韓美珊,朱效素,呂曉燕,劉 沙,孫考祥

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺(tái) 264005)

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種間質(zhì)性肺疾病,患者肺部纖維化組織的異常增生會(huì)導(dǎo)致肺功能的進(jìn)行性和不可逆性的喪失[1]。IPF的患病例數(shù)為每10萬人中494.5例,患者的中位生存期僅為2～3a,死亡率甚至高于某些癌癥[2-3]。吡非尼酮是2014年FDA批準(zhǔn)上市用于治療肺纖維化的一種口服的吡啶酮類化合物,體外實(shí)驗(yàn)和藥效試驗(yàn)證明吡非尼酮具有抗氧化、抗炎及抗纖維化的作用[4-5]。目前,吡非尼酮已上市的劑型為膠囊和片劑,但口服給藥存在嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng)及全身性光敏反應(yīng),患者的耐受性差,同時(shí)藥物的體內(nèi)半衰期短,僅為2.2 h[6]。因此,開發(fā)出一種能夠靶向病變部位,延長藥物的半衰期并降低不良反應(yīng)的緩釋制劑是十分必要的。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,因?yàn)槁匝装Y的存在,特發(fā)性肺纖維化的微環(huán)境呈酸性[7],本研究首次構(gòu)建響應(yīng)于酸性微環(huán)境的pH敏感脂質(zhì)體,包載吡非尼酮,使藥物在呈酸性的病變部位釋放,降低藥物在周圍組織的蓄積,增加藥物的有效量,從而達(dá)到提高藥物的靶向性、降低用藥劑量,延長藥物半衰期的目的。實(shí)驗(yàn)分別采用薄膜分散法、改良的乙醇注入法和硫酸銨梯度法制備吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體,其中薄膜分散法和改良的乙醇注入法的包封率相對(duì)較低,而硫酸銨梯度法制備的脂質(zhì)體包封率較高、粒徑較小。通過葡聚糖微柱離心法純化脂質(zhì)體,紫外分光光度法測(cè)定藥物含量,采用包封率和粒徑作為指標(biāo)考察吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體的最佳制備方法,確定最佳工藝,為后續(xù)開發(fā)吸入型肺部給藥的脂質(zhì)體制劑奠定基礎(chǔ)。通過體外釋放實(shí)驗(yàn)考察吡非尼酮脂質(zhì)體的pH響應(yīng)性,為吡非尼酮新型遞藥系統(tǒng)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司),DF-101Z集熱式恒溫磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),電子分析天平(美國Mettler Toledo公司),Nicomp 380 ZLS激光粒度儀(美國PSS公司),離心機(jī)Primo R(美國SORVALL公司),UV-2450紫外分光光度儀(日本SHIMADZU公司),微量脂質(zhì)體擠出器(加拿大AVESTIN公司)。吡非尼酮(上海士鋒生物科技有限公司),二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):D0104),半琥珀酸膽固醇(CHEMS)(美國Sigma公司),硫酸銨(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司),氯化鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司),葡聚糖凝膠 G-50(華中海威基因科技有限公司),無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司),甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備方法的考察 薄膜分散法:取DOPE、CHEMS和吡非尼酮按比例溶于適量無水乙醇,將溶解的膜材轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)成膜。成膜后于50 ℃溫度下水合20 min,制得的脂質(zhì)體使用手動(dòng)擠出器(100 nm)反復(fù)擠出12次,即得吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體。

改良的乙醇注入法:取DOPE、CHEMS和吡非尼酮按比例溶于適量無水乙醇,將溶解的膜材轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,將圓底燒瓶置于50 ℃水浴加熱揮除無水乙醇,成膜后加入預(yù)熱好的4 mL超純水,50 ℃攪拌水合20 min,制得的脂質(zhì)體使用手動(dòng)擠出器(100 nm)反復(fù)擠出12次,即得吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體。

