黃驊特產(chǎn)皮皮蝦蝦殼中甲殼素的制備研究

陳依淼， 許召旭，司星雨，牛亞男，秦征帆，史興辰，姜寶杰*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工系，河北 滄州 061100；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

甲殼素，又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，是一種由β-1，4 糖苷鍵連結(jié)的天然高分子線性化合物[1]，主要存在于昆蟲的外殼、甲殼類動物的骨骼和外殼中[2]。 蝦、蟹等水產(chǎn)品的廢棄物[3-5]是甲殼素的主要制備原料。 近年來，隨著研究的深入，甲殼素被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、工業(yè)織染等領(lǐng)域[6-7]。

目前，制備甲殼素常見的方法有酸堿法、微生物發(fā)酵法、酶解法和預(yù)處理法[8-11]等，工業(yè)上制備甲殼素的主要方法是酸堿法[2]，對環(huán)境污染較大。 基于此現(xiàn)狀，國內(nèi)外把甲殼素的制備方法轉(zhuǎn)向生物制備， 其中發(fā)展相對成熟的是微生物發(fā)酵法和酶解法[12-13]，酶解法與化學(xué)法相結(jié)合的方法較少[14-16]。

皮皮蝦是河北省黃驊市的特產(chǎn)之一， 具有很高的食用價值和產(chǎn)品附加值[17]，但由于深加工工藝不夠完善，導(dǎo)致產(chǎn)品附加值較低，存在原料浪費情況嚴(yán)重等問題。 采用中性蛋白酶去除蛋白質(zhì)結(jié)合醋酸脫鈣的方法處理黃驊特產(chǎn)皮皮蝦蝦殼， 對蝦殼中甲殼素的制備工藝進行探索，提高甲殼素得率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料與試劑

黃驊特產(chǎn)皮皮蝦：市售；中性蛋白酶（50 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；醋酸：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸銅、乙二胺四乙酸二鈉：天津市北辰方正試劑廠；碳酸鈣：天津市光復(fù)精細化工研究所；硫化鈉、檸檬酸鈉：天津市化學(xué)試劑三廠；氫氧化鉀：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；鈣紅指示劑、鹽酸、乙醇：天津東麗區(qū)天大化學(xué)試劑公司。 以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

萬能粉碎機（HX-300A）：永康藥具廠；高速冷凍離心機（HG-3018R）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DKT200-1）：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（SD101-1DB）、電子分析天平（FA2204B）、可見分光光度計（722VIS-722）：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦殼預(yù)處理

皮皮蝦水煮后剔除蝦肉，保留蝦殼，清洗干凈后置于烘箱充分烘干。 每次烘干3 h，直到烘干前后兩次樣品質(zhì)量保持不變，粉碎機處理后過80 目篩并儲存。

1.2.2 脫蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化試驗方案

本試驗設(shè)定的3 個單因素分別為處理時間、 處理溫度和酶添加量。 每個試驗組向三角燒瓶中添加1 g經(jīng)過預(yù)處理的蝦殼粉、20 mL 蒸餾水和中性蛋白酶，混勻后水浴加熱， 每組設(shè)定3 個平行試驗。 酶解結(jié)束后靜置，利用雙縮脲試劑和可見分光光度計測定上清液中的蛋白質(zhì)含量， 用以判斷該條件下脫蛋白的效果，溶液的吸光度越高，說明該條件脫蛋白效果越好。

將三角瓶中殘留物過濾，傾去濾液，將濾渣沖洗至中性后放入烘箱烘干，即得第一級產(chǎn)物。

1.2.2.1 單因素試驗設(shè)計

以處理時間為單因素時， 設(shè)梯度為1、2、3、4、5 h，固定酶添加量為5 000 U，處理溫度為50 ℃。以處理溫度為單因素時，設(shè)梯度為30、40、50、60、70 ℃，固定酶添加量為5 000 U，處理時間為1 h。以酶添加量為單因素時，設(shè)梯度為1000、3000、5000、7 000、9 000 U，固定處理時間為1 h，處理溫度為50 ℃。

1.2.2.2 中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)工藝響應(yīng)面設(shè)計

分別以處理時間、 處理溫度和酶添加量為自變量，依據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計各變量水平，中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

