宋 華， 朱 瑩， 鄧 蓮， 杜 瑩， 劉 娜

(北京市植物園，北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室， 北京 100093)

利用耐寒性強(qiáng)的薔薇與現(xiàn)代月季進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，是培育耐寒月季的主要途徑之一。美薔薇(Rosabella)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)灌木，為中國(guó)特有種，在北方多個(gè)地區(qū)均有分布，自然分布海拔可達(dá)1 700 m[1]，是薔薇屬優(yōu)良的耐寒種質(zhì)資源。有研究指出，美薔薇與現(xiàn)代月季雜交親和性較強(qiáng)[2]，可作為培育優(yōu)良耐寒月季的親本。由于目前美薔薇尚未在園林綠化中大量栽培利用，其自然分布多在山區(qū)且花期較晚，因此，在利用自然分布的美薔薇為父本與現(xiàn)代月季進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交時(shí)，需將其花粉貯藏至第二年使用。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期貯藏后，花粉能否保持較高活力是雜交成敗的關(guān)鍵。

花粉貯藏過(guò)程中，生活力受到貯藏溫度、濕度等外界因素的影響。一般認(rèn)為，薔薇屬植物花粉常溫保存時(shí)間較短，活力保持不足一個(gè)月[3-4]。低溫低濕的貯藏條件更利于花粉保存。超低溫保存可以大大延長(zhǎng)花粉的保存時(shí)間[5]，但需要特殊的設(shè)備。-20 ℃冷凍保存是節(jié)約能源、簡(jiǎn)便易行的貯藏條件。有研究指出，某些月季品種花粉在-20 ℃冷凍保存，活力可以維持一年以上，而且在190 d內(nèi)，與在-80 ℃保存的活力差異不大[6]。薔薇屬不同種(品種)間花粉貯藏特性差異較大[6-7]，關(guān)于美薔薇花粉貯藏特性的研究未見(jiàn)報(bào)道。

花粉離體培養(yǎng)法接近花粉自然萌發(fā)狀況，是測(cè)定花粉生活力的常用方法之一?；ǚ垭x體萌發(fā)受蔗糖、鈣、硼、生長(zhǎng)素等多種因素的影響[8]。薔薇屬不同種(品種)花粉適宜的培養(yǎng)基不同[9-11]，美薔薇花粉萌發(fā)的相關(guān)研究較少。本試驗(yàn)擬篩選美薔薇花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基，并研究不同干燥劑及貯藏溫度對(duì)美薔薇花粉活力的影響，以探索美薔薇花粉長(zhǎng)期貯藏特性，為其在月季遠(yuǎn)緣雜交育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美薔薇(RosabellaRehder & E. H. Wilson)花粉于2017年6月19日采自北京市門(mén)頭溝區(qū)靈山，09：30—10：30時(shí)收集即將開(kāi)放的花苞，13：00時(shí)用鑷子將花苞內(nèi)的花藥取下，所有花藥混合后，置于硫酸紙上，室溫條件下(25 ℃，相對(duì)濕度為30%～40%)干燥約20 h，收集花粉用于花粉離體萌發(fā)測(cè)定及貯藏試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基的篩選

選用L16(45)正交試驗(yàn)，各因子水平見(jiàn)表1，各處理重復(fù)3次，每重復(fù)觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野花粉總數(shù)不少于50粒，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2花粉貯藏方法及活力檢測(cè)

將美薔薇花粉分成小份，每份約2 mg，用硫酸紙包好。一部分放入裝有硅膠或有無(wú)水氯化鈣的離心管中，置于4 ℃冷藏保存，貯藏90 d、180 d、270 d時(shí)各取出1管進(jìn)行花粉活力測(cè)定；另一部分放入不加干燥劑的離心管中，分別置于4 ℃和-20 ℃保存，貯藏90 d、180 d、270 d、360 d、450 d、540 d、630 d時(shí)，各取出1管進(jìn)行花粉活力測(cè)定。以篩選出的最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行花粉培養(yǎng)，各處理重復(fù)3次，每重復(fù)觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野花粉總數(shù)不少于50粒，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

