩色差儀：柯尼卡美能達（中國）投資有限公司；KT300 電子數(shù)顯食品溫度計：潮州市潮安區(qū)保德儀器有限公司。

1.3 試驗方法

首先，將冷鮮牛腱肉的筋膜、淋巴組織除去，并統(tǒng)一分割成質(zhì)量為20 g 的肉塊。 然后，按照試驗設(shè)計添加量，分別用5 mL 的純凈水和無水乙醇溶解亞硝酸鹽與所用天然紅色素，并使用注射器將腌制液注射到牛肉塊中， 通過滾揉的方式使牛肉均勻地吸收腌制液，置于4 ℃條件下冷藏48 h 以便充分腌制。

加工時分別按照煮、烤、煎的烹飪方式進行：1）煮制，在鍋中加入去離子水，水量以能沒過牛肉塊為標準（肉∶水=5 ∶4，質(zhì)量比），在沸騰（100 ℃）條件下，放入腌制好的牛肉塊，煮制5 min 后取出備用，牛肉得率為75%。 2）烤制，腌制好的牛肉擺放在涂少許油的烤盤中。 打開烤箱預(yù)熱2 min，在180 ℃條件下烤制10 min后取出。 3）煎制，在鍋中加入食用油，油的量以肉厚度的一半為標準，邊加熱邊用溫度計測量油溫，當(dāng)油溫加熱至170 ℃左右時放入腌制好的牛肉煎制5 min。

1.4 天然紅色素的篩選

1.4.1 著色劑添加量的確定

分別以肉重0.03%、0.05%、0.07%的比例向牛肉塊中添加紅曲紅， 在4 ℃條件下腌制48 h， 并按照肉重0.01%的比例使用亞硝酸鈉腌制牛肉塊， 建立平行對照組。將各濃度已腌制牛肉加工后測量其紅度值a*，對比紅曲紅和亞硝酸鈉腌制效果，找出與亞硝酸鈉腌制效果較為接近的著色劑添加量。

1.4.2 天然紅色素著色效果對比

將紅曲紅色素、胭脂蟲紅色素、甜椒紅色素、番茄紅色素、辣椒紅色素按照所確定的添加量加入到牛肉中，在4 ℃下腌制2 d，并與使用肉重0.01%的亞硝酸鈉對比。 將腌好的肉分別進行煮制、烤制、煎制處理后測量其紅度值a*。 把牛肉按照煮制、烤制、煎制分為3 組，分別對各組內(nèi)的紅度值a*進行比較。篩選不同加工方式處理下著色效果較好的天然紅色素。

1.4.3 天然紅色素穩(wěn)定性對比

將紅曲紅、胭脂蟲紅、甜椒紅、番茄紅、辣椒紅按照初步確定的添加量分別加入到牛肉塊中， 在4 ℃下腌制48 h。加工后將牛肉塊置于4 ℃條件下冷藏保存。每48 h 測量一次牛肉的紅度值a*， 從中篩選出穩(wěn)定性較好的著色劑。

1.5 天然紅色素的復(fù)配試驗

將篩選出的著色效果及穩(wěn)定性較好的天然紅色素進行復(fù)配，并按照原添加量的三分之一上下浮動進行正交試驗，篩選著色劑的較優(yōu)復(fù)配比。 在此基礎(chǔ)上，將按照最佳效果進行復(fù)配的天然紅色素混合物與亞硝酸鈉進行復(fù)配，考察低亞硝酸鈉著色方案的效果。

1.6 測定指標

選取紅度值a*為色度值的代表性指標，用色差儀進行測定。每個樣品平行測定3 組，取平均值。牛肉中亞硝酸鹽的含量的測定按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中第二法——分光光度法進行測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 著色劑添加量的確定

通過測量不同添加量的紅曲紅色素腌制的牛肉紅度值，將其紅度值a*與對應(yīng)的亞硝酸鈉腌制牛肉的紅度值a*進行對比，其結(jié)果如表1 所示。

表1 紅曲紅與亞硝酸鈉對比試驗結(jié)果Table 1 Comparison test results of monascus red and sodium nitrite