硫酸銨梯度法:取DOPE、CHEMS和吡非尼酮按比例溶于適量無水乙醇,將溶解后的膜材轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,將圓底燒瓶置于50 ℃水浴加熱揮除無水乙醇,成膜后勻速注入預(yù)熱的硫酸銨溶液,50 ℃攪拌水合20 min,制得的脂質(zhì)體使用手動(dòng)擠出器(100 nm)反復(fù)擠出12次,即得空白脂質(zhì)體。將空白脂質(zhì)體置于透析袋內(nèi),于生理鹽水中透析6 h,除去脂質(zhì)體外水相中的硫酸銨。取適量的吡非尼酮溶液與空白脂質(zhì)體混合,55 ℃孵育15 min即得吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體。

1.2.2 吡非尼酮含量測(cè)定方法的考察 最大吸收波長的確定:取適量的吡非尼酮溶于甲醇,配制一定質(zhì)量濃度的吡非尼酮甲醇溶液,采用甲醇作為對(duì)照溶液,通過紫外分光光度計(jì)在190 ～ 400 nm波長范圍內(nèi)掃描吡非尼酮的最大吸收波長。

吡非尼酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:配制質(zhì)量濃度為5、7.5、10、15、20、25 μg/mL的一系列吡非尼酮甲醇溶液,選擇317 nm作為吡非尼酮的最大吸收波長測(cè)定吸光度,以吸光度A對(duì)質(zhì)量濃度c(μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度的考察:配制高、中、低質(zhì)量濃度的吡非尼酮甲醇溶液,日內(nèi)連續(xù)5次測(cè)量吸光度,連續(xù)測(cè)定5 d,計(jì)算日間精密度和日內(nèi)精密度。

重現(xiàn)性的考察:配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的吡非尼酮甲醇溶液,連續(xù)測(cè)定5次,考察測(cè)量方法的重現(xiàn)性。

方法回收率實(shí)驗(yàn):配制高、中、低質(zhì)量濃度的吡非尼酮甲醇溶液,測(cè)定吸光度后,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度記為c0,與配制濃度c1相比檢驗(yàn)方法回收率。方法回收率=c0/c1×100%。

1.2.3 單因素考察 通過比較三種制備方法,選擇硫酸銨梯度法作為脂質(zhì)體的制備方法。采用單因素考察法對(duì)制備參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以包封率和粒徑作為指標(biāo),控制其他因素不變,改變單一變量,對(duì)磷脂與膽固醇的比例、藥物與磷脂的比例、硫酸銨溶液的濃度、孵育溫度以及孵育時(shí)間進(jìn)行考察,確定最優(yōu)處方。

磷脂與膽固醇的比例:保持“1.2.1”項(xiàng)下硫酸銨梯度法中其他條件不變,考察DOPE∶CHEMS為1∶1,1.5∶1和2∶1時(shí)脂質(zhì)體的包封率和粒徑,確定最佳的磷脂與膽固醇的比例。

藥物與磷脂的比例:保持“1.2.1”項(xiàng)下硫酸銨梯度法中其他條件不變,考察吡非尼酮與DOPE比為1∶7,1∶10和1∶15時(shí)脂質(zhì)體的包封率和粒徑,選擇最佳藥脂比。

硫酸銨溶液的濃度:保持“1.2.1”項(xiàng)下硫酸銨梯度法中其他條件不變,考察硫酸銨溶液濃度分別為150、200和250 mmol/L時(shí)脂質(zhì)體的包封率和粒徑,選擇最佳的硫酸銨溶液濃度。

孵育溫度:保持“1.2.1”項(xiàng)下硫酸銨梯度法中其他條件不變,考察孵育溫度分別為50、55和60 ℃時(shí)脂質(zhì)體的包封率和粒徑,選擇最佳的孵育溫度。

孵育時(shí)間:保持“1.2.1”項(xiàng)下硫酸銨梯度法中其他條件不變,考察孵育時(shí)間分別為10、15和20 min時(shí)脂質(zhì)體的包封率和粒徑,選擇最佳的孵育時(shí)間。

1.2.4 吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體的表征 包封率和載藥量的測(cè)定:選擇葡聚糖凝膠法純化脂質(zhì)體[8],取200 μL純化后的脂質(zhì)體用甲醇破乳并定容至5 mL,吸光度記為A0。取200 μL未純化的脂質(zhì)體同樣用甲醇破乳定容至5 mL,吸光度記為A1。經(jīng)紫外測(cè)定吸光度后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度c和包封率:包封率=c0/c1×100%。