1.2.3花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的測(cè)定

花粉培養(yǎng)參考趙宏波等[12]的方法并稍有改動(dòng)，用吸管吸取一定量的培養(yǎng)液滴在載玻片上，用毛筆把花粉均勻地散在培養(yǎng)基上，將載玻片置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫條件下培養(yǎng)6 h后用Olympus CX 31顯微鏡觀察并用攝像系統(tǒng)截取圖片。

花粉離體萌發(fā)以花粉管長(zhǎng)于花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)。

花粉萌發(fā)率(%)=(視野內(nèi)萌發(fā)的花粉數(shù)/視野內(nèi)的花粉總數(shù))×100%。

使用ImageJ圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行花粉管長(zhǎng)度測(cè)量，每個(gè)處理每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇10根花粉管測(cè)量；萌發(fā)數(shù)量不足10根的測(cè)量所有花粉管長(zhǎng)度。

1.2.4雜交授粉方法

2018年5月13日，在北京市植物園月季育種基地進(jìn)行雜交授粉。母本選用“金獎(jiǎng)?wù)隆?R.‘Gold Medal’)及“粉后”(R.‘Queen Elizabeth’)2個(gè)月季品種，各挑選50朵即將開(kāi)放的花苞，用鑷子小心地把雄蕊去除，套袋。2018年5月14日，用毛筆將貯藏的美薔薇花粉輕刷在母本柱頭上，套袋。2018年10月8日統(tǒng)計(jì)各雜交組合的結(jié)實(shí)率及單果種子數(shù)。

結(jié)實(shí)率(%)=(結(jié)實(shí)數(shù)/授粉數(shù)) ×100%;

單果種子數(shù)(粒)=收獲的種子總數(shù)/結(jié)實(shí)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因子對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)的影響

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析可知(表2、表3)，蔗糖、H3BO3、CaCl2、MgSO4·7 H2O、KNO3等5因子對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度均有極顯著影響(p<0.01)。按影響大小排序，影響花粉萌發(fā)率的因子依次為CaCl2>蔗糖>MgSO4·7 H2O>KNO3>H3BO3(表2)，即CaCl2對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)率影響最大，其次為蔗糖；影響花粉管長(zhǎng)度的因子依次為CaCl2>蔗糖>KNO3>MgSO4·7 H2O>H3BO3(表3)。

表2 影響花粉萌發(fā)率的主效應(yīng)分析

表3 影響花粉管長(zhǎng)度的主效應(yīng)分析

正交試驗(yàn)均值(表4)表明，不同因子對(duì)花粉萌發(fā)的影響規(guī)律不完全相同。蔗糖濃度較低時(shí)(50～100 g·L-1)，隨著蔗糖濃度的增加，美薔薇花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度均逐漸升高；濃度為100 g·L-1時(shí)花粉萌發(fā)率為19.00%，是蔗糖濃度為50 g·L-1時(shí)的3.2倍；花粉管長(zhǎng)度為88.80 μm，是蔗糖濃度為50 g·L-1時(shí)的1.73倍；蔗糖濃度超過(guò)100 g·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度隨蔗糖濃度的增加而逐漸下降，蔗糖濃度為200 g·L-1時(shí)花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度均為最低；說(shuō)明蔗糖最佳濃度為100 g·L-1，過(guò)高或過(guò)低均不利于美薔薇花粉萌發(fā)。不添加H3BO3時(shí)花粉萌發(fā)率較低、花粉管長(zhǎng)度較短，分別為7.31%及41.53 μm；添加0.1 g·L-1H3BO3時(shí)，花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度顯著提高至14.26%和67.23 μm；H3BO3濃度高于0.1 g·L-1時(shí)，花粉萌發(fā)率顯著降低；說(shuō)明H3BO3最佳濃度為0.1 g·L-1，過(guò)高或過(guò)低均不利于美薔薇花粉萌發(fā)。不添加CaCl2時(shí)花粉萌發(fā)率為18.45%、花粉管長(zhǎng)度為90.43 μm，顯著高于其他水平；CaCl2濃度為0.1 g·L-1時(shí)花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度顯著降低，分別為10.09%和56.55 μm，說(shuō)明添加CaCl2不利于美薔薇花粉萌發(fā)。MgSO4·7 H2O、KNO3對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)率的影響趨勢(shì)類似，不添加MgSO4·7 H2O或KNO3時(shí)，花粉萌發(fā)率最低，隨著濃度的增加花粉萌發(fā)率顯著提高，較高濃度(0.2 g·L-1、0.3 g·L-1)時(shí)花粉萌發(fā)率無(wú)顯著差異；花粉管長(zhǎng)度變化趨勢(shì)與花粉萌發(fā)率不同，雖然MgSO4·7 H2O濃度為0.3 g·L-1時(shí)、KNO3濃度為0.2 g·L-1時(shí)花粉管長(zhǎng)度顯著高于其他水平，但在低濃度時(shí)，花粉管長(zhǎng)度沒(méi)有隨濃度的增加而上升，MgSO4·7 H2O濃度為0.2 g·L-1、KNO3濃度為0.1 g·L-1時(shí)花粉管長(zhǎng)度出現(xiàn)了顯著下降。