由表1 可知隨著紅曲紅添加量的增加， 牛肉的紅度值a*也隨之增大，但與亞硝酸鈉相比存在顯著差異（p<0.05）。 據(jù)文獻報道[21]，通常情況下紅曲紅添加量在肉重的0.06%左右， 而且一味地增加紅曲紅的添加量不僅無法使牛肉得到理想的色澤， 也會增加加工成本。因此，本文選取占肉重0.07%的著色劑添加量為試驗添加標準。

2.2 加工后天然紅色素著色效果對比結(jié)果

將腌制好的牛肉分別進行加工后測量其紅度值a*，比較具有不同溶解性質(zhì)的天然紅色素的著色效果。

2.2.1 煮制牛肉著色效果

煮制牛肉紅度值測量結(jié)果見表2。

表2 煮制時紅度值a*測量結(jié)果Table 2 Measurement results of redness value a*under cooking

如表2 所示，所選用的5 種天然紅色素中，牛肉紅度值最高的為辣椒紅，其次是紅曲紅，剩下三者效果較差，且天然紅色素著色效果與亞硝酸鈉存在顯著差異（p<0.05）。

2.2.2 烤制牛肉著色效果

烤制牛肉紅度值測量結(jié)果見表3。

表3 烤制時紅度值a*測量結(jié)果Table 3 Measurement results of redness value a*under baking

如表3 所示，所選用的5 種天然紅色素中，牛肉的紅度值最高者是紅曲紅，其次是甜椒紅，剩下三者效果較差，且天然紅色素著色效果與亞硝酸鈉存在顯著差異（p<0.05）。

2.2.3 煎制牛肉著色效果

煎制牛肉紅度值測量結(jié)果見表4。

表4 煎制時紅度值a*測量結(jié)果Table 4 Measurement results of redness value a*under frying

如表4 所示，所選用的5 種天然紅色素中，牛肉的紅度值最高者是紅曲紅，其次是番茄紅，剩下三者效果較差，且天然紅色素著色效果與亞硝酸鈉存在顯著差異（p＜0.05）。

2.3 著色劑穩(wěn)定性對比

將經(jīng)5 種紅色素及亞硝酸鈉分別腌制的牛肉置于4 ℃條件下，并分別檢測第0 天、第2 天、第4 天、第6天時的紅度值a*，結(jié)果如表5 所示。

由表5 可知，隨著時間的推移，由番茄紅腌制的牛肉紅度值明顯降低， 說明番茄紅色素的穩(wěn)定性較差，不宜用于牛肉的著色和加工。 其它紅色素腌制的牛肉隨時間變化其紅度值降低趨勢平緩、 數(shù)值下降微弱，均顯示出了良好的穩(wěn)定性。 綜上所述，煮制時宜選擇紅曲紅與辣椒紅進行復(fù)配。 在烤制、煎制時，宜選擇紅曲紅與甜椒紅進行復(fù)配。

表5 紅度值a*隨時間變化結(jié)果Table 5 Redness value a*change results with time

2.4 色素復(fù)配正交試驗

各色素的添加量分別以單因素試驗最適添加量的三分之一為標準， 并以上下浮動各取3 個水平的方式進行正交試驗[22]，如表6 所示。

表6 色素復(fù)配正交試驗因素水平Table 6 Factors level of orthogonal test for pigment compounding

2.4.1 煮制時復(fù)配正交試驗

煮制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果見表7。

表7 煮制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果Table 7 Orthogonal test results of pigment combination during cooking

續(xù)表7 煮制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果Continue table 7 Orthogonal test results of pigment combination during cooking

由表7 中可以看到，在煮制時，能使牛肉有較高紅度值a*的最優(yōu)復(fù)配方案為A3B3， 即紅曲紅按0.03%添加，辣椒紅按0.03%添加。影響牛肉紅度值a*的因素主次順序為：B＞A，即辣椒紅的添加量對牛肉的顏色影響較大，紅曲紅的添加量對牛肉的顏色影響較小。

2.4.2 烤制時復(fù)配正交試驗

烤制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果見表8。

表8 烤制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果Table 8 Orthogonal test results of pigment combination during baking

