滕爽爽 胡高宇 范建勛 柴雪良 肖國強

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室,溫州市海洋生物遺傳育種重點實驗室, 溫州 325005; 2. 三門縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 臺州 317100)

縊蟶(Sinonovacula constrictaLamarck), 屬軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 簾蛤目(Veneroida), 竹蟶科(Solenidae), 縊蟶屬(Sinonovacula), 主要分布于日本、韓國、越南和我國的沿海、河口及中低潮間帶區(qū)域, 為廣溫廣鹽海產(chǎn)雙殼貝類?？O蟶生長快, 養(yǎng)殖周期短, 味道鮮美, 具有較高的市場價值, 據(jù)FAO[1]統(tǒng)計, 2016年我國縊蟶產(chǎn)量達82.3×107kg, 占蟶類總產(chǎn)量的95.4%, 是我國沿海灘涂貝類主要養(yǎng)殖品種之一?？O蟶養(yǎng)殖過去主要集中在浙江和福建一帶, 近年來, 隨著縊蟶消費市場的擴大及人工育苗技術(shù)的成熟, 縊蟶養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展, 山東沿海地區(qū)從浙江、福建引進苗種進行培育養(yǎng)殖; 浙江沿海為了能提早出苗, 每年9月從福建和廣東等地購買親貝, 催產(chǎn)育苗, 培育的苗種又銷往山東、福建、廣東和廣西等地。頻繁地異地引苗、盲目引種和無序養(yǎng)殖等可能使得縊蟶引入群體和當(dāng)?shù)厝后w發(fā)生基因交流, 導(dǎo)致縊蟶群體遺傳多樣性降低, 縊蟶當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源混雜等問題。

目前, 關(guān)于縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的報道主要采用同工酶、線粒體COⅠ、RAPD、AFLP、ISSR、ITS和SSR等標(biāo)記來進行研究, 如王冬群等[2]利用同工酶分析野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性; Tran等[3]基于mtDNA-COⅠ和ITS2技術(shù),研究了中國、韓國和越南縊蟶種群的遺傳結(jié)構(gòu);Wang等[4]運用AFLP標(biāo)記分析了縊蟶自然群體的遺傳變異; 劉博等[5]利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究了4個縊蟶群體的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性, 與上述標(biāo)記相比, SNP標(biāo)記具有以下優(yōu)點: (1)數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定和覆蓋密度大; (2)某些SNP與生物特定性狀直接相關(guān); (3)SNP在群體中的分布頻率具有顯著差異, 更適合用于與性狀的關(guān)聯(lián)分析; (4)SNP的二態(tài)性特征使得其便于自動化檢測。SNP標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[6—10]、高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[11—15]、性狀關(guān)聯(lián)分析[16—20]、分子標(biāo)記輔助育種[21,22]和親權(quán)鑒定[23]等方面, 并表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。SNP標(biāo)記應(yīng)用于水產(chǎn)動物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)有若干報道, 如日本鰻鱺[24]、大黃魚(Larimichthys crocea)[25]、馬氏珠母貝(Pinctada fucata)[26]和櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[27]等。

本研究將采用多態(tài)性SNP分子標(biāo)記對山東、浙江、福建、廣東和廣西等地縊蟶群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析, 以期進一步揭示我國沿海縊蟶理群體的遺傳背景, 探討縊蟶群體遺傳多樣性和遺傳分化水平, 分析縊蟶地理群體遺傳變異與地理分布的關(guān)系, 為縊蟶地理群體的識別、種質(zhì)資源保護及良種選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年9—10月, 縊蟶5個種群分別采自山東東營(DY)、浙江樂清(YQ)、福建云霄(YX)、廣東湛江(ZJ)和廣西欽州(QZ)等地(圖1)?？O蟶山東東營種群采自東營河口區(qū), 是灘涂上自然繁殖自然生長群體; 其他4個群體苗種分別來源于當(dāng)?shù)刈匀划a(chǎn)苗區(qū), 人工采苗, 池塘養(yǎng)殖。每個群體取40個樣品, 解剖樣品, 取足于70%酒精中保存。樣品信息見表1。

圖1 縊蟶群體樣品采集點Fig. 1 Sample location sites of S. constricta populations

表1 縊蟶5個種群的樣品信息Tab. 1 Sample information of S. constricta populations

1.2 DNA提取、PCR擴增及產(chǎn)物檢測

DNA提取基因組DNA采用艾德萊組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒(DN0711)進行抽提,提取出來的DNA, 用1%瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性, Nano-400超微量核酸分析儀檢測DNA純度和濃度, 再配制成10 ng/μL工作液, 4℃?zhèn)溆谩?/p>