表4 不同因子水平對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)成分組配對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)的影響

綜合考慮花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度(表4)可知，不同因子的最佳水平分別為：蔗糖為100 g·L-1，H3BO3為0.1 g·L-1，CaCl2為0，MgSO4·7 H2O為0.3 g·L-1，KNO3為0.2 g·L-1。這與正交試驗(yàn)中的6號(hào)處理的培養(yǎng)基配比吻合(表1)。在正交試驗(yàn)16個(gè)處理中，6號(hào)處理的花粉萌發(fā)率為40.26%、花粉管長(zhǎng)度為166.77 μm，均顯著高于其他處理(表5)。因此可以推斷，美薔薇花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為6號(hào)培養(yǎng)基，即10%蔗糖+0.1 g·L-1H3BO3+0.3 g·L-1MgSO4·7 H2O+0.2 g·L-1KNO3。

表5 美薔薇花粉在正交試驗(yàn)中的萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度

2.3 不同干燥劑對(duì)花粉活力的影響

4 ℃貯藏溫度下，無(wú)論是否使用干燥劑，美薔薇花粉活力都隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(圖1)。貯藏90 d時(shí)，使用無(wú)水氯化鈣干燥劑的花粉萌發(fā)率最低，為27.33%；ck的花粉萌發(fā)率最高，為33.00%。貯藏180 d時(shí)，使用無(wú)水氯化鈣干燥劑的花粉萌發(fā)率較高，15.54%的花粉具有活力；使用硅膠干燥劑和ck的花粉活力較低，萌發(fā)率分別為11.50%和11.24%。方差分析表明，不同處理間的花粉萌發(fā)率無(wú)顯著差異，說(shuō)明使用干燥劑并不能顯著延緩花粉活力的降低；無(wú)論是否使用干燥劑，4 ℃貯藏270 d時(shí)美薔薇花粉萌發(fā)率均低于10%。

圖1 不同干燥劑對(duì)美薔薇貯藏花粉活力的影響(p<0.05)Fig.1 Effects of different desiccant on pollen viability of Rosa bella pollen in storage(p<0.05)

2.4 不同貯藏溫度對(duì)花粉活力的影響

美薔薇花粉活力隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，但不同溫度貯藏的花粉壽命不同(圖2)。4 ℃貯藏90 d時(shí)，花粉萌發(fā)率為33.00%；貯藏180 d時(shí)，花粉萌發(fā)率迅速降低，為11.33%；貯藏270 d時(shí)花粉萌發(fā)率低于10%；貯藏360 d的花粉不再萌發(fā)，失去活力。-20 ℃冷凍的花粉貯藏前期(90～270 d)活力下降較為緩慢，貯藏270 d時(shí)，花粉萌發(fā)率為32.71%，與新鮮花粉相比，萌發(fā)率僅降低了20.2%；貯藏270 d后，花粉萌發(fā)率迅速下降，貯藏360 d時(shí)花粉萌發(fā)率為19.88%，為新鮮花粉萌發(fā)率的48.5%；貯藏450 d時(shí)花粉萌發(fā)率不足10%；貯藏540 d時(shí)花粉萌發(fā)率為3.04%，基本喪失活力。-20 ℃更利于花粉長(zhǎng)期保存。

圖2 不同貯藏時(shí)間不同貯藏溫度對(duì)美薔薇花粉活力的影響Fig.2 Effects of different storage times and temperatures on the vigor of Rosa bella pollen

