陳 欣，鄧彩萍，牛雅琪，王升級，賈舉慶

(1.山西農業(yè)大學 林學院，山西太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 農學院，山西太谷 030801)

棗(Zizyphusjujuba)，為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZizyphusMill.)植物，是中國特有經濟樹種。但近年來在山西晉中紅棗產區(qū)(主栽品種為‘壺瓶棗’)發(fā)生的棗黑頂病，導致棗果近成熟期頂部發(fā)黑，果味苦澀，難以食用。該病害在棗果近成熟期發(fā)病嚴重，極大地降低了棗果的經濟價值，在一定程度上制約了棗產業(yè)的發(fā)展[1]。

前期試驗通過對發(fā)病區(qū)棗果、棗葉、大氣氟含量進行測定，發(fā)現棗黑頂病的發(fā)病率與大氣氟濃度、棗果、棗葉氟含量之間均密切相關。初步認為：氟污染是誘發(fā)病害發(fā)生的一個誘因[1]。進一步研究表明，噴施鈣劑提高了棗果內SOD、POD、CAT酶活性，有效減緩棗黑頂病的發(fā)生，推測該病害的發(fā)生可能與鈣離子濃度減少有一定關系[2]。通過細胞化學定位觀察棗黑頂病果實中鈣離子時發(fā)現，健康棗果皮細胞中含有較多的Ca2+沉淀顆粒且沿細胞壁均勻分布，果肉細胞中也有少數Ca2+沉淀顆粒；而發(fā)病棗果果肉細胞器逐漸被降解，棗果實很難觀察到Ca2+沉淀顆粒[3]。近年來利用轉錄組測序方法研究果樹病害的致病機理廣為報道，如余賢美等[4]發(fā)現6個基因(CDPK26、WRKY26、ADP/ATPcarrier、TUBA、CTSF、RGA4)可以作為蘋果苦痘病防治的關鍵基因；張舒怡等[5]、李玲等[6]通過轉錄組測序技術則發(fā)現MYB、C2H2可作為今后研究棗瘋病發(fā)生的分子機理的關鍵基因。棗樹基因組測序的完成為系統(tǒng)、深入地挖掘棗樹功能基因，揭示優(yōu)良性狀的分子機制提供了重要基礎條件。本研究基于前期的試驗研究，利用轉錄組測序技術對發(fā)病棗果、噴施氫氧化鈣溶液的棗果以及健康棗果進行棗果組織轉錄組測序分析，初探棗果黑頂病可能的發(fā)病機理，為進一步防治該病害提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地來源

試驗所需的壺瓶棗果采自山西省農業(yè)科學院果樹研究所國家果樹種質棗品種資源圃。研究材料為‘壺瓶棗’，樹齡10 a左右，結實量適中。

1.2 試驗方法

于2017年7月15日棗黑頂病易發(fā)病期，對同一棗樹出現黑頂病癥狀棗果噴施氫氧化鈣溶液，質量濃度為0.011 g/L[2]，噴施頻率為 2 d/次，時間為6:00，處理20 d后采集形態(tài)近似棗果3顆(ZJPRE)。同時分別采集自然發(fā)病棗果(ZJINF)及健康棗果(ZJCON)3顆作為對照組。每個處理進行3次生物學重復。共采集樣品27個，送至北京諾禾致源生物科技有限公司進行轉錄組測序。

1.3 數據處理方法

測序得到大量的原始數據(Raw Data)，去除Raw Data中的接頭序列、引物序列及低質量Reads，得到clean reads。根據堿基質量值Q30、GC含量來判斷數據質量。采用DESeq軟件進行差異表達分析(padj <0.05)，篩選得到差異表達基因(DEG)，將獲得的差異表達基因進行功能(GO)分析和代謝通路(KEGG)分析。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量控制

本試驗通過測序獲得的轉錄組數據Q30>92.5%，遠大于85%，與參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001835785.1#/st)的比對效率為73.65%～ 75.18%，可以滿足后續(xù)的分析要求。

2.2 差異表達基因分析

差異表達基因分析表明，自然發(fā)病棗果與健康棗果(ZJINF vs ZJCON)中，有差異表達基因 13 898個，其中7 146個基因上調表達，6 752個基因下調表達；氫氧化鈣處理棗果與健康棗果(ZJPRE vs ZJCON)中，有差異表達基因5 477個，其中2 990個上調表達，2 487個下調表達(圖1)。