表1 脫蛋白質(zhì)工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Design of response surface test for deproteinization process

1.2.3 脫鈣鹽工藝優(yōu)化試驗方案

本試驗設(shè)定的3 個單因素分別為處理時間、 處理溫度和水與醋酸體積比。 每個試驗組向三角燒瓶中添加1 g 第一級產(chǎn)物、20 mL 醋酸溶液，混勻后水浴加熱，每組試驗進行3 個平行。 產(chǎn)物靜置后利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法測定上清液中的鈣離子的含量，用以判斷該條件下脫鈣鹽的效果，滴定過程中消耗的EDTA 量越大，說明該條件脫鈣鹽效果越好。

將三角瓶中殘留物過濾，傾去濾液，將濾渣沖洗至中性后烘干，即得到甲殼素。

1.2.3.1 單因素試驗設(shè)計

以處理時間為單因素時，設(shè)梯度為0.5、1、1.5、2 h，固定水與醋酸體積比為9 ∶1，處理溫度為40 ℃。 以處理溫度為單因素時，設(shè)梯度為20、30、40、50、60 ℃，水與醋酸體積比為9 ∶1，處理時間為1 h。 以水與醋酸體積比為單因素時，設(shè)梯度為4 ∶1、9 ∶1、14 ∶1、19 ∶1、24 ∶1，固定處理時間為1 h，處理溫度為40 ℃。

1.2.3.2 脫鈣鹽工藝響應(yīng)面設(shè)計

分別以處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比為自變量，依據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計各變量水平見表2。

表2 脫鈣鹽工藝的響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 2 Response surface test design of decalcification process

1.3 甲殼素得率的計算

準(zhǔn)確稱量1 g 經(jīng)過預(yù)處理的蝦殼粉， 以優(yōu)化后的脫蛋白質(zhì)工藝進行脫除蛋白質(zhì)，反復(fù)水洗并離心去除上清液，收集殘留物，晾干后稱重，計算第一級產(chǎn)物得率，試驗進行3 個平行。

準(zhǔn)確稱量1 g 第一級產(chǎn)物， 以優(yōu)化后的脫鈣鹽工藝進行脫鈣，離心去除上清液后收集殘留物，晾干后稱重，計算該步驟得率，試驗進行3 個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)單因素試驗結(jié)果

使用中性蛋白酶處理粉碎后的蝦殼，分析處理時間、處理溫度以及酶添加量對中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)的影響，以雙縮脲法測定上清液中蛋白含量的吸光度為縱坐標(biāo)，結(jié)果見圖1。

圖1 處理時間、處理溫度和酶添加量對中性蛋白酶脫蛋白效果的影響Fig.1 Effects of treatment time，treatment temperature and enzyme dosage on the deproteinization of neutral proteinase

在圖1a 中，吸光度隨著處理時間的增加先增加后減小，在2 h 時，吸光度達到最大值，此后吸光度隨著處理時間增加而遞減；在圖1b 中，吸光度隨著處理溫度的增加先增加后減小，在50 ℃時，吸光度達到最大值，此后，吸光度隨著處理溫度的增加而減小；在圖1c中， 吸光度隨著酶添加量的增加先增加后減小，在5 000 U 時，吸光度達到最大值，此后吸光度隨著酶添加量的增加而遞減。綜上，處理時間2 h、處理溫度50 ℃、酶添加量5 000 U 更有利于中性蛋白酶脫除蛋白質(zhì)。

2.2 中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化

以處理時間、處理溫度及酶添加量為自變量，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-expert 8.0.6 處理軟件進行響應(yīng)面試驗的設(shè)計，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

表3 脫蛋白質(zhì)工藝響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 3 Test plan and results of deproteinization process response surface

2.3 脫蛋白質(zhì)工藝響應(yīng)面試驗分析

回歸模型方差分析結(jié)果見表4。

表4 脫蛋白質(zhì)工藝的響應(yīng)面方差分析Table 4 ANOVA of deproteinization process response surface