SNP位點序列信息獲得本研究所采用的縊蟶SNP位點來源于已發(fā)表文獻[28], 參考文獻中18個位點的引物序列及PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,隨機擴增18個個體, 雙向測序和拼接, 得到位點所在的序列信息。采用Primer-blast方法設(shè)計SnaPshot擴增引物和延伸引物(表2)。

SNaPShot方法檢測樣品首先, 采用擴增引物獲得PCR產(chǎn)物并純化。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括KAPA 2G Robust HotStart ReadyMix(Roche)17.0 μL, 10 mmol/L擴增引物各1.0 μL, DNA模板1.0 μL。PCR反應(yīng)程序為: 98℃變性2min, 進入35個循環(huán), 每一循環(huán)包括98℃變性10s, 復(fù)性(Tm溫度見表2)10s, 72℃延伸10s, 最后一步是72℃延伸5min。最后將產(chǎn)物于4℃下保存。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測, 鑒定有擴增產(chǎn)物后, 以快速PCR產(chǎn)物磁珠法回收純化試劑盒(志昂, GO-PCRF-5000)純化PCR產(chǎn)物。

其次, 延伸標(biāo)記和純化。SnaPshot PCR反應(yīng)體系為5 μL, 包括SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix(ABI)0.8 μL, 模板(上述純化PCR產(chǎn)物)2.0 μL,延伸引物(表2)1.2 μL, 加ddH2O至5 μL。PCR反應(yīng)程序為: 96℃變性5min, 進入25個循環(huán), 每一循環(huán)包括96℃變性10s, 復(fù)性(Tm溫度見表2)5s, 60℃延伸30s, 最后一步是60℃延伸5min。在反應(yīng)結(jié)束后, 進行第2次純化, 在每個SnaPshot PCR產(chǎn)物中, 加入SAP(1 U/μL)0.5 μL, 10×SAP Buffer 0.5 μL, 37℃孵育1h, 75℃ 15min滅活SAP酶, –20℃保存。

表2 縊蟶SNaPshot擴增引物信息Tab. 2 Sequences of SNaPshot amplification primers of S. constricta

最后, 檢測SNP位點基因型。反應(yīng)體系5 μL, 包括模板(第2次純化產(chǎn)物)0.8 μL, HiDi+GS120 (ABI)預(yù)混液4.2 μL。95℃變性5min, 待溫度降到4℃后拿出, 短離心1000 r/min后, 使用ABI 3730進行毛細管電泳, GeneMapper 4.1 進行分型統(tǒng)計。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)縊蟶5個群體15個SNP位點基因型統(tǒng)計結(jié)果, 應(yīng)用Popgene 1.32 軟件計算每個SNP位點的有效等位基因數(shù)(Ne)、shannon指數(shù)(I)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、最小等位基因頻率(MAF)、哈代-溫伯格平衡值(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)、Nei’s遺傳相似度和遺傳距離。通過STRUCTURE V2.3.3[29]判斷5個群體200個個體的遺傳結(jié)構(gòu), 根據(jù)DeltaK值確定最佳類群數(shù), 對于確定的K值, 重復(fù)運行Structure程序1000次, 每次在10000burn-in基礎(chǔ)上運行10000步, 獲得群體的遺傳結(jié)構(gòu)圖由Distruct程序構(gòu)建。采用Arlequin3.5軟件對群體進行AMOVA(Analysis of molecular variance)分析, 并計算群體間遺傳分化(Fst)。根據(jù)群體間遺傳距離數(shù)據(jù), 利用MEGA4.0對5個群體進行聚類分析, 構(gòu)建UPGMA聚類樹, 以此來確定各個群體的親緣關(guān)系遠近。

2 結(jié)果

2.1 SNaPshot擴增引物信息獲得

位點ScSNP-5、ScSNP-11和ScSNP-16測序結(jié)果存在信號衰減和雙峰現(xiàn)象, 因此在后續(xù)實驗中去掉這3個位點。其余15個位點各擴增18個個體, 經(jīng)雙向測序和拼接后獲得序列信息。根據(jù)SNaPshot引物設(shè)計原則, 參考SNP位點來源文獻[28]中各位點的突變堿基, 15個位點均各獲得2條擴增引物序列和1條延伸引物序列(表2)。