根據(jù)測(cè)定的質(zhì)量濃度,得到脂質(zhì)體內(nèi)的吡非尼酮的量并計(jì)算載藥量(DL):

DL=We/Wm×100%。

式中，We表示包封于脂質(zhì)體內(nèi)的藥量，Wm表示載藥脂質(zhì)體的總質(zhì)量。

形態(tài)、zeta電位和粒徑的測(cè)定:取10 μL制備好的脂質(zhì)體滴于帶有碳支持膜的銅網(wǎng)上,3 min后使用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸走多余的脂質(zhì)體,取10 μL 體積分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸溶液(pH 7.4)滴于銅網(wǎng)上,自然干燥后置于透射電鏡中觀察脂質(zhì)體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。取1 mL吡非尼酮脂質(zhì)體用蒸餾水稀釋4倍后,置于比色皿中,采用Nicomp 380 ZLS激光粒度儀測(cè)量粒徑與電位。

體外釋放實(shí)驗(yàn):取1 mL吡非尼酮pH脂質(zhì)體置于透析袋內(nèi),將透析袋放入分別裝有50 mL pH 7.4和pH 5.5的PBS的離心管中,采用水浴恒溫震蕩法,搖床的條件設(shè)置為100 r/min,溫度為37 ℃。分別于0.083、0.5、1、2、4、8、24、48 h取1 mL釋放介質(zhì),并補(bǔ)充1 mL PBS。采用紫外分光光度法測(cè)量并計(jì)算累積釋放度。

2 結(jié) 果

2.1 制備方法的考察

采用薄膜分散法和改良的乙醇注入法制備的脂質(zhì)體,包封率較低,脂質(zhì)體較渾濁。硫酸銨梯度法制備的脂質(zhì)體包封率高且粒徑較小(表1),因此最終選擇硫酸銨梯度法作為制備方法。

表1 不同制備方法的包封率和粒徑(n=3)

2.2 吡非尼酮含量測(cè)定方法

2.2.1 吡非尼酮最大吸收波長的選擇 如圖1所示,吡非尼酮在1處和2處皆有最大吸收,但2處為近紫外端且空白脂質(zhì)體在此處也有吸收,所以選擇1處的317 nm作為吡非尼酮的最大吸收波長。

圖1 紫外最大吸收波長掃描圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由吸光度A對(duì)質(zhì)量濃度c做回歸方程得y=0.025x+0.078 1,R2=0.999 7,表明吡非尼酮在質(zhì)量濃度范圍為5～25 μg/mL之間線性良好(圖2)。

圖2 吡非尼酮溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 精密度考察 測(cè)定結(jié)果表明,吡非尼酮溶液的三個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于1%,表明測(cè)量方法的精密度良好(表2)。

表2 吡非尼酮溶液日內(nèi)精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.2.4 重現(xiàn)性的考察 同一吡非尼酮溶液連續(xù)5次測(cè)量的質(zhì)量濃度分別為10.09、10.11、10.07、10.15、10.13 μg/mL,RSD為0.31%小于1%,表明測(cè)量方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.5 方法回收率的考察 結(jié)果表明,測(cè)定方法的回收率在100.84%～101.4%之間,方法回收率良好(表3)。

表3 吡非尼酮溶液方法回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.2.6 單因素考察 通過單因素考察,確定吡非尼酮脂質(zhì)體的最佳處方工藝為n(DOPE)∶n(CHEMS)=1.5∶1,m(吡非尼酮)∶m(DOPE)=1∶10,硫酸銨濃度為250 mmol,孵育時(shí)間為15 min,孵育溫度為55 ℃(表4)。按照最佳處方制備的脂質(zhì)體包封率高,粒徑較小,脂質(zhì)體呈略帶藍(lán)色乳光的半透明溶液。

表4 關(guān)鍵因素對(duì)脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響(n=3)