續(xù)表8 烤制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果Continue table 8 Orthogonal test results of pigment combination during baking

由表8 中可以看到，在烤制時，使牛肉有較高紅度值a*的最優(yōu)復(fù)配方案為A3B3，即紅曲紅按0.03%添加，甜椒紅按0.03%添加。 影響牛肉紅度值a*的因素主次順序為：A＞B，即紅曲紅的添加量對牛肉的顏色影響較大，甜椒紅的添加量對牛肉的顏色影響較小。

2.4.3 煎制時色素復(fù)配的研究

煎制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果見表9。

表9 煎制時色素復(fù)配正交試驗結(jié)果Table 9 Orthogonal test results of pigment combination during frying

由表9 可以看到，在煎制時，使牛肉有較高紅度值a*的最優(yōu)復(fù)配方案為A3B3，即紅曲紅按0.03%添加，甜椒紅按0.03%添加。 影響牛肉紅度值a*的因素主次順序為：A＞B， 即紅曲紅的添加量對牛肉的顏色影響較大，甜椒紅的添加量對牛肉的顏色影響較小。

已知煮制、烤制、煎制時最優(yōu)方案對應(yīng)的紅度值a*分別為9.38、10.18、10.23，而亞硝酸鈉腌制的牛肉經(jīng)過煮制、 烤制、 煎制后的紅度值a*分別為12.86、14.25、16.14。 以紅度值a*為評價指標進行方差分析后發(fā)現(xiàn)0.01＜p＜0.05，即存在著顯著性差異，所以只用紅色素腌制的著色效果不能很好達到亞硝酸鈉腌制的效果，需要紅色素與亞硝酸鈉進行復(fù)配使用。

2.5 紅色素與亞硝酸鈉復(fù)配正交試驗

把不同加工方式下對應(yīng)的最佳色素復(fù)配方案分別與亞硝酸鈉進行復(fù)配，因素水平見表10，把用色素與亞硝酸鈉腌制的牛肉分別進行煮制、烤制、煎制，觀察紅度值a*的變化，優(yōu)化復(fù)配方案。

表10 色素與亞硝酸鈉復(fù)配正交試驗因素水平Table 10 Factors level of orthogonal test for the combination of pigment and sodium nitrite

2.5.1 煮制時色素與亞硝酸鹽復(fù)配研究

將由不同比例的復(fù)合色素和亞硝酸鈉腌制48 h后的牛肉煮制，并檢測其紅度值a*。表11 為辣椒紅-紅曲紅復(fù)合色素與亞硝酸鈉復(fù)配試驗結(jié)果。

表11 煮制時色素-亞硝酸鈉復(fù)配正交試驗結(jié)果Table 11 Orthogonal test results of pigment-sodium nitrite compound during cooking

由表11 可知，在煮制時影響牛肉紅度值a*的因素主次順序為：D＞C，即亞硝酸鈉的添加量對牛肉的顏色影響較大，復(fù)合色素的添加量對牛肉的顏色影響較小，最佳復(fù)配方案為C3D3，即復(fù)合色素添加量為0.064%（辣椒紅的添加量為0.032%、紅曲紅的添加量為0.032%），亞硝酸鈉添加量為0.006%，此時紅度值為12.02。

2.5.2 烤制時色素與亞硝酸鹽復(fù)配研究

將由不同比例的復(fù)合色素和亞硝酸鈉腌制48 h后的牛肉烤制，并檢測其紅度值a*。表12 為甜椒紅-紅曲紅復(fù)合色素與亞硝酸鈉復(fù)配試驗結(jié)果。

表12 烤制時色素-亞硝酸鈉復(fù)配正交試驗結(jié)果Table 12 Orthogonal test results of pigment-sodium nitrite compound during baking

由表12 可知，在烤制時影響牛肉紅度值a*的因素主次順序為：D＞C，即亞硝酸鈉的添加量對牛肉的顏色影響較大，復(fù)合色素的添加量對牛肉的顏色影響較小，最佳復(fù)配方案為C3D3，即復(fù)合色素添加量為0.064%（甜椒紅的添加量為0.032%、 紅曲紅的添加量為0.032%）， 亞硝酸鈉添加量為0.006%， 此時紅度值為14.03。