2.2 縊蟶群體遺傳多樣性分析

對15個SNP位點在5個群體的分型結(jié)果進行遺傳結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析, 結(jié)果顯示, DY、YQ、YX、ZJ和QZ的平均有效等位基因數(shù)(Ne)分別是1.754、1.555、1.558、1.533和1.519; 平均香農(nóng)指數(shù)(I)為0.605、0.501、0.502、0.489和0.471; 平均觀測雜合度(Ho)為0.317、0.282、0.282、0.265和0.285; 平均期望雜合度(He)為0.423、0.336、0.338、0.325和0.313; 平均最小等位基因頻率(MAF)為0.336、0.241、0.238、0.234和0.229(表3); 高多態(tài)性SNP(MAF≥0.30)位點數(shù)為9、5、5、4和4(圖2)。

圖2 縊蟶群體15個SNP位點最小等位基因分布Fig. 2 Minor allele distribution across five S. constricta populations using 15 single nucleotige polymorphisms

表3 基于15個多態(tài)性SNP位點的縊蟶群體遺傳多樣性分析Tab. 3 Genetic diversity summary in five populations of S. constricta from different SNPs

2.3 縊蟶群體結(jié)構(gòu)分析

采用STRUCTURE軟件分析群體結(jié)構(gòu), 假設(shè)類群值K在3—10, 進行聚類。根據(jù)DeltaK值最大來確定最佳分類群數(shù)是5(圖3), 表明200個縊蟶個體可以劃分為5個類群。基于15個SNP標(biāo)記分析各個樣品的遺傳組分在各個聚類簇中的百分比, 以75%類群屬性比作為劃分依據(jù), 200個個體類群歸屬結(jié)果如圖4。在5個聚類簇中, 聚類簇1、聚類簇2、聚類簇3、聚類簇4和聚類簇5分別包含45、38、46、38和33個個體。表4顯示了5個群體在每個聚類簇中所占比例, 東營群體中有39.7%的個體歸屬到聚類簇5, 歸屬到聚類簇1—4的個體在11.9%—17.4%,樂清群體和云霄群體分別有34.9%和34.6%的個體歸屬到聚類簇3, 湛江群體中有31.3%的個體歸屬到聚類簇1, 欽州群體中有30.8%的個體歸屬到聚類簇2。

表4 縊蟶群體在5個聚類簇占比分析Tab. 4 Proportion of analyzed S. constricta populations in each of the five clusters

圖3 LnP(D)值隨K值的變化曲線Fig. 3 The LnP (D) statistic for each given K

圖4 基于模型的群體結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Model-based ancestries

2.4 縊蟶群體AMOVA分析及遺傳分化

應(yīng)用AMOVA對縊蟶5個群體的遺傳變異進行分析(表5), 根據(jù)養(yǎng)成方式, 5個地理群體分為2組,即野生群體組和養(yǎng)殖群體組, 來自組間、群體間和群體內(nèi)個體間的遺傳變異分別為4.67%, 3.31%和92.02%(P<0.05)。按照地理分布, 分為3組, 93.38%的變異來自群體內(nèi)個體間(P<0.05)?？O蟶群體兩兩之間的遺傳分化(Fst)值在–0.0061—0.0829, 其中樂清群體和云霄群體, 湛江群體和欽州群體Fst無顯著差異(P≥0.05), 其余群體兩兩之間Fst差異顯著。Reynolds’遺傳距離在0.000(湛江群體和欽州群體)–0.0865(東營群體和湛江群體)之間(表6)。

表5 縊蟶5個群體的AMOVA分析Tab. 5 Analysis of molecular variance among S. constricta populations

表6 遺傳分化和Reynolds’遺傳距離Tab. 6 Pairwise genetic differentiation (Fst) and Reynolds’ genetic distance among five S. constricta populations

2.5 縊蟶群體遺傳距離及聚類分析

基于15個SNP位點分析縊蟶5個地理群體的Nei’s遺傳相似度和遺傳距離, 結(jié)果如表7。群體兩兩之間遺傳距離在0.0023—0.0537, 遺傳相似度在0.9477—0.9977, 群體間較高的遺傳相似度說明5個地理群體具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)。其中, 湛江群體和欽州體遺傳距離最小(0.0023), 樂清群體和云霄群體遺傳距離次之(0.0026), 東營群體與湛江群體遺傳距離最遠(0.0537)。Nei’s遺傳聚類結(jié)果顯示, 樂清群體在云霄群體聚在一起, 湛江群體和欽州群體聚在一起, 東營群體與其他4個群體遺傳距離最遠,單獨為一支(圖5)。

圖5 基于縊蟶群體間遺傳距離構(gòu)建的聚類圖Fig. 5 UPGMA clustering of samples based on Nei’s genetic distance