2.3 吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體的表征

2.3.1 包封率和載藥量的測(cè)定 按照單因素考察確定的最佳工藝制得的脂質(zhì)體包封率為90.1%,載藥量為6.3%,可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.3.2 形態(tài)、zeta電位和粒徑的測(cè)定 由圖3可以看出,脂質(zhì)體分散性良好,粒徑較為均一,形態(tài)完整,為球形和類球形,雖然制備電鏡樣品時(shí)的干燥過程使脂質(zhì)體的形態(tài)因失水而略受影響,但仍然可以清楚地看到脂質(zhì)體的雙層膜結(jié)構(gòu)。多次測(cè)量所得平均粒徑在109.0±3.4 nm左右(圖4),多分散指數(shù)為0.061,粒徑分布較為均勻,略帶負(fù)電(圖5)。

圖3 pH敏感脂質(zhì)體透射電鏡照片

圖4 吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體的粒徑分布

圖5 吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體的電位分布

2.4 釋放度實(shí)驗(yàn)

如圖6所示,吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體在pH為5.5的PBS中釋放較快,24 h內(nèi)可釋放80%左右,在pH為7.4的PBS中釋放較慢,24 h內(nèi)可釋放50%左右。CHEMS在pH小于5.8的條件下酸敏感性良好,因此脂質(zhì)體在pH為5.5的條件下釋放迅速,pH敏感性顯著,能夠達(dá)到在疾病部位快速釋放的目的。

圖6 吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體在不同pH條件下的體外釋放曲線

3 討 論

pH敏感脂質(zhì)體是主動(dòng)靶向制劑的一種,可以響應(yīng)于疾病的微環(huán)境釋放藥物,從而增加藥物的靶向性,減少藥物的用量,降低不良反應(yīng)[9]。脂質(zhì)體的制備方法主要有被動(dòng)載藥法和主動(dòng)載藥法。被動(dòng)載藥法是傳統(tǒng)常用的制備方法,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用薄膜分散法和改良的乙醇注入法制備吡非尼酮脂質(zhì)體,但是包封率較低。因?yàn)檫练悄嵬莾捎H性藥物,可嘗試使用主動(dòng)載藥法中的硫酸銨梯度法制備,以提高脂質(zhì)體的包封率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明硫酸銨梯度法制備的脂質(zhì)體包封率較高,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求[10]。同時(shí),本研究的靶向部位為肺部,研究表明200 nm以下的脂質(zhì)體更適合肺部給藥,且進(jìn)入肺部后,粒徑越小脂質(zhì)體的滯留時(shí)間越長[11],而相比被動(dòng)載藥法,硫酸銨梯度法制備的脂質(zhì)體粒徑較小,在100 nm左右,更適于肺部給藥。經(jīng)對(duì)比硫酸銨梯度法是制備吡非尼酮脂質(zhì)體的最佳工藝。pH敏感脂質(zhì)體常使用DOPE和CHEMS作為制備材料,DOPE在單獨(dú)存在的狀態(tài)下呈不穩(wěn)定的六角相結(jié)構(gòu)存在,加入CHEMS后形成穩(wěn)定的雙分子層結(jié)構(gòu)。在酸性條件下,CHEMS會(huì)因?yàn)橘|(zhì)子化從而使DOPE又恢復(fù)到不穩(wěn)定的六角相結(jié)構(gòu),因此實(shí)驗(yàn)采用DOPE和CHEMS作為制備吡非尼酮pH敏感脂質(zhì)體的膜材。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過處方篩選確定硫酸銨梯度法作為脂質(zhì)體的制備方法,通過單因素考察優(yōu)選最佳參數(shù),控制脂質(zhì)體的粒徑,為日后制備吸入型脂質(zhì)體奠定基礎(chǔ)。在體外釋放實(shí)驗(yàn)中,脂質(zhì)體在弱酸性環(huán)境中表現(xiàn)出良好的pH響應(yīng)性,可達(dá)到脂質(zhì)體在肺纖維化部位的快速釋放,從而提高藥物在病變部位的積累量,降低全身毒性,為吡非尼酮的擴(kuò)大應(yīng)用和特發(fā)性肺纖維化的治療提供思路。