2.3 差異表達基因GO分析

本試驗中，將所有基因映射到GO數據庫，共有24 946個基因匹配到信息。在ZJINFvsZJCON中，有10 805個基因差異表達，上調有 5 687個，下調有5 118個。富集的GO條目主要歸納于85個生物學過程、37個細胞組分、31個分子功能。富集程度較高的前20位如表1所示。其中，在生物學過程中以細胞內穩(wěn)態(tài)(cellular homeostasis)、細胞氧化還原內穩(wěn)態(tài)(cell redox homeostasis)、谷氨酰胺族氨基酸代謝過程(glutamine family amino acid metabolic process)、離子跨膜運輸(ion transmembrane transport)、金屬離子內穩(wěn)態(tài)(metal ionhomeostasis)、細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)(cellular calcium ion homeostasis)為主(表1)，在細胞組分中以細胞(cell)、細胞部分(cell part)、細胞組分(cellular component)、細胞膜(membrane)為主，在分子功能中以泛素蛋白連接酶活性(ubiquitin protein ligase activity)、類泛素蛋白連接酶活性(ubiquitin-like protein ligase activity)、鋅離子結合(zinc ion binding)、鈣依賴磷脂結合(calcium-dependent phospholipid binding)、鈣離子結合(calcium ion binding)為主(表1)。

表1 ZJINF vs ZJCON差異基因GO富集結果Table 1 GO enrichment of DEGs in ZJINF vs ZJCON

在ZJPRE vs ZJCON中，有4 362個差異表達基因，其中2 400個基因上調表達，1 962個基因下調表達。富集的GO條目主要包含52個生物學過程、22個細胞組分、11個分子功能。富集程度較高的20個基因如表2所示。其中，在生物學過程中以防御反應(defense response)、細胞內穩(wěn)態(tài)(cellular homeostasis)、生物刺激反應(response to biotic stimulus)、生物調節(jié)(biological regulation)為主，在細胞組分中以細胞(cell)、細胞器(organelle)、核糖體(ribosome)為主，在分子功能上以氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、核糖體結構組成(structural constituent of ribosome)為主(表2)。

表2 ZJPRE vs ZJCON差異基因GO富集結果Table 2 GO function of DEGs in ZJPRE vs ZJCON

2.4 差異表達基因KEGG代謝途徑分析

在ZJINF vs ZJCON中，差異表達基因共涉及了127條代謝通路，其中氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、碳代謝(carbon metabolism)、吞噬體(phagosome)、植物-病原體互作(plant-pathogen interaction)4條代謝通路上富集的基因數目居多。在ZJPRE vs ZJCON中，差異表達基因共涉及126條代謝通路，其中碳代謝、氨基酸的生物合成、核蛋白體(ribosome)這3條代謝通路上富集的基因數目居多(表3)。植物-病原體互作、吞噬體、內質網上的蛋白質加工這3條代謝通路的富集程度較高。

表3 各對比中與病害相關的代謝通路信息Table 3 Pathway information related to disease in each group

2.4.1 棗果植物-病原體互作代謝通路 植物-病原體互作代謝通路中涉及到很多與發(fā)病相關的重要信息。代謝通路進一步分析結果表明：在ZJINF vs ZJCON中，該代謝通路涉及101個DEGs，其中74個DEGs上調，27個DEGs下調。其中CNGCs(環(huán)核苷酸門控離子通道)處有7個DEGs上調表達，2個DEGs下調表達；CDPK(鈣依賴蛋白激酶)處涉及9個DEGs上調表達，2個DEGs下調表達。在ZJPRE vs ZJCON中，該代謝通路涉及了41個DEGs，其中28個DEGs上調，13個DEGs下調。其中CNGCs處有4個DEGs上調表達；CDPK處涉及4個DEGs上調表達。

2.4.2 棗果吞噬體代謝通路 在棗果吞噬體代謝通路中，涉及到2種與鈣相關的蛋白存在差異表達。代謝通路圖進一步分析結果表明：在ZJINF vs ZJCON中，總共有67個DEGs，其中上調48個，下調19個。在CALR(calreticulin，鈣網蛋白)處有2個DEGs上調表達，1個DEG下調表達；在內質網分子伴侶calnexin處有1個DEG上調表達。在ZJPRE vs ZJCON中，總共有28個DEGs，其中上調16個，下調12個。CALR表達正常；在calnexin處有1個DEGs下調表達。

2.4.3 棗果內質網蛋白質加工代謝通路 噴鈣處理之后，CNX(鈣聯蛋白)、CRT(鈣網蛋白)這2個蛋白趨于正常表達，且歸屬于內質網蛋白質加工代謝通路。在ZJINF vs ZJCON中，該代謝通路總共有154個DEGs，其中上調有124個，下調有30個。其中CNX處有1個DEG上調表達；CRT處有2個DEGs上調表達，1個DEG下調表達。在ZJPRE vs ZJCON中，該代謝通路涉及到86個DEGs，47個上調表達，39個下調表達。其中CNX處有1個DEG下調表達，CRT表達 正常。