表7 Nei’s遺傳相似度和遺傳距離Tab. 7 Nei’s genetic identity and genetic distance

3 討論

3.1 縊蟶群體遺傳多樣性分析

群體遺傳學(xué)分析指標(biāo)中, 遺傳參數(shù)(有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和最小等位基因頻率(MAF)等的大小反映了群體遺傳多樣性水平, 其數(shù)值越大, 說明基因豐富度越高。本研究的結(jié)果表明, 5個群體的Ne為1.519—1.754,I為0.471—0.605,Ho為0.265—0.317,He為0.313—0.423, MAF為0.229—0.336。Jiang等[25]利用飛行質(zhì)譜陣列SNP基因分型技術(shù)(Sequenom MassARRAY)分析了大黃魚野生群體的遺傳多樣性,Ne為1.328—1.341,Ho為0.190—0.253,He為0.273—0.320; Dong等[30]的利用高分辨率溶解曲線法(High-resolution melting, HRM)分析了海參野生群體的遺傳多樣性,Ho為0.2664—0.2760,He為0.3188—0.3280?？O蟶群體的雜合度值高于大黃魚和海參, 因此, 我們推測5個縊蟶群體的遺傳多樣性處于較高水平, 具有較高的遺傳變異潛力。與樂清群體、云霄群體、湛江群體和欽州群體等4個群體相比, 東營群體的遺傳參數(shù)值更大, 表明其遺傳多樣性更高。遺傳多樣性降低, 對經(jīng)濟性狀, 如存活率、生長率和疾病耐受性等可能產(chǎn)生不利的影響,而更高水平的遺傳多樣性, 更加廣泛的變異, 有利于生物群體適應(yīng)環(huán)境的變化, 維持長期的生存, 因此, 有必要使用分子標(biāo)記評估和監(jiān)控縊蟶群體的遺傳多樣性。

Niu等[31]利用SSR標(biāo)記分析縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu),Ho為0.737—0.909,He為0.836—0.882; 劉達博等[32]同樣采用SSR分析了樂清灣和三沙灣縊蟶群體遺傳多樣性, 其He分別為0.872—0.909和0.846—0.894, 均高于本研究的縊蟶群體的Ho和He值。在變異度豐富的群體中, 每個微衛(wèi)星位點可以有更多數(shù)量的基因型, 而每個SNP位點最多只有3種基因型, 因此, 在群體遺傳學(xué)研究中需要使用更多數(shù)量的SNP位點。但是, 對于SNP標(biāo)記來說, 由于其等位基因數(shù)量少, 使得分型快速, 錯誤率更低, 并且SNP作為基因組中最豐富的變異的特征增加了其多態(tài)性[33]。

3.2 縊蟶群體遺傳分化

Wright[34]建議群體間遺傳分化Fst值在0—0.05,表明群體間遺傳分化很小, 可以不考慮;Fst值在0.05—0.15, 為中等程度分化;Fst值在0.15—0.25, 為較大程度分化;Fst值在0.25以上, 則群體間有很大的遺傳分化。樂清群體和云霄群體、樂清群體和欽州群體、云霄群體和欽州群體、湛江群體和欽州群體之間Fst值為–0.0061—0.0446, 遺傳分化很小, 其余兩兩群體之間為中等程度分化。AMOVA分析結(jié)果顯示90%以上的遺傳變異來自群體內(nèi), 也說明了群體間沒有明顯的遺傳分化。Thorp[35]認為獨立群體間的Nei’s遺傳距離在0.030—0.200。樂清群體和云霄群體、樂清群體和欽州群體, 云霄群體和欽州群體, 湛江群體和欽州群體之間的Nei’s遺傳距離都小于0.030, 說明這幾個群體兩兩之間不是完全獨立的群體。利用STRUCTURE軟件對縊蟶200個個體進行群體結(jié)構(gòu)分析,K值變化曲線結(jié)果表明縊蟶200個個體可以劃分為5個聚類簇。每個群體的40個個體在5個聚類簇中都有分布, 分布數(shù)量在3至16個, 分布比例均沒有超過0.75, 即每個群體沒有顯著的聚集到某一個聚類簇中, 說明每個群體不同個體之間存在較大的遺傳差異。5個群體在同一聚類簇中的分布比例都相似。這兩點與AMOVA分析得出的結(jié)果一致, 即遺傳變異主要存在與群體內(nèi)。

