徐杭忠 李偉龍 羅 莉 陳擁軍 李 虹 翟旭亮 薛 洋 熊 林

(1. 西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 重慶市水產(chǎn)科學(xué)重點實驗室, 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室, 重慶 400715;2. 重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站, 重慶 401121; 3. 重慶市開州區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 重慶 405400)

中國大鯢(Andrias davidianus), 俗稱“娃娃魚”,是重要的野生動物資源, 目前多種因素導(dǎo)致其野生種群數(shù)量下降, 而人工增殖放流是重要的主動保護(hù)對策。目前, 大鯢人工養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟, 但飼料供給方面相對滯后[1]。本研究團(tuán)隊經(jīng)5年的技術(shù)攻關(guān), 開展了對大鯢的配合飼料原料優(yōu)選、蛋白質(zhì)需求量評定、脂肪需求量評定、桑葉提取物添加效果評價、餌料魚與配合飼料飼喂效果對比、礦物質(zhì)預(yù)混料與維生素預(yù)混料開發(fā)等方面的研究工作[2—5],創(chuàng)制了大鯢人工配合飼料并在重慶、四川、陜西、浙江、貴州和廣西等地成功示范, 目前正在開展推廣優(yōu)化工作。

野生大鯢對生活環(huán)境要求嚴(yán)格, 養(yǎng)殖條件下出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)在所難免。如何在日糧滿足蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)素需求的前提下, 維護(hù)養(yǎng)殖動物的生理健康和提高對環(huán)境的適應(yīng)能力也是營養(yǎng)學(xué)研究的重要內(nèi)容。依據(jù)民間對紫蘇傳統(tǒng)的利用方法及其在養(yǎng)殖動物日糧中的初步應(yīng)用情況[6], 本實驗研究了不同添加水平的紫蘇葉對中國大鯢生長、胃腸功能、肝臟健康、免疫及脂質(zhì)代謝的影響, 旨在探討中國大鯢配合飼料中紫蘇葉的生物學(xué)效果。為大鯢飼料配方的優(yōu)化改進(jìn)提供技術(shù)指導(dǎo), 同時為紫蘇葉在水產(chǎn)飼料中的開發(fā)應(yīng)用提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需中國大鯢(陜西種, 子二代)購于陜西省漢中市綠源大鯢養(yǎng)殖場, 紫蘇葉由重慶科峰新技術(shù)開發(fā)有限公司提供, 其他飼料原料均購于重慶大發(fā)飼料有限公司。

1.2 實驗飼料

根據(jù)大鯢的營養(yǎng)需求, 配制以魚粉、雞肉粉和魚油等為原料的大鯢基礎(chǔ)飼料, 以基礎(chǔ)飼料為對照組, 在其基礎(chǔ)上分別添加1%、2%和3%含量的紫蘇葉(實驗用紫蘇葉實測干物質(zhì)含量85.05%, 粗蛋白含量23.13%和粗脂肪含量7.78%), 配制成4種等氮等脂的實驗飼料, 分別命名為D0、D1、D2和D3。飼料原料粉碎后過40目網(wǎng)篩, 用軟顆粒飼料制粒機(jī)(四川棉豐農(nóng)業(yè)機(jī)械制造廠 9FZ-35C 型)制成直徑4 mm左右的顆粒, 自然風(fēng)干, 雙層塑料袋包裝并封口, –20℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗飼料配方及基本營養(yǎng)組成見表1。

表1 實驗飼料配方及主要營養(yǎng)成分Tab. 1 Formulation and nutrient composition of the diet (%)

1.3 實驗飼養(yǎng)管理

正式實驗前, 先將購回的大鯢靜養(yǎng)2d, 經(jīng)1%的食鹽水消毒后, 在室內(nèi)淡水養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)饑餓5d,再以大鯢基礎(chǔ)飼料(D0)馴食15d。待體質(zhì)恢復(fù)后選擇質(zhì)量均勻(54.23±0.26) g、體質(zhì)健壯的大鯢128尾,隨機(jī)分成4組, 每組設(shè)置4個重復(fù), 每個重復(fù)8尾, 飼養(yǎng)于西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的藍(lán)色塑料方形箱中, 規(guī)格70 cm×45 cm×17.5 cm, 水深5 cm,水源為曝氣自來水, 每天早晚各100%換水1次。因大鯢消化食物時間較長, 故連續(xù)投喂2d(17:30)后停食1d, 投喂3h后撈取殘餌, 每隔3周稱重1次, 然后根據(jù)實驗大鯢的增重情況調(diào)整投喂量, 每次投喂量為大鯢體質(zhì)量的0.7%—1.0%, 正式實驗時間105d。飼養(yǎng)期間無光照, 利用空調(diào)維持水溫22—25℃, 溶解氧>6.0 mg/L, 氨氮含量<0.10 mg/L, 亞硝酸鹽含量<0.10 mg/L, pH 6.5—7.5。