由表4 可知，B、A2、B2、C2對工藝的影響極顯著，AB 的影響顯著，說明這3 個因素對脫蛋白的效果影響較為復(fù)雜。 模型顯著性檢測P＜0.000 1，說明此模型極顯著；模型失擬項P=0.060 7，不顯著，說明方程擬合度較高， 可以用于判斷3 個因素對蝦殼脫蛋白質(zhì)效率的影響。 模型的決定系數(shù)R2=0.977 0， 調(diào)整決定系數(shù)=0.947 4，說明該模型可以良好的表現(xiàn)出選定的各個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[18]，CV 值為0.83%，CV 值較小，說明試驗的精度較高，試驗較為可靠[19-20]。 A、B、C 3 個因素的F 值分別為0.23、88.43、4.71， 說明了3個因素對脫蛋白率的影響程度由大到小依次是：處理溫度＞處理時間＞酶添加量。

脫蛋白試驗的殘差正態(tài)圖見圖2。

由圖2 可以看出， 所有數(shù)據(jù)均勻地分布在擬合分布線的兩側(cè)，不存在嚴(yán)重的偏差，與方差分析表顯示的結(jié)果一致。

圖2 脫蛋白試驗的殘差正態(tài)分布Fig.2 Residual normal map of deproteinization test

等高線圖可以表現(xiàn)各因素的交互作用，等高線越呈橢圓形交互作用越強。 響應(yīng)曲面圖通過曲面的坡度來表現(xiàn)因素對響應(yīng)值的影響程度，曲面坡度越大，說明響應(yīng)值受到的影響越大[18]。 各因素交互作用對吸光度影響的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖3。

由圖3 可以看出，處理溫度與酶添加量、處理溫度與處理時間之間的交互作用的曲面坡度相對較大，而處理時間與酶添加量交互作用的曲面較平緩， 圖3 與方差分析表中數(shù)據(jù)相對應(yīng)，進一步說明處理溫度對于中性蛋白酶脫除蝦殼蛋白質(zhì)的影響較處理時間和酶添加量更為明顯。

圖3 各因素交互作用對吸光度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.3 Response surface and contour map of the interaction of various factors on absorbance

2.4 中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)的工藝驗證

依照響應(yīng)面分析法所得到的最優(yōu)脫蛋白質(zhì)條件為：酶添加量5 090.26 U、溫度48.05 ℃、處理時間1.96 h，結(jié)合現(xiàn)實情況和試驗的便利性，取最優(yōu)工藝為酶添加量5 000 U、溫度48 ℃、處理時間2 h。 按照此工藝進行5 次平行試驗，得到溶液的吸光度為0.185，與預(yù)測值0.185 2 差別很小，可以判定該模型適用，且確定此工藝為使用中性蛋白酶處理黃驊皮皮蝦蝦殼脫蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝。

2.5 醋酸脫鈣鹽單因素試驗結(jié)果

以滴定中消耗的EDTA 體積作為縱坐標(biāo)反映上清液中鈣鹽的含量情況，處理時間、溫度和水與醋酸體積比對醋酸脫鈣鹽效果的影響見圖4。

圖4 處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比對醋酸脫鈣效果的影響Fig.4 Effects of treatment time，treatment temperature and acetic acid concentration on the decalcification of acetic acid

結(jié)果表明，處理時間為1 h、處理溫度為20 ℃、水與醋酸體積比為9∶1 時，消耗的EDTA 溶液最多，說明此時上清液中的鈣離子濃度最高。 隨著處理溫度的提高，上清液中鈣離子降低，推測可能是由于醋酸是一種具有強揮發(fā)性的酸，隨著處理溫度的提高，瓶內(nèi)醋酸揮發(fā)量會逐漸增多， 從而使三角瓶內(nèi)醋酸濃度下降，影響蝦殼脫鈣鹽的效率。

2.6 醋酸脫鈣鹽工藝響應(yīng)面優(yōu)化

以處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比為自變量，利用Design-expert 8.0.6 處理軟件進行響應(yīng)面試驗的設(shè)計，試驗方案及結(jié)果見表5。

表5 脫鈣鹽工藝的響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 5 Response surface test scheme and results of decalcification process