3 討 論

棗果黑頂病嚴重降低了棗果的經濟價值，制約了山西紅棗區(qū)棗產業(yè)的發(fā)展，但其發(fā)病機理仍不明確。前期研究發(fā)現，在棗黑頂病發(fā)病較嚴重的棗園，噴施氫氧化鈣溶液，棗黑頂病的發(fā)病率和發(fā)病程度均有所減緩，發(fā)病率由71%降為 40.6%，病情指數由4.1降為2.6[7]。Ca2+在植物體內運輸，很難運送至果實部位；因此，細胞內Ca2+濃度變化會直接影響植物生長發(fā)育以及果實品質[8]。研究表明，CaCl2處理對菠蘿黑腐病[9]、芒果軟鼻病[10]、蘋果苦痘病[11]的防控均有一定的效果。鈣對果實衰老與生理病害的發(fā)生有一定的抑制作用，其重要原因在于鈣既是膜的穩(wěn)定劑，可以維持和保護質膜的結構；鈣又可以作為細胞的第二信使，調控許多種重要的生理生化防御反應，維持細胞的正常生理功能[8]。在黃瓜[12]、番茄[13]中均發(fā)現外源Ca2+可以促進抗氧化酶活性的協(xié)調變化，提高細胞中膜的選擇性吸收能力；直接調節(jié)植物抗病基因的表達[14-15],增加植物對病蟲害的抗性。本試驗中ZJINF與ZJCON對比發(fā)現，差異表達基因功能體現在泛素蛋白連接酶活性、類泛素蛋白連接酶活性、生物刺激反應、防御反應、鈣離子穩(wěn)態(tài)、鈣依賴磷脂結合、鈣離子結合上；而ZJPRE與ZJCON對比發(fā)現，差異表達基因功能體現在防御反應、生物刺激反應上，與鈣相關的功能未被富集?？赡苁峭庠磭娛溲趸}之后，棗果發(fā)病部位鈣離子濃度升高，從而提高了棗果對黑頂病的抗性[2-3,7]，因此棗果外觀正常，未呈現發(fā)病狀態(tài)。

植物-病原互作因子在植物病害發(fā)生及其對生物或非生物脅迫應激反應中發(fā)揮重要作用。余賢美等[4]研究蘋果苦痘病發(fā)現，植物-病原體互作這條通路上富集到了與發(fā)病相關的蛋白。本研究發(fā)現，ZJINF vs ZJCON差異表達基因的KEGG富集在植物-病原體、內質網上的蛋白質加工、吞噬體3條代謝通路上，且富集程度較高。噴施氫氧化鈣處理之后，這3條代謝通路涉及的差異表達基因數目也明顯下降。這3條代謝通路上，CNGCs、CDPK、CNX、CRT、CALR、calnexin這些蛋白與植物抗病性有關。CNGCs對鈣離子有很強的非選擇性，主要參與植物對特異刺激的免疫反應，并發(fā)揮防御反應、植物發(fā)育和離子平衡等生物學功能[16-17]；CDPK是一類植物鈣離子傳感蛋白，在轉錄、代謝、運輸及其對生物和非生物脅迫等過程中發(fā)揮著極為重要的作用[18-19]。CALR及calnexin兩種鈣結合分子伴侶同樣在植物應對不良環(huán)境的抗逆方面具有突出作用；在煙草[20]和擬南芥[21]中，CNX和CRT是內質網內的重要的分子伴侶，兩者是同源蛋白，同時具有高度保守性，在結構、功能上具有很大的相似性，參與維持植物體內鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡，還參與了植物生長發(fā)育及抗逆過程[22]。CNX、CRT還參與蛋白質的加工折疊，可能影響農作物的產量及品質[22]。本試驗中，噴施氫氧化鈣處理之后棗果的CALR、CRT兩種鈣蛋白表達水平均與健康棗果無顯著差異，棗果外觀接近于正常棗果，進一步說明噴鈣提高了棗果抗病性，對病害具有一定的防治效果。

4 結 論

本研究通過對自然發(fā)病組(ZJINF)、氫氧化鈣處理組(ZJPRE)、對照組(ZJCON)3種處理下的棗果進行轉錄組測序分析，發(fā)現氫氧化鈣處理棗果之后，棗果外觀接近于正常棗果；CALR、CRT兩種蛋白的表達量有趨于正常的趨勢?；诖?，本研究認為棗黑頂病的發(fā)生可能與CALR、CRT兩種鈣相關蛋白的表達有關系。該結論為今后更好地研究棗黑頂病提供依據。

致謝：感謝山西省農業(yè)科學院果樹研究所國家果樹種質棗品種資源圃為本試驗提供樣地。