1.4 樣品采集

大鯢養(yǎng)殖實驗結(jié)束后饑餓72h, 每組每個重復(fù)隨機(jī)選取6尾大鯢用適量MS-222麻醉, 稱重后用1 mL的一次性無菌注射器在尾靜脈處取血, 4500 r/min離心10min制備血漿放入液氮罐中速凍后, 轉(zhuǎn)入–80℃冰箱內(nèi)保存, 用于血漿生化指標(biāo)測定。后將大鯢于冰上解剖, 取出完整內(nèi)臟團(tuán)和肝臟, 分離胃、腸道和背部肌肉樣品, 液氮速凍后, 轉(zhuǎn)入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)測定

生長指標(biāo)測定: 在養(yǎng)殖實驗結(jié)束后, 停食72h,準(zhǔn)確稱量各組大鯢體質(zhì)量和飼料質(zhì)量, 計算其生長指標(biāo), 計算公式如下:

式中,W0為鯢初始尾均重(g);Wt為鯢終末尾均重(g);D為養(yǎng)殖實驗天數(shù);F為尾均干物質(zhì)攝食量(g);N0為初始尾數(shù);Nt為終末尾數(shù)。

實驗飼料及肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的測定: 水分含量測定采用105℃恒溫干燥法(GB/T 6435-2006), 粗蛋白(CP)含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432-1994), 粗脂肪(CL)含量測定采用索氏抽提法(GB/T 6433-1994)。

抗氧化指標(biāo)測定: 總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

消化酶指標(biāo)測定: 胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

腸黏膜通透性指標(biāo)測定: 二胺氧化酶(DAO)活性、內(nèi)毒素(LPS)和D-乳酸(D-LA)含量采用上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒測定(公司代測)。

肝功能和血漿免疫指標(biāo)測定: 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)活性和一氧化氮(NO)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定; 免疫球蛋白M(IgM)含量采用上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)的Elisa試劑盒測定(公司代測)。

血漿脂質(zhì)成分測定: 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA), 用Duncan氏多重比較分析組間差異顯著性程度, 顯著水平為(P<0.05), 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇葉對大鯢生長性能及飼料利用的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 大鯢FBW、WGR和SGR均呈先升后降趨勢, 在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組分別升高了34.61%、99.79%和68.29%;FCR則隨紫蘇葉添加量的增加呈先降后升趨勢, 在D2組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組下降了24.00%; 存活率各組間差異不顯著(P>0.05; 表2)。

表2 紫蘇葉對大鯢生長性能及飼料利用的影響Tab. 2 Effects of perilla leaf on growth performance and feed utilization of Andrias davidianus

2.2 紫蘇葉對大鯢攝食量的影響

在養(yǎng)殖過程中每3周為1周期, 計算大鯢不同階段的攝食量。第1階段(0—3周), 各組間攝食量差異不顯著(P>0.05); 第2、第3和第4階段(分別為3—6周、6—9周和9—12周), D2和D3組大鯢攝食量均顯著高于D0組(P<0.05); 綜合4個階段發(fā)現(xiàn):D0組大鯢攝食量先略微上升后趨于平穩(wěn), 而D1、D2和D3組均有持續(xù)上升趨勢; 且D2組攝食量增長速率大于D3組, D3組增長速率大于D1組(表3)。

表3 紫蘇葉對大鯢階段攝食量的影響Tab. 3 Effects of perilla leaf on feed and feed efficiency intake of Andrias davidianus

2.3 紫蘇葉對大鯢肌肉營養(yǎng)組成的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 大鯢肌肉粗蛋白含量呈先升后降的趨勢, 在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組提高了5.70%; 粗脂肪含量呈持續(xù)下降趨勢, 但各組間差異不顯著(P>0.05); 水分含量各組間差異不顯著(P>0.05; 表4)。

表4 紫蘇葉對大鯢肌肉營養(yǎng)組成的影響(鮮樣)Tab. 4 Effects of perilla leaf on muscular composition of Andrias davidianus (fresh, %)

2.4 紫蘇葉對大鯢肝臟和腸道抗氧化能力的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 大鯢肝臟總抗氧化能力(T-AOC)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性均呈先升后降趨勢, 并均在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組分別提高了29.57%和46.54%; 丙二醛(MDA)含量則呈先降后升的趨勢, 在D2組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組下降了38.89%; 大鯢腸道T-AOC和T-SOD活性也呈先升后降趨勢, 均在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組分別提高了35.24%和85.73%; MDA呈先降后升的趨勢, 在D2組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組下降了46.30%(表5)。