2.7 脫鈣鹽工藝的響應(yīng)面試驗的分析

回歸模型方差分析結(jié)果見表6。

由表6 可知，二次項A2、B2、C2對脫鈣鹽的效率影響極顯著，3 個交互項影響均不顯著，說明這3 個因素對脫蛋白的效率影響較為簡單，醋酸脫鈣鹽的反應(yīng)為比較單純的化學(xué)反應(yīng)，3 個因素之間交互作用很弱。模型顯著性P<0.000 1，說明此模型極顯著；模型失擬項P=0.831 8，不顯著，說明方程擬合度較高，可以用于判斷處理溫度、處理時間和水與醋酸體積比對蝦殼脫鈣鹽效率的影響。 R2=0.978 3，R2Adj=0.950 4，說明此模型符合實際情況，CV=0.48%，CV 值小，說明試驗的精度較高，試驗較為可靠。A、B、C 3 個因素的F 值分別為0.32、2.87、1.53，說明3 個因素對脫蛋白率的影響程度由大到小依次是：處理溫度＞水與醋酸體積比＞處理時間。

表6 脫鈣鹽工藝的響應(yīng)面試驗方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test for decalcification process

脫鈣鹽試驗的殘差正態(tài)圖見圖5。

圖5 脫鈣鹽試驗的殘差正態(tài)分布Fig.5 Residual normal diagram of decalcification test

由圖5 可知， 所有數(shù)據(jù)均勻地分布在擬合分布線的兩側(cè)，不存在嚴(yán)重的偏差。

各因素交互作用EDTA 消耗量影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖6。

由圖6 可知，在處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比任一因素固定時，隨著另外兩個因素的升高，響應(yīng)值先升高后下降。綜上可得，當(dāng)處理時間1 h、處理溫度20 ℃、水與醋酸體積比8.92 ∶1 時，響應(yīng)值最高，曲線較陡。 且等高線圖及相應(yīng)曲面圖均與方差分析表中數(shù)據(jù)相對應(yīng)，結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用EDTA 消耗量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface and contour map of EDTA consumption influenced by interaction of various factors

2.8 醋酸脫鈣鹽的工藝驗證

依照響應(yīng)面分析法所得到的最優(yōu)脫鈣鹽條件為：處理時間1.02 h、 處理溫度20.17 ℃， 水與醋酸體積比8.92 ∶1。 結(jié)合現(xiàn)實情況和試驗的便利性，確定處理時間1 h，處理溫度20 ℃，水與醋酸體積比9 ∶1 為最優(yōu)工藝。以此條件進行5 次驗證試驗，得到EDTA 的消耗量為4.26 mL，與預(yù)測值4.258 mL 差別很小，可以判定該模型適用，確定此工藝為使用醋酸處理黃驊皮皮蝦蝦殼脫鈣鹽的最優(yōu)工藝。

2.9 甲殼素得率

準(zhǔn)確稱量1 g 經(jīng)過預(yù)處理的蝦殼粉進行脫除蛋白質(zhì)后，計算第一級產(chǎn)物得率，3 個平行試驗得率分別為38.09%、38.19%和37.86%。 因此第一級產(chǎn)物最終得率為38.04%。

以1 g 第一級產(chǎn)物進行脫鈣，3 個平行試驗得率分別為17.92%、18.20%和18.04%， 該步驟最終得率為18.05%。

兩步驟得率乘積即為甲殼素最終得率。 所以，以黃驊當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)皮皮蝦為材料，經(jīng)本試驗優(yōu)化方案制備甲殼素，得率為6.87%。

3 結(jié)論

本試驗以河北省滄州黃驊市的特產(chǎn)皮皮蝦蝦殼為原料，采取中性蛋白酶脫蛋白質(zhì)、醋酸脫鈣鹽相結(jié)合的方式處理皮皮蝦蝦殼，探索并優(yōu)化工藝條件，得到更加環(huán)保、有效率的甲殼素制備工藝。 本試驗確定中性蛋白酶脫蛋白的最佳工藝條件為處理時間2 h、 處理溫度48 ℃、酶添加量5 000 U；醋酸脫鈣鹽的最佳工藝條件為處理時間1 h、處理溫度20 ℃、水與醋酸體積比9 ∶1。經(jīng)本研究優(yōu)化后的甲殼素工藝，其得率為6.87%。 本試驗為利用中性蛋白酶結(jié)合醋酸制備甲殼素的工藝探究，為生物法結(jié)合化學(xué)法制備甲殼素提供一定的數(shù)據(jù)支持，以此拓寬利用水產(chǎn)品廢棄物進行精深加工的思路。