配子和幼蟲擴散是海洋底棲無脊椎動物在自然條件下發(fā)生基因流的主要原因[36]。樂清群體和云霄群體這2個采樣地之間直線相距約為588 km,縊蟶幼蟲在變態(tài)附著前, 平均浮游期為4—7d, 不足以達到有效的擴散。縊蟶欽州群體與湛江群體在地理位置上比較近(直線距離約220 km), 而雷州半島卻將兩個地區(qū)分隔開, 且雷州半島對海流有阻隔作用, 因此自然水流不大可能是浮游幼蟲擴散的原因。另一方面不同的氣候?qū)е铝瞬煌姆敝硶r間,廣東和廣西縊蟶的性腺成熟時間較早, 主要集中在8月初; 越往北, 性成熟時間越晚, 浙江通常在10月初。這也使得不同地區(qū)的縊蟶群體之間存在生殖隔離和有限的基因流。

樂清群體和云霄群體、欽州群體和其余4個群體間的Fst值和Nei’s遺傳距離揭示出這幾個群體之間違反距離隔離模型, 存在非典型模式?？O蟶養(yǎng)殖過去主要集中在浙江和福建一帶, 浙江育苗企業(yè)從福建采購親貝進行人工育苗, 在苗種繁育過程中,有限的親本數(shù)量降低了有效群體大小, 培育的苗種又銷往福建; 同時, 浙江也從福建采購苗種進行中培和養(yǎng)殖。自2012年以來, 浙江和福建等地育苗企業(yè)為了提早出苗, 每年8—9月從廣西等地采購親貝進行人工繁殖, 培育出的苗種一部分在本地進行中培和養(yǎng)殖, 其余大部分銷往遼寧、天津、山東、福建、廣東和廣西等地。因此, 本研究中縊蟶群體的苗種來源雖為當(dāng)?shù)刈匀幻绶N, 但是由于頻繁的引種,苗種的遷移, 人工培育苗種與當(dāng)?shù)刈匀幻绶N存在基因交流, 可能對縊蟶基因型的產(chǎn)生了影響, 干擾和混雜了縊蟶當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源, 這可能是導(dǎo)致縊蟶樂清群體和云霄群體, 欽州群體和其他群體基因交流頻繁的, 群體內(nèi)遺傳變異大, 群體間遺傳分化不高的主要原因。在縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化研究中, 我們發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果, 劉博等[27]對縊蟶4個養(yǎng)殖群體進行聚類分析, 發(fā)現(xiàn)遺傳距離和地理距離并未表現(xiàn)出正相關(guān), 認為這可能與縊蟶無序移養(yǎng)有關(guān)。Niu等[30]對沿海10個群體SSR分析中, 發(fā)現(xiàn)縊蟶北方群體(青島和海陽)和南方群體(寧波、臺州、寧德和漳州)聚為一支, 推測原因是由于北方引入浙江和福建的苗種, 導(dǎo)致南北群體間存在基因流。

3.3 縊蟶種質(zhì)資源的保護與開發(fā)

本研究采用15個多態(tài)性SNP標(biāo)記研究縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)縊蟶5個群體遺傳多樣性豐富, 而群體間遺傳分化程度不高, 地理群體之間違反距離隔離模型。在縊蟶群體遺傳學(xué)已有的研究中, 我們發(fā)現(xiàn)在2012年之前的研究中, 如Wang等[10]采用AFLP標(biāo)記研究遼寧至廣西6個縊蟶群體的遺傳結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)群體遺傳多樣性高, UPGMA聚類分析結(jié)果顯示群體間遺傳距離與地理距離符合。而在2012年之后的研究中, 如Niu等[30]采用8個微衛(wèi)星標(biāo)記分析中國南北沿海10個縊蟶群體的遺傳分化, 劉博等[27]采用12個微衛(wèi)星標(biāo)記分析縊蟶4個養(yǎng)殖群體的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 都發(fā)現(xiàn)南北方群體之間存在基因交流, 主要的遺傳變異來自群體內(nèi), 這與2012年之后, 浙江和福建等地出現(xiàn)親貝引種和苗種移養(yǎng)現(xiàn)象有極大關(guān)系, 人為干擾可能是導(dǎo)致這種情況出現(xiàn)的主要原因?？O蟶是我國主要養(yǎng)殖灘涂貝類之一, 加強當(dāng)?shù)乜O蟶種質(zhì)資源保護, 一方面, 可以建立原、良種場和自然保護區(qū); 另一方面, 在育苗和養(yǎng)殖方面, 要合理有序的引種, 減少或防止與當(dāng)?shù)厝后w混雜。