表5 紫蘇葉對大鯢肝臟和腸道抗氧化能力的影響Tab. 5 Effects of perilla leaf on liver and gut intestinal antioxidant of Andrias davidianus

2.5 紫蘇葉對大鯢胃腸消化吸收能力的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 大鯢胃蛋白酶和H+-K+-ATP酶的活性呈先升后降趨勢, 并在D1組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組分別提高了108.20%和65.24%; 胰蛋白酶和淀粉酶呈上升趨勢,在D3組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組分別提高了133.00%和61.11%; 脂肪酶和Na+-K+-ATP酶活性則呈先升后降趨勢, 并在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05),較D0組分別提高了140.13%和59.53%(表6)。

表6 紫蘇葉對大鯢胃腸消化吸收能力的影響Tab. 6 Effects of perilla leaf on intestinal digestion and absorption function of Andrias davidianus

2.6 紫蘇葉對大鯢腸黏膜通透性的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 大鯢腸道二胺氧化酶(DAO)活性、內(nèi)毒素(ET)和D-乳酸(DLA)含量均呈先降后升趨勢, 均在D2組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組分別降低了49.25%、66.32%和49.55%(表7)。

表7 紫蘇葉對大鯢腸黏膜通透性的影響Tab. 7 Effects of perilla leaf on intestinal mucosal permeability of Andrias davidianus

2.7 紫蘇葉對大鯢免疫和肝功能的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 大鯢血漿免疫球蛋白M(IgM)含量呈先升后降趨勢, 在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組提高了69.35%; 血漿一氧化氮(NO)含量先略微下降后上升, 在D3組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組上升68.02%; 堿性磷酸酶(AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性均呈先降后升趨勢, AST和ALT在D2組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組分別下降25.68%和17.43%,AKP在D1組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組下降41.23%(表8)。

表8 紫蘇葉對大鯢免疫和肝功能的影響Tab. 8 Effects of folium perillae leaf on immune and liver function of Andrias davidianus

2.8 紫蘇葉對大鯢脂質(zhì)代謝的影響

隨著飼料中紫蘇葉添加量的增加, 血漿中總膽固醇(TC)含量呈下降趨勢, 在D3組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組降低37.45%; 甘油三酯(TG)含量各組間差異不顯著(P>0.05); 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量呈先升后降的趨勢, 在D2組出現(xiàn)最大值(P<0.05), 較D0組提高了40.91%; 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量呈先降后升的趨勢, 在D2組出現(xiàn)最小值(P<0.05), 較D0組降低了46.79%(表9)。

表9 紫蘇葉對大鯢脂質(zhì)代謝能力的影響Tab. 9 Effects of perilla leaf on fat metabolism of Andrias davidianus

3 討論

3.1 紫蘇葉提高了大鯢生長性能與飼料效率

水產(chǎn)養(yǎng)殖使用配合飼料的目標(biāo)是生產(chǎn)出高品質(zhì)的水產(chǎn)品, 實現(xiàn)最優(yōu)的生長率。趙紅梅等[8]發(fā)現(xiàn)以紫蘇等為原料的添加劑有促進(jìn)仔豬采食、提高日增重與降低料重比的作用。本實驗單獨添加紫蘇葉也取得了類似的結(jié)果。在日糧中添加適量紫蘇葉, 可明顯改善大鯢的終末尾均重、增重率和特定生長率, 降低飼料系數(shù)。并且隨著養(yǎng)殖實驗的進(jìn)行, 不同組間的攝食量差異逐步顯現(xiàn)出來。

動物肌肉營養(yǎng)組成受飼料成分影響。羅慶華等[9]、冷向軍等[10]和湯菊芬等[11]研究者發(fā)現(xiàn)在魚類飼料中添加杜仲提取物和大蒜素等中草藥或其復(fù)合物, 可顯著降低肌肉粗脂肪含量, 改善品質(zhì)。在本實驗中, 紫蘇葉的添加也改善了大鯢肌肉粗蛋白和粗脂肪的含量。這說明包含紫蘇葉在內(nèi)的部分天然植物原料對養(yǎng)殖產(chǎn)品的肉質(zhì)改良有一定作用,其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 紫蘇葉提高了大鯢抗氧化能力