2.5.3 煎制時色素與亞硝酸鹽復(fù)配研究

將由不同比例的復(fù)合色素和亞硝酸鈉腌制48 h后的牛肉煎制，并檢測其紅度值a*。表13 為甜椒紅-紅曲紅復(fù)合色素與亞硝酸鈉復(fù)配試驗結(jié)果。

表13 煎制時色素-亞硝酸鈉復(fù)配正交試驗結(jié)果Table 13 Orthogonal test results of pigment-sodium nitrite compound during frying

由表13 可知， 在煎制時影響牛肉紅度值a*的因素主次順序為：D＞C，即亞硝酸鈉的添加量對牛肉的顏色影響較大，復(fù)合色素的添加量對牛肉的顏色影響較小，最佳復(fù)配方案為C3D3，即復(fù)合色素添加量為0.064%（甜椒紅的添加量為0.032%、紅曲紅的添加量為0.032%），亞硝酸鈉添加量為0.006%，此時紅度值為16.03。

2.6 亞硝酸鹽殘留量的確定

2.6.1 亞硝酸鹽標準曲線

根據(jù)GB5009.33—2016 中第二法繪制出亞硝酸鹽標準曲線，如圖1 所示。

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 Standard curve of nitrite

2.6.2 亞硝酸鹽殘留量

根據(jù)GB 5009.33—2016 中第二法測量樣品中亞硝酸鹽殘留量，結(jié)果如表14 所示。

表14 紅度值a*與亞硝酸鹽殘留量結(jié)果Table 14 Results of redness value a*and nitrite residue

以紅度值a*為評價指標進行方差分析后發(fā)現(xiàn)3 種加工方式均表現(xiàn)為p ＞0.05，試驗組與對照組紅度值a*相比差異性不顯著。與此同時，3 種烹制方法加工試驗組的亞硝酸鹽殘留量相比對照組殘留量的下降值均超過了53%，表明天然色素（天然植物提取物）對降低亞硝酸鹽殘留具有突出效果，符合已經(jīng)報道的研究成果[14，21-23]。究其原因，紅曲紅、辣椒紅和甜椒紅色素均為具有優(yōu)秀抗氧化能力的天然色素，可有效清除亞硝酸鹽，降低肉中的亞硝酸鈉殘留量[24]。

試驗結(jié)果表明，牛肉烹制時由于天然紅色素本身不耐高溫以及色素溶于煮湯和食用油等因素的影響，僅僅添加天然紅色素不能達到理想的著色效果，因此應(yīng)與亞硝酸鈉復(fù)配使用。 煮制時由于水溶性紅色素更易溶于煮湯中，因此脂溶性辣椒紅色素的著色效果和穩(wěn)定性均優(yōu)于水溶性紅曲紅色素。 在烤制、煎制時由于脂溶性紅色素更容易溶于油中， 使脂溶性紅色素的著色效果略低于水溶性紅色素。 因此，在添加天然紅色素時建議采用脂溶性和水溶性色素混合使用的方法。

3 結(jié)論

本文通過紅色素單因素試驗和復(fù)配正交試驗確定了3 種烹制方式下各自脂溶性紅色素、 水溶性紅色素和亞硝酸鈉的最佳復(fù)配比：煮制時辣椒紅添加量為0.032%，紅曲紅添加量為0.032%，亞硝酸鈉的添加量為0.006%；烤制和煎制時，甜椒紅添加量為0.032%，紅曲紅添加量為0.032%， 亞硝酸鈉的添加量為0.006%。在此復(fù)配比下各牛肉的紅度值a*與亞硝酸鈉腌制牛肉的紅度值a*極為接近，而亞硝酸鈉的殘留量降低了53%以上。

本文所展示的低硝復(fù)合腌制劑可有效降低傳統(tǒng)的亞硝酸鹽用量，并顯著改善發(fā)色腌制效果，在不降低牛肉感官性狀的同時提升了產(chǎn)品的安全性，具有重要的市場應(yīng)用價值。