2.5 利用雜交育種驗(yàn)證貯藏花粉活力

利用貯藏330 d的美薔薇花粉與月季品種進(jìn)行人工授粉，結(jié)果(表6)表明，4 ℃貯藏330 d的花粉與月季品種雜交后不能結(jié)實(shí)，花粉已失去活力。-20 ℃貯藏330 d的花粉與2個(gè)月季品種雜交后均可以結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率均超過(guò)50%；美薔薇貯藏花粉與“粉后”及“金獎(jiǎng)?wù)隆钡碾s交單果種子數(shù)分別為8.45粒和1.38粒。說(shuō)明-20 ℃不添加干燥劑貯藏330 d的花粉具有活力，應(yīng)用于月季雜交育種中是可行的。

表6 美薔薇花粉貯藏330 d后在雜交中的結(jié)實(shí)情況

3 結(jié)論與討論

花粉離體萌發(fā)受蔗糖、鈣、硼、生長(zhǎng)素等多種因素的影響[8]。本研究中，蔗糖、鈣、硼、鎂、鉀等5因子均對(duì)美薔薇花粉萌發(fā)率及花粉管伸長(zhǎng)有顯著影響。適宜美薔薇花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為100 g·L-1，與單瓣黃刺玫花粉萌發(fā)研究結(jié)果一致[13]；也有研究認(rèn)為，5%～8%[14]、15%[15]或20%[9]的蔗糖溶液更利于薔薇屬植物花粉的萌發(fā)，這種差異應(yīng)該是由不同種類植物的花粉萌發(fā)特性差異導(dǎo)致。低濃度的H3BO3(0.1 g·L-1)顯著促進(jìn)美薔薇花粉萌發(fā)，與王澤翻等[13]、王嵐嵐等[16]的研究結(jié)果相似。一般認(rèn)為外源Ca2+可以促進(jìn)花粉萌發(fā)[17]，但本研究結(jié)果表明，添加CaCl2不利于美薔薇花粉萌發(fā)，與短梗冬青花粉萌發(fā)條件[18]一致。鎂和鉀是植物體內(nèi)重要元素，對(duì)油茶花粉萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用[19]，但對(duì)核桃[17]和某些月季品種[16]花粉萌發(fā)沒(méi)有顯著影響。本研究結(jié)果顯示，高濃度的MgSO4·7 H2O或KNO3(0.2～0.3 g·L-1)可顯著提高花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度；但MgSO4·7 H2O或KNO3濃度低于0.2 g·L-1時(shí)，花粉管長(zhǎng)度并不隨濃度變化呈規(guī)律性變化，可能由于鈣或蔗糖對(duì)花粉管的伸長(zhǎng)影響更大，且本研究未考慮不同因子間的交互作用，具體原因有待進(jìn)一步研究。

適宜的花粉貯藏方法可以延長(zhǎng)花粉壽命。有研究表明，比較干燥的環(huán)境(相對(duì)濕度30%～40%)中代謝過(guò)程減弱和呼吸作用降低，能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持花粉的活力[20]。本研究中，2種干燥劑不能顯著延緩美薔薇花粉活力的降低，可能由于花粉收集干燥時(shí)室內(nèi)空氣相對(duì)濕度較低，花粉貯藏時(shí)已較為干燥，所以干燥劑的使用對(duì)花粉活力變化影響不大。本研究結(jié)果表明，貯藏溫度是影響花粉長(zhǎng)期保存的主要因素，-20 ℃冷凍貯藏利于美薔薇花粉的長(zhǎng)期保存，花粉活力可以保持一年以上，與Giovannini等[6]研究結(jié)果一致。

本研究中，美薔薇花粉萌發(fā)率偏低，最高萌發(fā)率為40.26%，顯著低于平陰玫瑰品種新鮮花粉萌發(fā)率(80%以上)[21]。一方面，花粉離體萌發(fā)受培養(yǎng)組分、培養(yǎng)溫度[17]、pH值[22]等多方面影響，具體萌發(fā)條件還需進(jìn)一步優(yōu)化。另一方面，花發(fā)育時(shí)期也是影響花粉活力的重要因素[15]，本研究中為了保證花粉純度，選擇收集的花苞均未開(kāi)放，花粉萌發(fā)率偏低是否受花發(fā)育時(shí)期影響還需進(jìn)一步研究。