紫蘇葉的抗氧化作用已在醫(yī)藥領(lǐng)域得到證實?？偪寡趸芰?T-AOC)是組織內(nèi)酶促與非酶促抗氧化能力的總和, SOD是水產(chǎn)動物體內(nèi)抗氧化酶系中的重要成員, 丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物。這3個指標(biāo)可較全面地反映機(jī)體的抗氧化能力。本實驗將紫蘇葉應(yīng)用于大鯢飼料中, 顯著提高了大鯢肝臟與腸道的抗氧化能力。這可能與紫蘇葉中含有多種抗氧化物質(zhì)有關(guān), 如黃酮類、多酚類和迷迭香酸等[6], 對清除自由基都有明顯作用。

3.3 紫蘇葉改善了大鯢胃腸功能

在飼料中營養(yǎng)物質(zhì)主要在養(yǎng)殖動物的胃腸中消化吸收, 提高胃腸消化吸收功能是保證養(yǎng)殖動物快速生長的前提。岳崟等[12]在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)紫蘇葉提取物有促進(jìn)胃腸消化吸收的作用。本實驗測定的H+-K+-ATP酶是胃酸分泌的關(guān)鍵酶, Na+-K+-ATP酶活性與腸道的主動吸收能力呈正相關(guān),其余消化酶對蛋白、脂肪和淀粉的消化起到重要作用。結(jié)果顯示, 在飼料添加紫蘇葉后, 大鯢胃腸中重要消化酶活性、胃酸分泌能力和腸道吸收能力均顯著提高。這與多種天然植物或其混合物在多個養(yǎng)殖品種上的添加效果相類似, 這可能與天然植物中富含活性物質(zhì)與天然植物纖維, 可增強(qiáng)胃腸道功能有關(guān)。

血漿中的二胺氧化酶(DAO)主要來源于腸黏膜上皮細(xì)胞, 其含量可間接反映腸道黏膜機(jī)械屏障的完整性[13]。D-乳酸與內(nèi)毒素主要是胃腸道內(nèi)多種細(xì)菌的相關(guān)產(chǎn)物, 是了解腸道黏膜通透性的重要指標(biāo)[14]。根據(jù)實驗中這些指標(biāo)的變化情況可知,2%紫蘇葉添加對增強(qiáng)腸道黏膜的屏障作用效果顯著。人工配合飼料中蛋白、脂肪等營養(yǎng)素的氧化變質(zhì)產(chǎn)物、原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子等積累到一定程度都會導(dǎo)致養(yǎng)殖動物腸道健康受損。根據(jù)本實驗的結(jié)果可以推斷, 在飼料中添加適量紫蘇葉可預(yù)防并修復(fù)腸道損傷, 促進(jìn)大鯢健康生長。

3.4 紫蘇葉改善了大鯢肝臟和免疫功能

張碩等[15]研究發(fā)現(xiàn), 黃酮類化合物具有抗四氯化碳致小鼠肝纖維化的作用, 能夠顯著降低小鼠血液中AST和ALT活性。紫蘇葉中也含有較多的黃酮類化合物。本實驗結(jié)果也證實適量紫蘇葉的添加, 有維持大鯢肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能的作用。目前, 肉食性的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種使用人工配合飼料后容易出現(xiàn)肝臟健康問題, 根據(jù)紫蘇葉保肝的藥理作用,及其添加在大鯢飼料中取得的保肝效果, 我們可以推斷, 在飼料中添加適量的紫蘇葉是一條解決部分養(yǎng)殖品種肝臟健康問題的有效途徑。

血漿中IgM的含量可直接反映機(jī)體免疫能力,NO含量則與動物機(jī)體免疫力呈正相關(guān)[16,17]。許友卿等[18]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加適量杜仲葉粉能提高青魚(Mylopharyngodon piceus)免疫能力。本實驗也得到了類似的結(jié)果, 適量的紫蘇葉添加可激活大鯢的免疫系統(tǒng), 改善大鯢的免疫防御能力。

3.5 紫蘇葉改善了大鯢脂質(zhì)代謝

動物脂質(zhì)代謝異常會引起代謝性疾病, 影響動物生長性能[19]。在本實驗中, 與脂質(zhì)代謝相關(guān)的TC、HDL-C和LDL-C指標(biāo)均有明顯改善。但紫蘇葉對TG含量影響不大, 可能與甘油三酯的主要功能是為細(xì)胞代謝提供能量, 在血漿中含量保持動態(tài)平衡有關(guān)。本實驗結(jié)果說明在大鯢飼料中添加適量紫蘇葉, 可減少膽固醇在肝臟及血管中的積累,提高鯢體健康水平。

4 小結(jié)

在本實驗條件下, 大鯢日糧中紫蘇葉的適宜添加量為2%。該添加水平對改善大鯢生長性能和胃腸肝功能等方面的綜合效果最佳。